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通过原位杂交链反应联合检测哺乳动物视网膜中的microRNA和mRNA

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发表时间:2020-01-16 10:33作者:武汉新启迪Xinqidibio来源:www.qidibio.com

通过原位杂交链反应联合检测哺乳动物视网膜中的microRNA和mRNA

基于杂交链反应(HCR),已经开发了用于组织中mRNA检测的改进的原位杂交方法。我们显示原位 HCR方法可用于检测小鼠视网膜组织切片中的microRNA。原位 HCR可以用于检测2个微RNA的同时或微RNA和mRNA的联合检测。此外,miRNA 原位HCR可以与蛋白质的免疫检测结合使用。我们使用这些方法来表征在小鼠视网膜中表达特定microRNA的细胞。我们发现miR-181a在发育过程中和成年视网膜中的无长突细胞中表达,并且它同时存在于GABA能和甘氨酸能的无长突细胞中。原位 HCR 检测microRNA 应有助于研究视网膜和其他组织中的microRNA功能和基因调控。

介绍

用于与单细胞分辨率分析和可视化基因表达的新方法是有利于基因的功能和开发的分析123microRNA(miRNA)是小的RNA(〜21–22个核苷酸:nt),可通过调节mRNA的稳定性或翻译来调控基因4在视网膜中,miRNA在发育过程中和在成人视网膜中都具有重要作用5但是,在单细胞水平分析miRNA表达仍然具有挑战性。我们67891011已经开发了原位用于检测细胞或组织中内源性miRNA的杂交方法(综述于12)。成熟miRNA的短长度限制了探针的大小和检测灵敏度。具有紧密相关序列的miRNA家族的存在也使miRNA检测的特异性复杂化,但是使用锁定核酸(LNA)探针7或高严格洗涤条件6可以区分相关miRNA。大多数miRNA的原位杂交研究已经基于荧光酶测定对扩增和检测,但检测方法比色酶分析依靠1011131415已经使用了 16个或放射性标记 17荧光检测允许使用荧光探针对mRNA 16或抗体 15进行组合检测

杂交链反应(HCR)是基于核酸的扩增系统18,其已被用于在多种测定中检测特定RNA或DNA序列。在HCR中,一对标记的亚稳态DNA发夹分子(扩增子)仅在存在特定DNA序列(引发剂)的情况下才会聚合。与一个或多个引发剂序列融合的DNA探针与靶分子杂交。随后与DNA发夹放大器一起孵育会导致聚合反应以及标记(通常是荧光染料)在探针结合位点的积累。HCR方法mRNA的原位(杂交原位 HCR)已经被开发用于细胞,组织或整个胚胎1920212223,并提供优于其他ISH方法。扩增/检测反应快速,可以在温和条件下进行,而具有不同引发剂的探针可以激活具有不同荧光标记的正交发夹放大器,从而可以简化并同时多重检测不同的mRNA。HCR已经用于对Northern印迹的检测miRNA的 24,在溶液 2526,以及最近在组织培养细胞 27,但HCR尚未施加到原位检测的miRNA表达细胞在组织中。

在这里,我们演示了通过原位 HCR 小鼠视网膜组织切片中检测内源性miRNA 我们表明,miRNA 原位 HCR可用于同时检测两种不同的miRNA,并且miRNA 原位 HCR可与原位结合HCR检测mRNA或通过免疫组织化学检测蛋白质。miRNA和mRNA或蛋白质的组合检测应有助于对miRNA基因调控和组织中表达miRNA的细胞进行研究。我们使用这些方法来检测发育中和成年期的各种视网膜miRNA。我们使用标记来表征表达miR-182,miR-124和miR-181a的视网膜细胞。我们显示,miR-181a在视网膜无长突细胞的至少两个亚群中表达。

结果

原位 HCR检测miRNA

对于HCR检测,将探针序列连接到一个或多个DNA引发剂序列,该序列可与用于检测的标记的亚稳态发夹扩增子相互作用。mRNA的原位由Pierce及其同事开发HCR方法使用36个核苷酸的序列引发剂1921由于miRNA靶标的长度将miRNA探针限制在约20 nt,我们希望连接相似长度的HCR引发剂序列,以最小化探针杂交和洗涤过程中引发剂序列的非特异性结合。我们最近将Sui 等人描述的HCR miRNA探针基于用于多重mRNA 原位 HCR 的系统23,它使用具有18 nt引发剂序列的探针,以及36 nt正交发夹放大器的组合。我们合成了DNA寡核苷酸探针,该探针包含与目标miRNA互补的20 nt序列,其侧翼是两个18 nt引发剂,由两个碱基接头连接(图   1a,补充表   S1)。miRNA探针杂交到从固定的小鼠视网膜,使用四甲基氯化铵(TMAC)用于序列特异性,然后在高严格洗涤制备组织切片,如我们先前已经描述了617使用36 nt标记为Cy3的发夹放大器通过HCR检测探针(补充图   S1,补充表   S2)。探针,用于两个不同的视网膜的miRNA,与miR-182和miR-183,其由相同的初级转录物产生的2829,在外核层(ONL)的光感受器的胞体和在位于电池产生主要细胞质的荧光信号内核层的外部(INL;图   1d–f,n)。miR-182和miR-183仅在探针互补序列内的三个位置不同(图   1a)。与在这三个位置的两个miRNA错配的探针几乎不产生信号,类似于对照探针,该探针仅包含两个通过4 nt接头连接的启动子,或者没有探针对照(图   1g–i)。通过miRNA 原位 HCR 检测到的miR-182和miR-183 的表达模式与用半抗原标记的RNA寡核苷酸探针原位杂交后通过碱性磷酸酶(AP)偶联的抗体检测到的表达模式基本相同(图   1b ,c),使用我们之前的方法6测试通过原位同时检测两个miRNA的方法HCR,我们合成了miR-182探针,该探针具有一对不同的启动子序列,与第二组用Cy5标记的发夹放大器兼容。将新的miR-182探针与miR-183探针同时杂交,并用两组发夹放大器同时检测这些探针。虽然在同一细胞内许多Cy3或Cy5信号的单独斑点是明显且不重叠的(图1o),所得的Cy3和Cy5荧光信号标记了相同的视网膜细胞(图   1j–m,o)。   检测每个miRNA探针的独立杂交事件。通过原位检测视网膜中的其他miRNAHCR产生不同的表达模式。Let-7f是一种广泛表达的miRNA,在大多数视网膜细胞中被检测到,但在外核层中信号较少(图   1p,q)。与此相反,的miR-126-3P中,miRNA中的血管内皮细胞中特异性表达3031根强标记视网膜血管,以及细胞的脉络膜(图   1R-U )。

图1
图1

通过原位 HCR 检测小鼠视网膜组织切片中的miRNA a)用于miRNA检测的HCR探针示意图(另见补充图   S1);未显示错配或miR-183探针的启动子序列。bc使用20 nt荧光素标记的RNA探针与miR-182或miR-183进行非HCR miRNA 原位杂交,并用碱性磷酸酶(AP)偶联的抗荧光素抗体(紫色)进行检测。d - f,N)miR-182或miR-183的miRNA 原位 HCR,(g)与miR-182和miR-183均错配3个的探针,(h)仅包含两个启动子序列的探针,或(i)未添加探针。jmo用两个不同的HCR放大器通过原位 HCR 联合检测miR-182和miR-183 no)由(ek)中的虚线矩形表示的区域扩大Let-7f或(ru)miR-126-3p的pq)miRNA 原位 HCR (Tû)miR-126-3p信号在Z堆栈(相同的视网膜切片)上的最大强度Z投影,显示了视网膜血管和脉络膜的标记。b–q)成人,(ru)P7视网膜。洋红色:Cy3,绿色:Cy 5,蓝色:细胞核中的DNA。比例尺:25 µm(dm);为10μm(Ñö)。

为了进一步测试miRNA 原位 HCR特异性,我们将miR-182探针与从小鼠中制备的成年视网膜切片杂交,该小鼠的编码miR-183 / 96/182初级转录本32的基因被纯合破坏或与野生型对照配对。miR-182荧光信号存在于野生型对照视网膜切片中,但突变视网膜切片中却不存在(图   2)。我们同时杂交和检测的探针的miR-124,神经元特异性的miRNA的丰富在大多数哺乳动物神经元中表达,包括视网膜神经元629来自野生型和突变型视网膜的切片中的miR-124信号相似(图   2)。),并在所有视网膜层中广泛表达。在野生型视网膜中具有miR-124信号的细胞与miR-182重叠,但是在不表达miR-182的内核层(INL)和神经节细胞层(GCL)中的其他细胞中也检测到miR-124。除细胞体中存在miR-182信号外,还在内部丛状层(IPL)中检测到重叠的miR-182和miR-124信号,这表明miR-182和miR-124定位于双极轴突和/或突触。在突变型视网膜中,IPL缺少miR-182信号(图   2b,c,h,i)。

图2
图2

在miR-183 / 96/182突变小鼠中废除了原位 HCR 对miR-182的检测来自成年野生型(af)或miR-183 / 96/182宿主基因被破坏的小鼠(gl)的视网膜切片与miR-182和miR-124探针杂交。ejkl)表示b,c,h,i区域的扩大。ad)箭头表示IPL中重叠的局部miR-124和miR-182表达;在IPL中,miR-183 / 96/182宿主基因被破坏的视网膜中IPR中检测到了miR-124表达,但缺少共定位的miR-182(gj)。洋红色:Cy3,绿色:Cy 5,蓝色:DNA。比例尺:25 µm(adgj);10 µm(efkl)。

结合miRNA和mRNA 原位 HCR鉴定miRNA表达细胞

通过原位 HCR 检测同一组织切片中miRNA和mRNA的能力将有助于miRNA表达细胞的鉴定和分析。首先将视网膜切片与一系列与特定mRNA互补的2–5个HCR探针(补充图S1,补充表   S3顺序杂交   ,然后再与具有不同启动子的miR-182或miR-124探针杂交。使用Cy3和Cy5标记的发夹放大器同时检测探针。我们将针对视紫红质(Rho)的探针与miR-182探针相结合,该视紫红质(Rho)仅在视杆感光细胞中表达。如预期的那样,杆状感光细胞中可以检测到miRNA和Rho mRNA(图   3a–e)的外核层(ONL)。在Rho mRNA阴性的INL细胞中也检测到miR-182。我们将miR-182探针与针对Pcp2的探针组杂交,该探针在杆状双极细胞和ON锥状双极细胞33中表达,并观察到在外部INL细胞中有重叠表达。Pcp2的探针标记了双极细胞体和投射到IPL的假定轴突(图   3f–j)。令人惊讶的是,尽管每个探针的信号点很少重叠,但miR-182探针通常似乎标记了相同的过程(图   3j)。我们还比较了在Müller神经胶质细胞34和miR-124中表达的Rlbp1的表达(图   3k–o)。INL中心区域的一小部分细胞对miR-124呈阴性,而这些细胞对Rlbp1呈阳性。这些观察结果表明了miR-124在视网膜神经元中特异性表达,而不是在米勒胶质细胞,与现有的观察一致3536

图3
图3

通过原位 HCR 联合检测miRNA和mRNA,用于细胞鉴定。a-e)miR-182表达与视杆中视紫红质(Rho)的表达重叠。fj)miR-182表达也与Pcp2(杆和ON锥双极细胞的标志物)重叠。ko)表达Rlbp1的Müller神经胶质细胞中不存在miR-124。ejo)显示b,g,l中指定区域的放大。洋红色:Cy3,绿色:Cy5,蓝色:DNA。比例尺:25 µm(adgik–m);10微米(ejk)。

发育中和成年小鼠视网膜中表达miR-181a的细胞的表征

据报道,miR-181a在小鼠视网膜37的INL和GCL中表达,但其表达模式尚未详细描述。我们成年或P7视网膜的INL和GCL中通过原位 HCR 检测到miR-181,位于INL内部的假定无长突细胞中信号最高,而在ONL中则没有信号(图   4a,b, e–h)。在成年视网膜中对miR-181a和miR-182的联合检测显示出不同的表达模式,在INL的双极细胞中低水平的miR-181a信号与miR-182之间存在重叠(图   4c,d)。AP2α(Tfap2a)是在大多数无长突细胞38中表达的转录因子在原位对于miR-181a的HCR,我们使用抗AP2α蛋白的抗体对P7小鼠视网膜的切片进行了间接免疫荧光处理(图   4e–g)。在INL和GCL中,AP2α蛋白的核表达与miR-181a信号最强的细胞重叠,表明miR-181a含量最高的视网膜细胞是无长突细胞或置换的无长突细胞。这些观察结果表明,可以将蛋白质的间接免疫荧光检测与通过原位 HCR 检测miRNA结合起来

图4
图4

表达miR-181a的视网膜细胞的表征。ab)miR-181a在成年小鼠视网膜的内部INL中高表达。cd)高水平的miR-181a和miR-182表达不重叠,尽管在INL中miR-181a的较低水平信号与miR-182重叠。eh原位 HCR 检测到miR-181a ,间接免疫荧光检测到P7视网膜切片中的无长突细胞特异性蛋白AP2α。miR-181a信号最强的细胞与AP2α重叠。il)AP2α蛋白和miR-181a的强表达在形成无长突蛋白层的E18.5处重叠,但在Ptf1a-/-视网膜中都丢失了,尽管miR-181a的低水平信号在GCL和INL中仍然存在。mn)联合检测GABA能的无长突细胞中miR-181a与Gad1 mRNA的关系。op)使用分裂启动子HCR探针对Slc6a9 mRNA 原位 HCR进行联合检测甘氨酸能长春碱细胞中的miR-181a和Slc6a9a mRNA mp的完整面板集显示在补充附图中。 S2S3青色星号表示n和p中重叠单元格的示例。品红; Cy3,绿色:Alexa-647(el)或Cy5(mn)或Alexa-488(op),蓝色:DNA。比例尺:25 µm(ap)。

原位 HCR检测miR-181a结合间接免疫荧光检测AP2α蛋白也被应用于杂合或纯合的E18.5小鼠的胚胎视网膜切片,用Cre 39代替Ptf1a转录因子编码区Ptf1a的两个等位基因的丢失阻止了视网膜40中几乎所有无长突和水平细胞的形成,并且还导致出生后不久死亡。来自Ptf1a杂合子胚胎的视网膜在成神经细胞层的内边缘和成神经细胞层中的一些分散细胞中具有强烈的miR-181a信号,与AP2α表达重叠(图   4i,j)。),可能是新生成的无长突细胞向内迁移。这些结果与胚胎一代最无长突神经元的一致4142相反,在Ptf1a无效的视网膜中既没有AP2α,也没有miR-181a的强信号(图   4k,1),与无长突细胞的丢失相一致。然而,Ptf1a无效视网膜的内层仍存在miR-181a的低水平信号,这与野生型视网膜INL和GCL中AP2α阴性的细胞中miR-181a的低水平信号一致。较晚的年龄(图   4b,h)。

我们将miR-181a 原位 HCR与通过原位 HCR 检测mRNA 结合起来,进一步表征表达miR-181a的无长突细胞。基于神经递质的使用,分子标记和/或形态学,已经鉴定出无长突神经元的多种亚型43在啮齿动物的视网膜中,无长突细胞的两个最丰富的子集使用GABA或甘氨酸作为神经递质。GABA能无长突细胞可通过GAD1 mRNA的表达来鉴定344我们通过组合的miR-181A的检测原位与检测GAD1 mRNA的HCR通过原位 HCR(图   4米中,n,补充图   S2)。Gad1 mRNA存在于INL的内部,在被miR-181a强烈标记的细胞子集中,表明miR-181a在GABA能的无长突细胞中表达。与分裂引发剂配对的探针的发展是mRNA 原位 HCR 19的最新改进结合在靶mRNA上相邻位置的两个25 nt探针各自贡献36 nt引发剂序列的一半,因此仅当两个探针紧密结合时,功能性引发剂才可用于HCR(补充图   S1)。使用双组分引发剂可减少背景,并允许使用针对目标mRNA的较大探针库(10个或更多探针对)。由于探针和半启动子序列的长度均与我们的miRNA相似原位 HCR探针,我们测试了该方法是否可以在相同的杂交和洗涤条件下与miRNA 原位杂交相结合我们同时杂交,并用11双分裂引发剂探针(补充表检测到的miR-181A探针组合   S4)为Slc6a9的mRNA,其编码甘氨酸转运-1,无长突甘氨酸细胞的标记345每对分裂引发剂探针中仅包含一个探针的探针池用作对照19使用72 nt发夹放大器检测mRNA探针,同时使用36 nt发夹放大器检测miR-181a。我们观察到miR-181a和Slc6a9 mRNA的信号之间存在明显的重叠,表明miR-181a在甘氨酸能高蛋白细胞中表达(图   4o,p和补充图   S3)。总而言之,这些结果表明miR-181a在视网膜无长突细胞的两个主要亚群中表达。

讨论区

我们的结果表明,原位 HCR可有效用于检测固定视网膜组织中的内源性miRNA。可以使用正交发夹放大器通过原位 HCR 同时检测至少两种不同的miRNA 此外,我们表明,miRNA 原位 HCR可与mRNA的原位 HCR检测或蛋白质的免疫荧光抗体检测相结合。应用原位 HCR到miRNA检测应促进表达特异性miRNA细胞的鉴定和表征。先前已使用miRNA和蛋白质检测相结合的方法,使用miRNA 原位鉴定视网膜中表达miRNA的细胞杂交与荧光酶检测方法和抗体检测蛋白15以及非神经组织14将miRNA检测与通过原位 HCR 检测mRNA相结合的能力为细胞鉴定和表征提供了更多选择。seqFISH 1或单细胞RNA-seq 等方法的最新发展图3允许对单个细胞中mRNA表达的广泛分析。但是,目前尚无法对成熟的miRNA表达进行seqFISH或单细胞测序分析。通过原位 HCR 比较miRNA和mRNA表达的能力应有助于填补这一空白。尽管尚未现场部署HCR先前,基于HCR方法已被用于miRNA检测在组织的miRNA的检测242546474849虽然我们专注于分析视网膜中的miRNA,但我们希望miRNA 原位 HCR方法应适用于其他组织,因为原位 HCR方法已用于检测多种组织和生物体中的mRNA。20

由检测到的miR-182和miR-183的视网膜表达模式原位 HCR是与现有的分析一致2832,以及与miRNA的原位基于使用荧光素标记的RNA探针和AP-偶联我们以前的方法的杂交抗荧光素抗体。组合的miRNA和mRNA 原位 HCR使我们能够轻松比较miR-182和miR-124表达与重叠或不同于miRNA表达细胞的细胞类型的mRNA标记。在视网膜神经细胞的miR-124的表达,而在血管的miR-126-3p的检测是与现有的报告一致6143036

的miR-181A调节无长突和神经节细胞生长过程中的鱼5051,但它并没有被很好地表征在哺乳动物视网膜。在小鼠视网膜中,我们发现miR-181a存在于小鼠视网膜的INL和GCL中,但在发育过程中一直存在于成年动物中,而ONL则不存在。miR-181a的最强信号是基于与转录因子AP2α重叠的视网膜无长突细胞,尽管在INL和GCL的其他细胞中也存在较低水平的信号。这些结果与先前报道的miR-181a 在原位杂交37在P7小鼠视网膜的INL和GCL中的表达一致,并且与在Medaka视网膜50中的 miR-181a表达相似。Ptf1a null小鼠的胚胎视网膜缺乏高水平的miR-181a信号,缺少无长突细胞40,但是较低水平的miR-181a信号保留在内部视网膜中,与其他细胞类型中较低水平的miR-181a表达一致。大多数的无长突细胞都使用GABA或甘氨酸作为神经递质,大多数GABA能的无长突细胞在出生前就已产生52由于我们观察到出生前开始在无长突细胞中普遍存在miR-181a表达,因此我们将miR-181a表达与成年视网膜中这两种无长突细胞亚群特异的mRNA标记进行了比较。高水平的miR-181a信号与甘氨酸和GABA能的无长突细胞的标志物重叠,表明miR-181a在这两种主要的无长突细胞中均表达。

结合我们将mRNA标记物检测与miRNA检测相结合的能力,有助于分析特定细胞类型中miRNA的表达,正如我们在此处针对视网膜所显示的,以及先前在大脑中使用不同方法报道的16另外,它应该允许miRNA与候选靶基因之间更精确的表达比较。在具有复杂细胞种群的组织中,确定miRNA和潜在靶标mRNA是否在相同或不同细胞亚群中表达可能具有挑战性。miRNA的原位 HCR与mRNA的结合原位 HCR可以解决重叠或不同的表达。原位分析miRNA表达杂交研究通常使用带有可见沉淀物的AP检测。尽管敏感且易于观察,但很难将可见的AP染色与其他检测mRNA或蛋白质的方法结合使用(例如,沉淀物会阻止荧光激发)。miRNA的原位与适合于联合检测荧光检测方法进行了说明,基于酶扩增101114151653,或专有核酸扩增和酶扩增(RNAscope的组合,其能够结合miRNA的检测与蛋白质或mRNA的1354)。但是,在用于双标记RNA检测的顺序酶促扩增过程中酶的失活可能需要苛刻的条件55,并且商用RNAscope试剂相对昂贵。使用miRNA 原位 HCR进行组合miRNA检测或与mRNA或蛋白质检测结合使用的能力应提供灵活的选择。

我们使用对于miRNA的条件原位 HCR收率是高度序列特异性617,产生从探针的低信号具有错配(图   1)。用于序列特异性miRNA探针的另一种方法已被掺入LNA碱基到探针9然而,不同的LNA探针常常需要相关的序列之间不同的杂交或洗涤温度,以判别111556原位 miRNAHCR方法对多个探针采用相同的杂交和洗涤温度,并且这些温度低于LNA探针通常使用的温度。较温和的杂交/洗涤和温和的HCR检测条件可能有助于将miRNA保留在组织切片中,而无需额外固定11,并且可能有助于保存蛋白质和mRNA。但是,蛋白酶K消化步骤可用于改善组织通行性,这可能会破坏或去除某些蛋白质抗原。而且,定制合成的未修饰的DNA寡核苷酸探针是广泛可得的,并且比RNA或LNA修饰的探针便宜,这应该促进HCR方法的使用。

最近,已描述了一种改进的用于mRNA的第三代HCR 原位检测方法19,其中成对探针在靶RNA相邻位置上的结合产生了一个复合启动子序列,该序列可以被HCR放大器发夹结合。使用成对的探针可以减少背景,从而改善mRNA检测的信噪比,因此可以使用更大的探针库来提高mRNA检测的灵敏度。我们发现通过分裂启动子原位 HCR方法检测mRNA 可以与miRNA 原位结合HCR采用单一方案,所有探针均同时杂交,清洗和检测。不幸的是,由于miRNA的长度不足以允许两个相邻的成对探针以足够的长度结合以保持特异性,因此采用分裂起始方法检测miRNA似乎不可行。但是,许多miRNA的每个细胞相对较高的丰度仍允许仅使用单个HCR探针检测低本底的miRNA,如下所示。对于低水平的miRNA,两轮HCR 57或附加的偶联酶促扩增(例如,通过针对HCR放大器上半抗原的抗体偶联物)可以改善检测。

材料和方法

HCR 原位探针和发夹放大器

DNA寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies(IDT);序列在补充表   S1 - S4中探针在使用前经过凝胶纯化。HCR DNA探针的长度为60 nt,包括在5'端的18 nt HCR引发剂,2 nt间隔子,与特定靶标miRNA互补的20 nt miRNA识别序列,2 nt间隔子和在3'端的第二个18 nt HCR引发剂。由于其较高的GC含量,miR-124探针仅包含19 nt miRNA识别序列。HCR 36 nt发夹式放大器经HPLC纯化。发夹H1和H2(Cy3)对应于23中的 “ OT的H1 / H2” HCR放大器,而发夹H3和H4(Cy5)对应于23中的 “ VP的H1 / H2”的HCR放大器用于原位分裂启动子mRNA为S16a9设计了HCR 19(11对探针的集合)。匹配的72 nt发夹放大器(带有Alexa-488标签21的 B3组)购自Molecular Technologies。

动物和组织准备

动物实验已获得密歇根大学动物保护与使用委员会的批准,并根据相关指南和法规进行。从CD-1小鼠(查尔斯河)中分离出野生型视网膜。Ptf1a突变小鼠39将Ptf1a编码区替换为Cre编码区。通过在室温下在2%多聚甲醛(PFA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中固定解剖的小鼠眼30分钟,然后在PBS中冲洗,在30%蔗糖中脱水并包埋在OCT中,来制备视网膜。在低温恒温器上切下14 µm切片,转移至Superfrost / plus显微镜载玻片上,并保存在-80°C下。对于图   4c,d,将视网膜在PBS中的2%PFA中固定75分钟。对于图   2从8周龄的miR-183 /一百八十二分之九十六敲除(的miR-183C视网膜GT / GT)或与年龄匹配的野生型对照小鼠在C57BL / 6 J和129 S作为先前所描述的方法制备混合的背景32

miRNA 与RNA探针原位杂交

20 nt RNA探针(Sigma;补充表   S5)在5'和3'末端均包含荧光素修饰,并在使用前进行凝胶纯化。与荧光素标记的RNA探针和AP偶联的抗荧光素抗体(Roche)进行的miRNA 原位杂交基本上按照先前的描述进行6

miRNA和mRNA 原位 HCR

补充方法中包括miRNA和mRNA 原位 HCR的详细方案对于miRNA 原位 HCR,处理直至探针杂交与先前所述6基本相同简而言之,将组织切片用4%多聚甲醛后固定,用蛋白酶K处理,再用4%多聚甲醛重新固定,然后乙酰化。然后将玻片在含有15%甲酰胺,5X SSC,0.3 mg / ml酵母RNA,100 µg / ml肝素,1X Denhardt溶液,0.1%Tween 20、0.1%CHAPS的杂交缓冲液中于37°C预杂交2.5小时。 5 mM EDTA和300 nM 12mer随机DNA引物。将一或两个miRNA探针(每个探针100 nM)在杂交缓冲液中于37°C杂交过夜。对于原位结合mRNA的miRNA使用分离的引发剂探针进行HCR,由11个探针对组成的池替换了一个miRNA探针,每个探针的最终浓度为5 nM。杂交后,将玻片在2X SSC中用0.1%Tween 20(2X SSCT)冲洗,然后在37°C下用2X SSCT洗涤3次,每次10分钟,然后在3M TMAC,0.2%Tween 20中进行高严格洗涤,50 mM Tris-HCl pH 8.0在45°C下放置30分钟。然后将玻片在5X SSCT中于室温下洗涤10分钟两次。

对于使用两个启动子探针与miRNA 原位 HCR 结合的miRNA ,预杂交后,总浓度为100nM-200nM的2–5个mRNA探针(Pcp2,Gad1,Rho:总计200 nM,在各个探针之间均分:每个探针40 nM 5个探针池; Rlbp1:总计100 nM)在杂交缓冲液中(与上面相同,除了用50%甲酰胺进行杂交)过夜,然后依次在37°C下的2X SSCT,1X SSCT,0.5X SSCT和0.25X SSCT中洗涤15分钟 每。接下来将玻片在杂交缓冲液(含15%甲酰胺)中在37°C下预杂交2.5小时,然后在杂交缓冲液(含15%甲酰胺)中与一种miRNA探针(100 nM)在37°C杂交过夜。如上文针对miRNA探针所述洗涤载玻片。

对于HCR检测,条件基于2023所有步骤均在室温下进行。将载玻片在5X SSCT中洗涤10分钟。将载玻片在室温下于扩增缓冲液(5X SSCT,0.1%Tween 20、10%低分子量葡聚糖硫酸盐)中孵育30分钟,然后与发夹式扩增子在扩增缓冲液中孵育(每200μl每放大器12pmol)。将发夹形放大器在95°C下变性90秒,然后冷却至室温,然后在扩增缓冲液中稀释。将玻片在5X SSCT中短暂冲洗一次,然后在5X SSCT中洗涤3次,持续15分钟。每。为了进行DNA染色,将玻片与Hoechst染料(在5X SSCT中为2 µg / ml)孵育45分钟,然后在5X SSCT中洗涤两次,每次10分钟。将幻灯片安装在Aqua-Poly / Mount(Polysciences)中。

结合miRNA 原位 HCR和免疫荧光

我们在miRNA 原位 HCR 后进行了间接免疫荧光分析检测HCR后,但在Hoechst染色之前,将洗涤的切片在封闭溶液中(1:400未标记的亲和纯化Fab片段驴抗小鼠IgG(H + L)和5%驴血清在TBS中孵育:100 mM Tris-HCl, pH 7.5、150 mM NaCl,0.05%Tween 20)。然后将切片与小鼠抗AP2α孵育38(发育研究杂交瘤库)1:1000在TBS中在室温下搅拌两小时。将切片在TBS中洗涤3次,然后与Alexa Fluor 647缀合的抗小鼠二抗(1:1000,Jackson Immunoresearch)在室温下孵育1小时。将切片在TBS中洗涤3次,并安装在Aqua-Poly / mount中。

显微镜和图像处理

切片在Olympus FV1000共聚焦显微镜上成像。分析图像并用Fiji / ImageJ分配颜色。miR-124的图像亮度降低到图2a,b,e,g,h,k中的平衡通道   使用Adobe Photoshop对代表性图像进行裁剪,组合和标记。


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