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通过基因突变Keap1适度激活Nrf2对小鼠骨量具有性别特异性影响

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发表时间:2020-01-16 10:34作者:武汉新启迪Xinqidibio来源:www.qidibio.com

通过基因突变Keap1适度激活Nrf2对小鼠骨量具有性别特异性影响

Keap1是其活性转录因子Nrf2的负控制器。Keap1 / Nrf2信号通路被认为是细胞保护性基因的主要调节物,并且存在于许多类型的细胞中,包括成骨细胞和破骨细胞。我们先前的研究显示Nrf2缺失减少了骨形成。最近的研究表明,Nrf2过度活化会导致Keap1 -/-小鼠骨质减少,而Keap1 -/-成骨细胞的增殖潜能明显低于Keap1 +/-成骨细胞。我们旨在研究通过破坏Keap1而适度激活Nrf2是否会影响骨骼代谢。我们与Keap1野生型(WT)小鼠相比,检查了Keap1杂合小鼠(Ht)的骨表型。与野生型对照相比,Keap1的缺失或敲除增强了培养的原代成骨细胞中Nrf2,ALP和wnt5a的基因表达。在雄性小鼠中,与年龄相匹配的同窝白蚁WT对照相比,Keap1 Ht小鼠的骨形成率显着增加(+ 30.7%,P  = 0.0029),但没有改变极限力(P <0.01)。雄性小鼠中Keap1缺乏显着降低了破骨细胞的数量(-32.45%,P = 0.01)和表面(-32.58%,P = 0.03)。与雄性WT小鼠相比,Keap1 Ht雄性小鼠的血清骨吸收标记物显着降低。我们的数据表明,通过调节Keap1的适度Nrf2激活,可以通过调节雄性小鼠的骨骼重塑来改善骨骼质量。

介绍

我们最近的研究表明,抗氧化因子可能在骨骼形成中发挥积极作用1但是,目前尚不清楚抗氧化剂是否以及如何影响骨骼发育和骨骼稳态。像Kelch一样的ECH相关蛋白1(Keap1)/核因子红系2相关因子2(Nrf2)蛋白轴在调节细胞保护酶2中起重要作用Keap1通过抑制Nrf2的核易位,细胞质遍在蛋白化和Nrf2 3的降解来负调控Nrf2依赖性细胞保护酶的转录Nrf2被隔离在细胞质中直到被激活,然后作为细胞保护性基因的调节剂来抵抗氧化和化学损伤4Nrf2转录控制许多细胞保护酶的基因表达,例如血红素加氧酶-1(HO-1)2,NAD-(P)H:醌还原酶(NQO1)5,γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)6和葡萄糖- 6-磷酸脱氢酶7

据报道,活性氧(ROS)作为细胞内信号分子调节破骨细胞分化,而Keap1 / Nrf2轴通过调节细胞内ROS信号传导在破骨细胞分化中起作用8更研究揭示的Nrf2的该缺失减少骨骼的机械性能19,减小负载驱动的骨形成1,妨碍骨折愈合在小鼠10,诱导氧化应激和促进RANKL诱导的破骨细胞分化11因此,Nrf2被认为在调节骨细胞中的骨稳态中起着重要作用12最近,有两个日本实验室已经检测Keap1的在骨骼发育和骨稳态中的作用1314由于Keap1 -/-小鼠由于食管和前胃畸形严重角化过度而在出生后3周内死亡15,一个实验室检查了新生的Keap1 -/-小鼠,发现距骨和跟骨的骨形成部分受阻13由于Keap1 -/-小鼠的幼年死亡是由于食道阻塞和饥饿15引起的,因此另一家实验室通过将Flox的Nrf2小鼠,角蛋白5驱动的Cre小鼠和Keap1 -/-杂交,从而形成了一个可行的模型。小鼠在其中鳞状上皮特异性的Nrf2缺乏全身Keap1的缺失的情况下1416这些独特的小鼠(Keap1 -/- ; Nrf2 Flox / Flox ; Keratin5-Cre)表现出肾病性尿崩症16的并发症,尽管破骨细胞数量和骨吸收均比对照组小鼠小,但与对照小鼠相比,其骨尺寸较小,骨密度较低。明显抑制14这些数据表明Nrf2的过度激活明显抑制了Keap1 -/-小鼠的骨形成但是,本文还证明了Keap1 +/-成骨细胞比Keap1 -/-具有更大的分化潜能成骨细胞通过碱性磷酸酶染色14因此,我们决定检查Keap1 +/-小鼠中的Nrf2激活是否刺激骨形成。

在这项研究中,我们假设适度的Nrf2活化可改善Keap1 +/-小鼠的骨量和强度为了研究该假设,使用来自Keap1敲除和敲除小鼠的体内小鼠模型和体外细胞培养系统。

材料和方法

实验动物

这项研究中执行的所有程序均符合印第安纳大学动物护理和使用委员会指南,并得到了印第安纳大学普渡大学印第安纳波利斯理工学院动物护理和使用委员会的批准。

具有混合遗传背景的C57BL6 / 129P2的Keap1 +/-小鼠购自日本RIKEN生物资源中心(RBRC01388)。由于没有Keap1基因的小鼠(Keap1 -/-小鼠)在断奶前死于食管和胃中的过度角化病,导致上消化道15阻塞,因此将Keap1 +/-小鼠用于这些动物实验。雄性Keap1 + / +小鼠(WT,n = 11),雄性Keap1 +/-小鼠(Ht,n = 12),雌性Keap1 + / +小鼠(WT,n = 14)和雌性Keap1 +/-小鼠(Ht,n = 13)用于研究。将小鼠圈养在22±1°C的塑料笼中,光照时间为12小时/黑暗时间为12小时,从6:00 AM到6:00 PM。在整个喂养期间随意提供标准的啮齿动物食物和水。腹膜内注射钙黄绿素(30 mg / kg体重; Sigma)和茜素(50 mg / kg体重; Sigma),然后在18周龄处死小鼠前10天和4天。两种基因型的左股骨均用于确定骨大小,骨结构和力学性能。将右股骨远端切开并用于测量骨形成和吸收,并切开中轴部分以观察骨形成。

基因分型

为了对Keap1 + / +,Keap1 +/-和Keap1 + / +小鼠进行基因分型,切下1毫米的小鼠尾巴,然后放入尾巴裂解缓冲液(50 Mm Tris PH8.0 + 50 mM KCl + 2.5 mM EDTA + 4% NP-40 + 0.045%Tween-20(含2%蛋白酶K)在56°C水浴中过夜,然后在95°C干浴中放置10分钟,然后添加100 mL水。REDTaq ReadyMix TMPCR反应混合物用于PCR。PCR条件为:在94°C变性30 s,在55°C退火30 s,在68°C延伸30 s。PCR进行了40个循环,包括初始变性步骤(94°C,1分钟)和最终延伸步骤(68°C,5分钟),然后最终保持在4°C。随后在带有SYBR DNA染色剂的琼脂糖凝胶上分离PCR产物并拍照。用于基因分型的引物序列:使用Keap1-d132(5'-CGGGATCCCCATGGAAAGGCTTATTG-3'),Keap1-TVneo(5'-TCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCC-3')和Keap1-intR(5'-CAGTTTTCCTCCAGCCTGTC-3')。WT在350 bp处显示一个标记,KO在500 bp处显示,Ht在350和500 bp处显示双标记(图   1A)。

图1
图1

Keap1 + / +(WT),Keap1 +/-(Ht)和Keap1 -/-(KO)小鼠和颅骨成骨细胞的基因型和基因表达A)Keap1 WT,Ht和KO小鼠基因型的凝胶电泳。B)使用实时PCR(n = 3)分析Keap1 WT,Ht和KO颅骨成骨细胞中Nrf2,ALP和wnt5a的mRNA水平。数据分析采用单因素方差分析,然后进行t检验。请注意:与WT成骨细胞相比,*** P <0.001。

组织形态计量学

Histomorphometry was carried out as described previously1,17,18,19. Bone specimens from mice were immersed in 10% neutral buffered formalin for 48 h. The specimens were then dehydrated in graded alcohols and methyl methacrylate, then embedded in methyl methacrylate with 4% of dibutyl phthalate and 0.25~0.8% of Perkadox × 163. Using a diamond-embedded wire saw (Histo-saw; Delaware Diamond Knives, Wilmington, DE), transverse thick sections (50 μm) were cut at the ulna and femur midshafts, ground to a final thickness of 20~30 μm, and mounted on microscope slides. Three sections per limb were used for bone histomorphometry with a Nikon Optiphot fluorescence microscope (Nikon, Inc., Garden City, NJ) using a Bioquant digitizing system (R&M Biometrics, Nashville, TN). The following primary data were collected from the periosteal surface at 250 × magnification: total perimeter (B.Pm); single label perimeter (sL.Pm); double label perimeter (dL.Pm); and double label area (dL.Ar). From these primary data, the following quantities were derived: mineralizing surface (MS/BS = [1/2sL.Pm + dL.Pm]/B.Pm × 100; %); mineral apposition rate (MAR = dL.Ar/dL.Pm/6 days; μm/day); and bone formation rate (BFR/BS = MAR × MS/BS × 3.65; μm3/μm2 per year).

使用切片机(Leica,德国)从股骨远端切下5微米厚的额叶。对于每组来自股骨的骨切片,将两个未染色的切片固定在显微镜载玻片上,而其他切片则用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色以鉴定活性破骨细胞。以下主要数据来自干phy端区域,生长板远端0.5 mm,距皮质内表面0.5 mm,放大倍数为250×:组织面积(T.Ar),小梁骨面积(tB.Ar),小梁骨周长(tB.Pm),单标签周长(sL.Pm),双标签周长(dL.Pm),双标签面积(dL.Ar),破骨细胞表面(Oc.S)和破骨细胞数(Oc.N )。从这些主要数据中得出以下数量:骨骼体积(BV / TV = tB.Ar/T.Ar×100;%),3个/μm 2每年)破骨细胞表面(Oc.S / BS = Oc.S / B.Pm的,百分比;%),和每毫米破骨细胞数(Oc.N / BS = Oc.N / B.Pm; #/ mm)。

微型计算机断层扫描(μCT)分析

的μCT扫描和分析进行了如前所述的1171819使用micro-CT(μCT)(SkyScan 1172,Bruker-microCT,比利时肯蒂克)扫描左股骨,然后使用SkyScan NRecon软件(Bruker-microCT,比利时Kontich)重建成单个横截面切片。然后将骨骼X射线轮廓图像重建为三维(3D)结构,并准备进行SkyScan CT分析仪(CTAn)(Bruker-microCT,比利时Kontich)的软件分析。分析了位于生长平台上方1毫米的1毫米小梁骨。在二值图像处理中,直方图的索引轴设置为50(所选阈值)。根据3D分析的基本值和结果,报告了骨体积/组织体积(BV / TV),小梁骨厚度(Tb.Th),小梁骨数(Tb.N)和小梁骨分离(Tb.Sp)。

为了评估Keap1组合对皮骨的影响,分析了中轴股骨的横截面几何特性。股骨中轴位置由股骨近端至远端的半长位置确定。然后使用SkyScan软件CTAn和印第安纳大学普渡大学印第安纳波利斯分校的Joseph Wallace教授编写的MATLAB脚本,对每个骨骼的7个中轴中段(前3个中段+ 1个中轴前的段+ 3个后段)进行骨几何特性分析。生物医学工程系。为了测量几何特性,使用先前定义的方法将每个部分阈值化为骨骼和非骨骼体素19以前曾报道过股骨干中段的几何特性:横截面积,皮质区域,骨髓区域,平均皮质厚度,前后(AP)宽度,内侧-外侧(ML)宽度,AP与ML之比,皮质区域占总面积的百分比,以及骨膜周长。

机械测试

机械测试如以前所述进行1171819按照先前公布的方案,分别通过三点弯曲和加压测试从18周龄小鼠获得的左股骨20简而言之,将骨骼在盐水浴中缓慢地升至室温(约2小时),并使用伺服液压测试系统(Test Resources)以10 Hz的力对位移数据以2 mm / min的速度加载至破坏。股骨沿前后方向加载至失败,上接触区位于中骨干(总骨长的50%),并且两个底部接触点位于该点周围,相隔8 mm。使用标准定义根据载荷变形曲线确定结构力学性能,确定的极限力(FU; N),刚度(S; N / mm)和破坏功(U; mJ)。请注意,FU代表骨骼的强度,而U代表断裂骨骼所需的能量。

原代细胞培养

通过胶原酶和胰蛋白酶20的顺序消化,从1〜2日龄的Keap1 +/-(Ht)小鼠,Keap1 -/-(KO)小鼠和同窝对照的颅骨中分离出原代成骨细胞在含有10%胎牛血清(FBS; Atlanta Biologicals,Norcross,GA),100 U / ml青霉素G的α-基本培养基(α-MEM; Sigma,St.Louis,MO,USA)中培养颅骨细胞并继代培养(Sigma)和100μg/ ml链霉素(Sigma)。将细胞维持在37 %的95%空气/ 5%CO 2湿润培养箱中,每72小时传代培养一次。

RNA分离,逆转录和实时PCR

使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取培养的颅盖骨成骨细胞的总RNA。使用大约50 ng的总RNA,使用SuperScript III First-Strand Synthesis系统试剂盒(Invitrogen)进行反转录。使用FastStart Universal SYBR green PCR master kit(Roche)进行实时定量PCR。PCR引物为Nrf2(正向5'-TCTCCTCGCTGGAAAAAGAA-3';反向5'-AATGTGCTGGCTGTGCTTTA-3'),碱性磷酸酶(ALP,正向5'-GCTGATCATTCCCACGTTTT-3';反向5'-CTGGGCCTGGTAGTTGTTGT-3'),Wnt5a(正向5'-GTGGTCGCTAGGTATGAATAA-3';反向5'-CGCGTATGTGAAGGCCGTC-3')和GAPDH(正向5'-ACTCCACTCACGGCAAATTC-3';反向5'-TCTCCATGGTGGTGAAGACA-3')21,其中GAPDH用于内部控制。使用δCT方法解释PCR结果。

新生雄性小鼠的骨骼染色

麻醉新生小鼠,并去除其皮肤和内脏。一侧的前肢和后肢进行基因分型。将小鼠固定在95%的乙醇中,然后浸泡在丙酮中以去除脂质。然后,将小鼠移入染色溶液(100%乙醇80 mL + 0.3%Alcian Blue 8GX(溶于70%乙醇)10 mL + 0.3%Alizalin Red(溶于dH 2 O)2 mL +乙酸10 mL )的3天。用95%乙醇洗涤后,每天将小鼠浸泡在1%KOH中,直到清洁肌肉。最终将小鼠骨骼储存在8份甘油和2份1%KOH中。

I型胶原蛋白的血清C端端肽(CTX)

使用市售的ELISA试剂盒(RatLaps,IDS Inc.)测量吸收标记CTX的血清浓度。从下颌后静脉收集血样,在室温下凝结30分钟,以13,000 rpm离心分离血清,并在-80°C冷冻。来自两个基因型组的18周龄小鼠的解冻的血清样品按照制造商的指示一式三份测定CTX。

统计分析

使用JMP(版本14,SAS Institute Inc.)计算统计分析。每个实验中带有动物编号的统计细节可在图例中找到。统计学显着性取p <0.05。数据表示为平均值±SEM。

结果

Nrf2在Keap1 +/-和Keap1 -/-成骨细胞中的表达

我们使用Keap1 WT,Ht和KO小鼠的原发颅盖骨成骨细胞检查了Nrf2,ALP和WNT5a mRNA(图   1B)。实时PCR分析表明,Keap1 Ht和KO颅骨成骨细胞中Nrf2 mRNA的水平显着高于Keap1 WT成骨细胞。Keap1 Ht和KO成骨细胞中的ALP和wnt5a mRNA表达也明显高于野生型对照。

Keap1缺乏会增加Keap1 +/-小鼠的骨量

敲除Keap1不会影响小鼠股骨的长度(WT vs.Ht:男性:15.96±0.45 vs. 15.91±0.33,P  = 0.7449;女性:16.09±0.35 vs. 16.11±0.32,P  = 0.8459)或体重( WT vs.Ht:男性:28.37±1.61,相对于27.58±1.54,P  = 0.2472;女性:23.55±1.55,相对于23.76±1.38,P  = 0.7211,图   2)。

图2
图2

Keap1 WT和Ht小鼠的骨体积和结构。在雄性或雌性小鼠中,WT和Ht之间的体重或股骨长度没有差异。A)雄性野生型(WT),(B)雄性Keap1杂合子(Ht),(C)雌性野生型(WT)和(D股骨远端小梁骨的微CT图像重建)雌性Keap1杂合(Ht)小鼠。测定骨体积/组织体积(BV / TV),厚度(Tb.Th),骨小梁数(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。结果显示,雄性Keap1-Ht小鼠的BV / TV,Tb.N和Tb.Sp与雄性WT小鼠相比有显着差异。使用双向分析方差分析以Keap1基因型和性别为主要作用对数据进行测试。每张图顶部的条表示主要作用和相互作用的重要性(#= Keap1基因型p <0.05; @ =性别p <0.05; $ =相互作用p <0.05)。当至少一项有意义时,进行t检验,相对于男性WT而言,* p <0.01。n = 10-14 /组。

μCT分析表明,在雄性Keap1 Ht小鼠中,远侧股骨的小梁骨体积比其WT对照显着增加(BV / TV,+ 31.72%,P  = 0.008,图   2)。尽管骨小梁的厚度(Tb.Th,+ 0.77%,P  = 0.7707)没有变化,但骨小梁的数量(Tb.N,+ 30.7%,P  = 0.003)和小梁的分离度(Tb.Tb)有显着差异。 Sp,-13.21%,P = 0.0027)与同窝对照相比。但是雌性Keap1 Ht和WT小鼠之间的BV / TV没有统计学差异。Keap1 Ht小鼠股骨远端小梁的骨形成参数(MS / BS,MAR和BFR / BS)与WT对照小鼠相比,在雄性或雌性中均无差异(P  > 0.05,图   3)。

图3
图3

A)雄性野生型(WT),(B)雄性Keap1杂合子(Ht),(C)雌性野生型(WT)和(D)雌性Keap1 在股骨远端的小梁骨上带有荧光标记(钙黄绿素和茜素)杂合(Ht)小鼠,表示矿化表面(MS / BS),矿物质附着率(MAR)和骨形成率(BFR / BS)。小梁骨中的WT和Ht小鼠之间的MS / BS,MAR和BFR没有差异。使用Keap1基因型和性别为主要作用的双向方差分析测试数据。

股骨中轴皮质骨的分析显示, 男性Keap1 +在骨膜表面的MAR和BFR(Ps.MAR,+ 68.64%,P = 0.0084; Ps.BFR / BS,+ 107.87%,P = 0.0358)/ -小鼠比男性对照(图显著更大   4)。在皮质内表面,雄性Keap1 +/-和WT小鼠之间的骨形成率没有显着差异在雌性Keap1 Ht和WT小鼠之间,骨形成率没有显着差异。

图4
图4

A)雄性野生型(WT),(B)雄性Keap1杂合子(Ht),(C)雌性野生型(WT)和(D)的股骨中轴皮质骨带有荧光标记(钙黄绿素和茜素))雌性Keap1杂合(Ht)小鼠,表明矿化表面(MS / BS),矿物质附着率(MAR)和骨形成率(BFR / BS)。雄性Keap1-Ht小鼠的皮质骨形成显着增加。使用双向分析方差分析以Keap1基因型和性别为主要作用对数据进行测试。每张图顶部的条表示主要作用和相互作用的重要性(#= Keap1基因型p <0.05; @ =性别p <0.05; $ =相互作用p <0.05)。当至少一项有意义时,进行t检验,与雄性WT小鼠相比,** p <0.05和** p <0.01。n = 9-14 /组。注意蓝色箭头:骨膜表面(Ps);黄色箭头:皮质内表面(Ec)。

Keap1缺乏会降低Keap1 +/-小鼠的破骨细胞数量和小梁骨活性

耐酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)对股骨远端的小梁骨染色。破骨细胞被染成紫红色。测量骨表面上的破骨细胞数(N.Oc / B.Pm)和破骨细胞的表面数(Oc.S / BS)。在雄性Keap1 Ht小鼠中, 与野生型对照相比,N.Oc / B.Pm(-32.45%,P  = 0.0111)和Oc.S / BS(-32.58%,P = 0.0263)均显着降低(图。   5)。女性Keap1 Ht组和WT组之间的破骨细胞数量没有差异。

图5
图5

A)雄性野生型(WT),(B)雄性Keap1杂合子(Ht),(C)雌性野生型(WT)和(D)雌性Keap1杂合(Ht)小鼠,表明破骨细胞表面(Oc.S / BS)和破骨细胞数(N.Oc / B.Pm)。与野生型小鼠相比,雄性Keap1-Ht小鼠的破骨细胞数量和表面明显减少。雄性Keap1 Ht小鼠的血清CTX显着低于雄性WT小鼠。使用双向分析方差分析以Keap1基因型和性别为主要作用对数据进行测试。每张图顶部的条表示主要作用和相互作用的重要性(#= Keap1基因型p <0.05; @ =性别p <0.05; $ =相互作用p <0.05)。当至少一项有意义时,进行t检验,相对于雄性WT小鼠,* p <0.05。对于Oc.S / BS和N.Oc / B.Pm,n = 10-14 /组。对于CTX,n = 10-13 /组。

Keap1 +/-小鼠的骨吸收标记物CTX降低

 与同窝对照相比,雄性Keap1 +/-小鼠的血清CTX显着降低(−16.60%,P = 0.0265),表明雄性Keap1 +/-小鼠的骨吸收降低。雌性HT和WT小鼠之间的血清CTX没有统计学差异(图   5)。

缺乏Keap1不会影响股骨的生物力学性能

通过三点弯曲试验评估Keap1 +/-股骨的机械性能报告了股骨中轴的极限力,破坏能量和刚度。结果表明,缺少Keap1不会改变雄性或雌性小鼠的股骨骨强度(图   6)。

图6
图6

力学性能和股骨皮质几何进行了分析。为了评估Keap1 +/-小鼠的骨骼机械性能,对股骨进行了三点弯曲测试。Keap1 WT和Ht小鼠之间的极限力,刚度和破坏能量没有差异。在雄性和雌性小鼠中,WT和Keap1 +/-小鼠之间的总横截面积(T.Ar)和皮质骨面积(Ct.B.Ar)之间没有差异使用Keap1基因型和性别为主要作用的双向方差分析测试数据。n = 11–14 /组。

新生儿Keap1敲除和敲除小鼠显示出快速的骨矿化

仅新生雄性小鼠被染色以检查骨骼发育。软骨被染成蓝色,而骨头被染成紫色。与同窝对照相比,Keap1 Ht和Keap1 KO小鼠的四肢骨矿化程度更高(图   7),这表明Keap1缺乏会加速骨骼矿化。

图7
图7

与野生型WT小鼠相比,Keap1缺陷型小鼠在雄性Keap1 +/-小鼠中表现出增加的骨矿化新生幼犬用阿尔辛蓝/茜素红染色。骨染成红色,软骨染成蓝色。检测到神经颅,四肢和脊柱。与野生型对照相比,Keap1杂合子和基因敲除新生小鼠的四肢显示出手指和脚趾的骨骼矿化加快(黑色箭头)。

讨论区

当前的研究表明,缺乏Keap1会增强Nrf2的表达,并导致成年雄性小鼠的骨量更高。Keap1缺乏会抑制破骨细胞的数量和小梁骨区域的活性,并增加股骨中轴的骨形成。结果表明,Keap1 / Nrf2信号传导在骨骼建模和重塑中起重要作用。

通过破坏Keap1激活Nrf2负调节破骨细胞生成和骨吸收。与先前的研究一致81314,我们目前的研究表明Keap1的不足导致了在股骨远端破骨细胞的细胞数和表面,这表明在Keap1的减少的骨重吸收的减少+/-小鼠。Keap1 Ht小鼠的血清CTX水平也低于野生型小鼠,进一步表明缺乏Keap1会全身性地降低骨吸收。通过破坏Keap1激活Nrf2抑制ROS积累并下调NRATc1,随后降低破骨细胞的分化和活性13我们先前的研究表明,Nrf2缺失导致更高的骨吸收,这由破骨细胞数量增加和RANKL 1的较高表达所证明所有这些数据表明Keap1 / Nrf2信号通路调节骨吸收。

与野生型对照相比,Keap1 Ht小鼠股骨中轴的MAR和骨形成率更高,证明了Keap1敲低增加了骨形成。较大的MAR表明Keap1 Ht小鼠的成骨细胞活性更高。使用颅骨骨细胞进行的细胞培养研究进一步表明,Keap1 Ht成骨细胞中的ALP和Wnt5a mRNA高于野生型成骨细胞,表明Keap1缺乏会刺激成骨细胞分化。这些数据得到我们先前报道的结果的支持,这些结果表明Nrf2缺失减少了骨形成1总的来说,这些数据表明Keap1 / Nrf2信号传导在成骨细胞的分化和活性中起重要作用。

与WT对照相比,抑制雄性Keap1 +/-小鼠的骨吸收和增加骨形成导致更高的骨量这些数据与之前的两个报告不同,前两个报告显示Keap1 -/-小鼠与对照组相比具有不良的矿化作用和较低的骨量。使用相同的整个骨骼染色,我们的数据显示Keap1 -/-新生幼仔的骨骼矿化加速,而先前的研究表明矿化缺陷13此外,另一项研究使用了复杂的基因改造小鼠模型(Keap1 -/- ; Nrf2 Flox / Flox; 如前所述,证明了Kratin5-Cre与对照小鼠(雄性小鼠8-10周)相比,Nrf2的过度活化导致体型较小和骨密度较低14除食道和胃外,角蛋白5在胸腺,子宫,前列腺,乳腺等中表达22角蛋白5驱动的cre可能在某些内分泌腺体中导致Nrf2缺乏,这可能间接影响骨代谢。这些独特的小鼠还表现出肾病性尿崩症16的并发症,这使得难以解释低骨量表型。在细胞水平上,我们的数据显示Keap1 -/-成骨细胞具有比Keap1 +/-相似或更高的合成代谢qPCR数据证明了成骨细胞,而先前的研究表明Keap1 -/-成骨细胞的分化潜力明显低于Keap1 +/-成骨细胞14尽管在Keap1 -/-小鼠中Nrf2过度激活的影响尚有争议,但适度激活Nrf2会增强Keap1 +/-小鼠的骨量成骨细胞特异性Keap1缺陷小鼠可能有助于阐明Keap1 / Nrf2在骨骼形成中的作用差异。

我们以前的研究表明,Nrf2的组合降低了能量消耗,降低了股骨和腰椎椎体的衰竭力,极限力和刚度1,这意味着Nrf2可能在维持骨骼强度方面发挥了作用。然而,在本研究中,当敲除Keap1时,与野生型对照相比,股骨的骨强度没有增加。这些数据表明增强的Nrf2表达不会增加成年小鼠的骨强度。Keap1 / Nrf2信号通路是否可以帮助保持衰老小鼠的骨骼强度还有待进一步阐明。

与Nrf2的先前研究敲除(KO)小鼠已在Nrf2的KO小鼠的骨架表型示出两性异形192324女的Nrf2基因敲除小鼠始终显示低骨量多于女性野生型小鼠924但是,相对于雄性野生型小鼠,雄性的Nrf2 KO小鼠显示或高或低骨量12324在我们目前的研究中,通过破坏Keap1激活Nrf2还在Keap1 +/-小鼠的骨表型中表现出性二态性,雄性Keap1 +/-小鼠的骨质更高,但雌性Keap1 +/-没有-小鼠与特定性别的对照相比。通常,由于Nrf2缺乏或激活都会影响骨骼重塑,因此这些数据表明Keap1 / Nrf2信号传导在男性和女性骨骼组织中都起着至关重要的作用。但是,Nrf2激活和性类固醇受体下游信号之间的串扰需要进一步研究。

本研究存在局限性。因为使用了全球性的Keap1 +/-小鼠,所以很难排除Keap1调节的内分泌系统性因子对骨组织的影响。为了研究Keap1在不同细胞群体中的特定作用,研究破骨细胞和成骨细胞特异性Keap1基因敲除小鼠模型将提供更多关于Keap1 / Nrf2信号在骨代谢和机械性质中的作用的见解。此外,由于Keap1 / Nrf2信号通路激活了大多数的细胞保护基因,因此研究Keap1 / Nrf2信号在衰老小鼠的破骨细胞和成骨细胞中的作用将更有价值。

总之,Keap1的功能丧失突变增加了骨量,降低了骨吸收。Keap1在骨骼代谢中起关键作用,其对骨骼的影响具有性别特异性。

资料可用性

根据合理的要求,可以从相应的作者处获得支持该研究结果的数据。


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