泛素结合酶E2O(UBE2O)是一种具有E2和E3连接酶活性的大的E2泛素结合酶。异位UBE2O过表达与多种人类疾病，尤其是癌症有关。然而，UBE2O在人乳腺癌中的表达谱和功能生物学尚不清楚。在本研究中，我们发现UBE2O在人BC组织和细胞中明显过表达。UBE2O高表达者转移风险高，预后差。体外实验表明，UBE2O促进了BC细胞的增殖和上皮间充质转化(EMT)，使BC细胞具有癌细胞的干细胞特性(CSPs)。UBE2O基因敲除MDA-MB-231细胞对小鼠移植瘤模型的肿瘤生长和肺转移有抑制作用.在机械作用下，UBE2O作为AMPKα2的泛素酶，促进其泛素化和降解，激活mTORC 1信号通路，促进BC的发生和转移。此外，癌蛋白MYC作为UBE2O/AMPKα2/mTORC 1轴的下游因子，在人BC中转录促进UBE2O并形成正反馈环。我们的研究表明，UBE2O/AMPKα2/mTORC1-MYC在人BC细胞中形成一个正反馈环，调节BC细胞的增殖和EMT，并向BC细胞注入CSPs。

泛素结合酶E2O(UBE2O)是一种由E2和E3酶结合而成的E2泛素结合酶，具有E2和E3的活性。1。它通常在哺乳动物组织中表达，但在大脑、心脏、骨骼肌和肝脏中有较高水平的表达。2。解禁UBE2O与多种人类疾病有关。UBE2O介导骨形态发生蛋白信号过程中Smad 6泛素化3并抑制TRAF 6 K63-多泛素化，进而阻止NF-κB信号的激活。4。它还可以通过泛素化转录因子bmal 1来控制细胞的时钟功能。5。UBE2O在多种恶性肿瘤中的表达异常6,7,8。然而，UBE2O在人乳腺癌(BC)中的确切作用尚不清楚。

安培激活蛋白激酶(AMPK)是细胞内能量和代谢的诱导剂.它是一种异三聚体，包括催化α亚基、调节β亚基和γ亚基。9。AMPK的激活可以通过ATP/AMP比值或磷酸化来调节。10，其主要作用是抑制合成代谢，诱导分解代谢。11。Ampk也是控制细胞渗透压和许多异物进入细胞的重要调节因子。12,13,14。AMPK的异位表达往往与一系列人类疾病，尤其是癌症有关。以往的研究表明，ampkα2在人肾脏、卵巢和bcs中存在下调或活性降低的现象。15,16。AMPK的抗肿瘤作用可概括为：(1)AMPK可调节Hippo通路，抑制细胞生长；17(2)AMPK是已知的抑癌基因LKB 1的下游靶点；18(3)激活AMPK可抑制ACCA，阻断脂肪生成，抑制肿瘤生长；19(4)AMPK可磷酸化癌基因TSC 2和mTORC 1伴猛禽，从而抑制mTOR通路。20,21。然而，其他的研究报道，ampk激活在ras转化成纤维细胞和星形胶质细胞中具有促进肿瘤的作用，并促进肿瘤细胞的存活。22,23。AMPK还可以通过线粒体途径减轻癌细胞的代谢压力和凋亡。24,25。因此，AMPK在BC中的作用还有待进一步研究。

在本研究中，我们发现UBE2O在BC组织和细胞中明显过表达。UBE2O高表达者转移风险高，预后差。功能检测证明UBE2O促进了BC细胞的增殖和上皮间充质转化(EMT)，并赋予BC细胞具有癌细胞的干细胞特性(CSPs)。在机械作用下，UBE2O作为AMPKα2的泛素酶，促进其泛素化和降解，激活mTORC 1信号通路，促进BC的发生和转移。UBE2O的药理干预通过恢复AMPKα2而抑制其对BC细胞的促肿瘤活性，提示UBE2O有望成为BC治疗的靶点。此外，作为UBE2O/AMPKα2/mTORC 1通路的下游靶点，MYC转录促进了UBE2O的表达，表明该轴是一个正反馈环。

BC细胞和标本

MDA-MB-231、MCF-7和T-47D细胞是从中国科学院(上海)的细胞库购买的。MDA-MB-453，MDA-MB-468，SK-Br-3，Hs578T，BT-549和MCF-10A细胞购自Bena培养物(北京)。在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基上培养MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468、T-47D、MCF-7、SK-BR-3和Hs578T细胞。BT-549细胞在RPMI 1640(美国吉布科)中保持10%的FBS。用含有霍乱毒素的MEGM试剂盒培养McF-10A细胞。所有细胞系在37℃下，在含5%二氧化碳和95%氧气的加湿气氛中孵育。

新鲜BC组织和配对正常组织取自BC患者(n50)于2016年4月至9月在哈尔滨医科大学癌症医院接受手术。切除后全部取组织标本，立即保存于−80°C。2012年至2013年，100例福尔马林固定石蜡包埋的原发性BC标本也从哈尔滨医科大学肿瘤医院病理科获得。以上患者均有完整的临床病理资料。术前接受辅助化疗、免疫治疗或放射治疗的患者和复发肿瘤、转移性疾病、双侧肿瘤或其他先前肿瘤的患者除外。我们的研究得到了哈尔滨医科大学研究伦理委员会的批准。所有参与本研究的患者均签署知情同意协议。

实时定量PCR

用TRIzol试剂(目录号15596018，Invitrogen，中国)提取总RNA，用Rever TraAce PCR试剂盒(日本TOYOBO目录号FSQ-201)进行合成。QRT-PCR是在CFX 96触摸检测系统(美国Bio-Rad)上使用SYBR Green实时PCR主混合(目录号QPK-201，日本TOYOBO)进行的。二−∆∆CT采用基因表达定量方法。以GAPDH为参照基因。The sequences of the primers were as follows：GAPDH，5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′(F)and 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′(R)；UBE2O，5′-GAATCCAAAACCAAGAGCGAAG-3′(F)and 5′-TCATCTCTGCCTTCTTTTAGCA-3′(R)；MYC，5′-GGCTCCTGGCAAAAGGTCA-3′(F)and 5′-CTGCGTAGTTGTGCTGATGT-3′(R).

细胞计数试剂盒-8(CCK-8)及集落形成试验

CCK-8检测细胞(2×10)3每孔)分别接种于96孔板的每口井中，在培养基中孵育。在每一预置时间，在每口井中加入CCK-8(目录号C 0038，Beyotime，中国)的10×10升的CCK-8溶液，每口井含有90%的培养基。37°C孵育2h，在570 nm处测定吸光度。

集落形成试验：将所指示的BC细胞接种到6孔板(每孔500个细胞)中，每2天刷新一次培养基。2周后用福尔马林固定30 min。采用结晶紫(编号：C 8470，Solarbio，中国)对细胞进行染色，并采用荧光M系统(ProteinSimple，USA)对细胞进行染色。

伤口愈合和侵袭试验

创面愈合试验：细胞接种6孔板，细胞达到100%汇合后，用无菌微管进行划痕处理。在每个预置时间，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，并在显微镜下拍摄图像。然后，测量和分析指示细胞的迁移率。

在侵入试验中，24口井透井板(美国取芯)的上部室涂上了Matrigel(美国取芯目录编号356234)。细胞(1×10)5)悬浮于200μl无血清培养基中，接种于Transwell板的上腔。下腔室加入10%FBS培养液600μl，37°C孵育24h，固定细胞，用结晶紫染色。然后，拍摄图像，在显微镜下对细胞进行计数。

球体文化与球体形成试验

细胞悬浮于肿瘤干细胞培养基(1×10)中。3含DMEM/F-12(编号：12660012，美国吉布科)、1×B27(目录号17504044，Invitrogen，美国)、20 ng/ml表皮生长因子(目录号PHG 0311，Invitrogen，美国)、20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(目录编号PHG 0263，Invitrogen，美国)和2mM L-谷氨酰胺(目录编号25030081，Invitrogen，美国)。然后，将这些细胞接种到超低附着板中(Thermo Science，USA).每隔48h更换培养基一次，2周后用显微镜对茎球进行成像和计数。

免疫组织化学(IHC)和免疫荧光染色

采用标准链霉亲和素-过氧化物酶复合物法对BC患者和小鼠石蜡包埋标本进行IHC检测。三位病理学家分别用标准组织化学评分(H-Score)对染色结果进行评价和评分。

免疫荧光染色试验如前所述。26。简单地说，细胞被固定，0.5%Triton-100(Solarbio，中国)渗透，5%牛血清白蛋白阻断。在此基础上，用美国的细胞信号技术：抗Cdh 1(14472)和抗波形蛋白(5741)孵育细胞。然后分别与相应的二级抗体(CST，USA)和4‘，6-二氨基-2-苯环吲哚(DAPI)(Thermo Fisher Science，USA)共同孵育。最后用共聚焦显微镜观察染色结果。

Westernblot和环己酰亚胺测定法

采用放射免疫沉淀法(RIPA)(目录号P0013B，Beyotime，中国)对含苯甲基磺酰氟(PMSF)缓冲液(目录号ST 506，Beyotime，中国)进行Westernblot分析。收集裂解液，并按前面描述的方法进行westernblot检测。27。实验采用UBE2O(15812~1-AP)、AMPKα1(10929~2-AP)、AMPKα2(18167-1-AP)、CDH 2(22018-1-AP)、CD 44(15675-1-AP)、ABCG 2(27286-1-AP)、MYC(10828-1-AP)和β-actin(60008-1-Ig)等抗体。Cdh 1(14472)、波形蛋白(5741)、鼻塞(9585)、OCT 4(2750)、猛禽(2280)、PS 792-猛禽(2083)、S6K(2708)和PT 389-S6K(9234)。

采用放线菌酰亚胺(CHX)法，将MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，隔夜培养.在培养基中加入CHX(200μg/ml)(目录号C 7698~5G，Sigma，USA)。在预定时间(0、2、4、6和8h)收集细胞，进行Westernblotting。

慢病毒转染

为建立稳定的UBE2O过表达细胞，将UBE2O表达慢病毒载体和空载体(Genechem，Genechem)分别以8μ/ml的方式转染MCF-7细胞。24小时后，用普罗霉素筛选细胞，获得稳定的UBE2O表达细胞。

为构建稳定的UBE2O或AMPKα2基因敲除细胞，设计了针对UBE2O和AMPKα2的shRNA(Sigma，USA)。其序列如下：ube2OshRNA#1：5′-CCGGCGATGATTCCTATGGCTTCTACTCGAGTAGAAGCCATAGGAATCATCGTTTTT-3′；ube_2O-shRNA#2：5′-CCGGGACATCAAGAAGCTACAGGAACTCGAGTTCCTGTAGCTTCTTGATGTCTTTTT-3′；ube_2O-shRNA#3：5′-CCGGCGGGTCTCTTCTTCGATGATTCTCGAGAATCATCGAAGAAGAGACCCGTTTTT-3′；ampkα2-shRNA#1：5′-CCGGCGCAGTTTAGATGTTGTTGGACTCGAGTCCAACAACATCTAAACTGCGTTTTT-3′；ampkα2-shRNA 2：5′-CCGGGTGGCTTATCATCTTATCATTCTCGAGAATGATAAGATGATAAGCCACTTTTT-3′；和ampkα2-shRNA#3：5′-CCGGCCCACTGAAACGAGCAACTATCTCGAGATAGTTGCTCGTTTCAGTGGGTTTTT-3′.。用qRT-PCR和westernblotting检测转染效果。

质粒与RNA干扰

标记的UBE2O、MYC标记的AMPKα2和His标记的泛素质粒是由Genechem(Genechem，中国)构建的.所有构建物均经全长测序验证。针对MYC的siRNA是从基因制药公司(中国上海)购买的。瞬时转染用脂质体2000转染试剂(目录编号11668019，Invitrogen，美国)根据制造商的指示进行。序列如下：MYC-RNAi#1：5′-GAGGAUAUCUGGAAGAAAUTTAUUUCUUCCAGAUAUCCUCTT-3′；MYC-RNAi#2：5′-GCUUGUACCUGCAGGAUCUTTAGAUCCUGCAGGUACAAGCTT-3′；和MYC-RNAi#3：5′-GGAAGAAAUCGAUGUUGUUTTAACAACAUCGAUUUCUUCCTT-3′.

免疫共沉淀(IP)和泛素化试验

IP试验用含PMSF的RIPA缓冲液对MDA-MB-231细胞进行裂解，离心分离.然后取部分裂解液作为输入，其余部分与IgG或相应的抗体在4°C孵育一夜。然后将微球加入混合物中，旋转4h，用含PMSF的三缓冲盐水(TBS)洗涤。最后，对样品进行煮沸和西方印迹。共免疫共沉淀(Co-IP)实验中，将标记的UBE2O和MYC标记的AMPKα2质粒同时转染MCF-7细胞.48小时后，收集并溶解细胞，细胞裂解液按上述IP处理。

体外泛素化试验如前一份报告所述。28。将His标记的泛素质粒(Genechem，China)转染到所述细胞中，培养48h，收集细胞，进行上述IP处理。

染色质免疫沉淀(芯片)

芯片分析试剂盒(产品目录号，P 2078，Beyotime，中国)是根据制造商的指示使用的。总之，MDA-MB-231和MCF-7细胞在最终浓度为1%的甲醛作用下，将靶蛋白与DNA交联。然后，加入甘氨酸溶液以终止反应。样品经1000×离心分离。g2分钟。然后，将细胞再悬浮在PMSF的十二烷基硫酸钠裂解缓冲液中，用超声波细胞干扰剂在冰上溶解。然后，用DNA净化试剂盒提取和清洗DNA(目录编号D 0033，Beyotime，中国)。然后，用抗MYC(CST，USA)或IgG抗体在4°C孵育一夜，然后用蛋白A沉淀。最后纯化DNA，用qRT-PCR检测UBE2O启动子片段.UBE2O启动子的引物为5‘-TCCGGTTCAAGCGATTTG-3’(F)和5‘-CATGCGAAACCCCATCTCTCTACT-3’(R)。

荧光素酶报告试验

采用美国Promega公司的双荧光素酶检测系统。将野生型或突变型UBE2O启动子荧光素酶报告质粒转染293 T细胞，并将不同数量的MYC质粒转染293 T细胞。48小时后，用被动裂解缓冲液溶解细胞，并进行荧光素酶分析。萤火虫荧光素酶活性正常为肾荧光素酶活性作为内部对照。

动物研究

所有动物研究均经哈尔滨医科大学医学实验动物护理委员会批准。6周龄雌性BALB/c裸鼠(北京生命河实验动物技术有限公司)随机分为两组(n=6)。MDA-MB-231-Luc细胞(5×10)5)分别在小鼠乳腺脂肪垫内注射sh-UBE2O#1和sh-NC。每5天测量一次肿瘤生长。注射后7周，用XenogenIVIS光谱成像系统(美国卡利珀生命科学)对小鼠进行成像，并对肿瘤进行IHC采集。肿瘤体积用以下公式计算：1/2(长×宽)2)。肿瘤转移模型：6周龄雌性BALB/c裸鼠(n6)随机分为两组。MDA-MB-231-Luc细胞(5×10)5)将sh-UBE2O#1和sh-NC分别转染小鼠尾静脉。注射后7周，取肺组织进行苏木精和伊红染色。每一组的样本大小是根据先前的研究确定的。29,30,31.

统计分析

所有数据均以至少三个独立实验的平均值±SDS表示。统计分析用学生的t检验或单因素方差分析以及各组间的差异在统计学上进行比较是相似的。在动物研究中，没有使用致盲的方法。用卡方检验分析UBE2O表达与BC患者临床病理特征的关系。采用Kaplan-Meier法和对数秩检验法绘制生存曲线.P < 0.05 indicated statistical significance, which was evaluated using SPSS 21.0 software (Statistical Product and Service Solutions, USA).

UBE2O在BC组织中的高表达与BC患者预后的关系

我们采用qRT-PCR和westernblotting方法检测了50对BC组织和相应正常组织中UBE2O的表达。结果表明，UBE2O在癌组织中的表达明显高于相应的正常组织(图1)。1A，b)。然而，在四种亚型BC组织中，UBE2O的表达没有差异(见图)。1C，d)。用IHC染色法探讨UBE2O在BC患者中的表达及其临床意义。UBE2O在BC组织和正常乳腺组织不同临床阶段表达的典型图像如图所示。1E。这些病人的临床病理特征见表。1。我们发现UBE2O状态与肿瘤大小呈正相关(p=0.014)，腋窝淋巴结状况(p=0.038)及临床分期(p=0.019)。经对数秩检验，证实UBE2O高表达患者总体生存率(OS)较低(P<0.01)。p=0.0416)和无远处转移生存(Dmf)(p=0.0017)(图1。1F，g)。鉴于参与本研究的患者人数有限，我们采用了两个标准数据库来检查BC患者的UBE2O状态。基因表达谱分析表明UBE2O在肿瘤组织中转录上调。氢)。KM图显示，UBE2O高表达的BC患者无进展生存期(PFS)、DMFs和OS均较差。1I-k)。这些结果表明UBE2O在BC组织中高表达，并与BC患者的预后呈负相关。

a, bBC患者外周血及癌旁正常组织UBE2O表达的qRT-PCR分析(英文)n=50)。c应用qRT-PCR分析不同亚型BC组织中UBE2O表达差异。n=50)。d采用Westernblotting方法对8例不同亚型BC组织及相应正常组织中UBE2O蛋白表达水平进行了分析，并以β-actin为参照。e用免疫组织化学(IHC)法检测不同临床分期BC组织和正常乳腺组织中UBE2O的表达。显示具有代表性的图像(上：放大×100，刻度条，100μm，下：放大×400，标度条，20μm)。f, gKaplan-Meier生存曲线分析显示，UBE2O高表达患者的整体生存率(OS)和无远处转移生存期(DMFs)均低于UBE2O低表达者。hGEPIA数据库用于分析BC患者组织转录本的差异(n=1085)和正常乳腺组织(n=291)。伊克对UBE2O高表达和低表达的BC患者的无进展生存期(PFS)、DMFs和OS进行了KMPLOT数据库分析。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. The data represent at least three independent experiments.

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上调UBE2O对BC细胞增殖和EMT的促进作用

为探讨UBE2O在BC细胞中的作用，采用Westernblot方法对不同的BC细胞株进行了UBE2O的表达检测。如图所示。2AUBE2O在高转移细胞系MDA-MB-231中明显过表达，而在低转移细胞系MCF-7中表达相对较低。而乳腺上皮细胞系MCF-10A的UBE2O表达低于其他BC细胞系。为了直接检测UBE2O的致癌功能，采用慢病毒介导的系统感染了3种特异性短发夹RNA(ShRNAs)，建立了UBE2O基因敲除细胞系。同时，用mcf-7建立高表达细胞株(mcf-7)。OE-UBE2O)。Westernblotting和qRT-PCR检测两种细胞系的转染效率。如图所示。沙一A-S1b，sh-UBE2O#1和sh-UBE2O#3对MDA-MB-231细胞具有较好的UBE2O基因敲除效率。因此，mda-MB-231sh-UBE2O#1，MDA-MB-231sh-UBE2O#3和MCF-7OE-UBE2O建立细胞并应用于随后的调查。然后用CCK-8法检测UBE2O对BC细胞增殖的影响.结果表明，UBE2O基因敲除可降低MDA-MB-231细胞的增殖能力.相反，UBE2O的过表达能显著促进MCF-7细胞的体外生长。2B、图1.S1c)。菌落形成试验也显示出类似的结果。2C、图1.S1d)。为进一步探讨UBE2O状态与人外周血单个核细胞(BC)肿瘤增殖的关系，采用免疫组化法(IHC)检测人外周血单个核细胞中Ki-67的表达，并进行卡方检验。结果表明，UBE2O状态与Ki-67表达呈正相关(Ki-67>20%为高表达水平)。二维空间)。最后，mda-MB-231sh-nc和MDA-MB-231sh-UBE2O#1将细胞注射到BALB/c裸鼠乳腺脂肪垫中。不出所料，UBE2O基因敲除明显抑制异种移植物肿瘤的大小(如图所示)。2E，f)并产生了更好的无瘤生存(图一)。2G)。这些结果证实UBE2O在体外和体内均能促进BC细胞的增殖。

aWesternblotting法检测UBE2O蛋白在BC细胞和未转化MCF-10A细胞中的表达。bCCK-8和c集落形成实验表明，敲除UBE2O对MDA-MB-231细胞的增殖能力有抑制作用.相反，UBE2O在MCF-7细胞中的过表达促进了细胞的增殖.dUBE2O和Ki-67的表达情况用IHC(放大倍数×10 0，标度为10 0μm；下：放大×4 0 0，标度为2 0μm)检测，并进行卡方检验(Ki-67<2 0%为低表达)。e–g采用小鼠异种移植模型研究mda-mbb-231的肿瘤发生。sh-UBE2O#1体内细胞(上：放大×100，刻度棒，100μm；下：放大×400，刻度条，20μm)，fmda-MB-231在小鼠体内建立的肿瘤体积sh-nc/MDA-MB-231sh-UBE2O#1各组记录在案，g对两组无瘤生存情况进行分析。数据以平均±S.D表示。学生的t检验用于统计分析：*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. The data represent at least three independent experiments.

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然后，我们探讨了UBE2O对EMT的影响，EMT是肿瘤转移的关键过程。在创面愈合实验中，UBE2O基因敲除降低了MDA-MB-231细胞的迁移，UBE2O的过表达增强了MCF-7细胞的迁移能力。3A、图1.S1e)。在Matrigel包被Transwell检测中，UBE2O基因敲除抑制了MDA-MB-231细胞的侵袭能力，UBE2O的过表达促进了MCF-7细胞的侵袭。3B、图1.S1f)。此外，westernblot和免疫荧光(If)检测显示mda-mbb-231中上皮标记cdh 1表达上调，而cdh 2、viimentin和slg的表达降低。sh-UBE2O#1细胞。相反的结果发生在MCF-7中。OE-UBE2O细胞(图1.3C，d)。为探讨UBE2O在体内的前转移作用，采用尾静脉注射法在另一组裸鼠体内建立肺转移小鼠模型。结果显示小鼠注射mda-mbb-231。sh-UBE2O#1与注射mda-mbb-231的小鼠相比，细胞显示出较少的肺转移淋巴结。sh-nc细胞(图1.3E)。这些结果表明，UBE2O在体外和体内均能促进BC细胞的EMT和转移。

a采用创面愈合实验，观察UBE2O表达对细胞迁移的影响(标尺为200μm)。b用Matrigel侵袭试验检测UBE2O在所示细胞(鳞状细胞，200μm)中的表达水平。cWesternblot结果显示，mdm-mb-231细胞经抑制UBE2O后，上皮标记物(Cdh 1)增加，间充质标记物(cdh 2、viimentin和slg)减少，mcf-7则相反。OE-UBE2O细胞与对照细胞比较。d用染色法检测mda-mbb-231中的EMT标记物。sh-nc/MDA-MB-231sh-UBE2O#1和MCF-7数控/MCF-7OE-UBE2O细胞(鳞片条，50μm)。e摘除MDA-MB-231的肺sh-nc/MDA-MB-231sh-UBE2O#1拍摄小鼠肺转移瘤，HE染色并进行分析(标尺为100μm)。数据以平均±S.D表示。学生的t检验用于统计分析：*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. The data represent at least three independent experiments.

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UBE2O对BC细胞CSPs的诱导作用

鉴于CSPs在BC复发和转移中起着关键作用，我们进一步研究了UBE2O是否能介导BC细胞中的CSPs。细胞干细胞球试验显示mda-mb-231的球体形成能力明显降低。sh-UBE2O#1细胞，而MCF-7OE-UBE2O细胞表现出更强的CSP形成能力(图)。4A)。westernblot分析表明，mda-mbb-231中的cs标记CD 44、abcg 2、oct 4和myc显著降低。sh-UBE2O#1与NC组相比，mcf-7组细胞数增加，而mcf-7组细胞数增加。OE-UBE2O细胞(图1.4B)。最后用IHC染色法检测CD 44和MYC与临床标本UBE2O表达的相关性。UBE2O与CD 44、MYC呈显著正相关(图一)。4C，d)。这些结果共同证实了UBE2O在体外可使BC细胞具有CSPs。

a在肿瘤干细胞培养基中培养2周。然后在光学显微镜下观察细胞，用三份板(上：放大×100，刻度棒，100μm；下：放大×400，刻度棒，20μm)测定各组形成的茎状球数。b检测mda-mb-231中癌干细胞标志物(CD 44、ABCG 2、OCT 4和MYC)的表达水平。sh-nc/MDA-MB-231sh-UBE2O#1细胞与MCF-7数控/MCF-7OE-UBE2O细胞通过西方杂交。c, d应用免疫组化法(IHC)检测BC患者CD 44和MYC的表达情况。n=100，上：放大率×100，下：放大率×400)，用Pearson相关系数计算其与UBE2O的相关性。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. The data represent at least three independent experiments.

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UBE2O介导的AMPKα2泛素化和降解

AMPK是一种异三聚体，包括α亚基(ampkα)、β亚基(ampkβ)和γ亚基(ampkγ)。ampkα还包含两个结构元素：ampkα1和ampkα2。此前的研究表明，ube2O是一种在一系列转基因小鼠自发癌模型中泛素化和降解ampkα2的ampkα2相关蛋白。28。然而，UBE2O是否能泛素化和降解人BC中AMPKα2的研究尚未见报道。我们曾证明，MDA-MB-231细胞的UBE2O含量最高，因此他们被用来测试UBE2O对AMPKα稳定性的影响。Chx分析表明，AMPKα2蛋白稳定性明显增强，而AMPKα1蛋白稳定性无明显变化(图5)。5A)。这些结果证实了AMPKα2，而不是AMPKα1是UBE2O的下游靶点，可能在UBE2O依赖的肿瘤发生中起一定作用。然后，对mda-mbb-231细胞进行内源性ip检测，进一步探讨ube2O与ampkα2的相互作用。5B结果表明，UBE2O能在MD-MB-231细胞中与AMPKα2结合.结果表明，UBE2O能在MCF-7细胞中与AMPKα2相互作用。5C)。然后将His标记的泛素质粒转染到所指示的细胞系中，测定细胞内泛素化能力。如图所示。5D，mda-mbb-231中ampkα2的泛素化显著降低。sh-UBE2O#1MCF-7细胞反之亦然。最后用IHC染色法检测BC组织中AMPKα2的表达，并观察到UBE2O表达与AMPKα2呈负相关(图)。5E)。这些结果证实UBE2O可以介导AMPKα2在BC细胞中的泛素化和降解。

amda-MB-231的裂解物sh-nc/MDA-MB-231sh-UBE2O#1用放线菌酰亚胺(CHX)处理细胞后，进行Westernblotting。将AMPKα2和AMPKα1的表达水平量化，并将其与内参照的强度相适应。b用IgG、抗UBE2O或抗AMPKα2抗体免疫沉淀MDA-MB-231细胞裂解液，并进行免疫印迹分析。c标记UBE2O质粒和MYC标记的AMPKα2质粒分别转染或共转染MCF-7细胞。转染48小时后，细胞裂解，用MYC标记抗体免疫沉淀。然后用抗UBE2O或抗AMPKα2抗体进行westernblot检测.dmda-MB-231的裂解物sh-nc/MDA-MB-231sh-UBE2O#1细胞与MCF-7数控/麦克-7UBE2OHis标记泛素细胞用MG 132(10μm)作用4h，用IgG或His标记抗体进行ip，用抗AMPKα2抗体进行泛素化评价。e用免疫组化法检测α2在BC患者中的表达，用皮尔逊相关系数分析其与UBE2O的相关性(上：放大率×10 0，刻度棒，10 0μm，下：放大率×4 0，标度棒，2 0μm)。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. The data represent at least three independent experiments.

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UBE2O通过UBE2O/AMPKα2/mTORC 1轴促进BC细胞增殖、EMT和CSPs

其次，在两个指示的BC细胞和图中检测到AMPK底物。6A表明在mda-mbb-231中p-Raptor的表达增强，p-s6k的表达降低。sh-UBE2O#1细胞，表明mTORC 1信号失活。在MCF-7中可以观察到相反的效应。OE-UBE2O细胞。以前的研究已经使用了许多方法来证明AMPK具有抑制肿瘤的作用。其中，mTORC 1可能是最关键的下游目标。AMPK可直接磷酸化mTORC 1结合伙伴猛禽，并通过灭活mTORC 1发挥抗肿瘤作用。20,21。我们的结果与这些研究是一致的。然而，mTORC 1通路的另一个关键上游调节因子p-AKT的表达未见任何改变，表明AMPK而非AKT在BC中介导了UBE2O的功能。其次，在MDA-MB-231细胞中，AMPKα2被稳定地击倒(如图所示).S2A-S2B)，并对BC细胞进行表型分析。结果表明，AMPKα2基因敲除可显著减少迁移(图1)。6B、图1.S2C)，入侵(图1.6C、图1.S2D)，增殖(图1.6d，e、图1.S2E-S2f)和CSPs(图1.6f)MDA-MB-231细胞。此外，westernblot检测证实ampkα2基因敲除还可抑制mda-mb-231中上皮标记物(Cdh 1)的上调，间充质标记物(cdh 2，vientin)和CS标记物(cd 44，abcg 2，oct 4和myc)的下调。sh-UBE2O#1细胞(图1.6g)。进一步探讨mTORC 1通路的激活是否对bc细胞uBE2O的抑癌活性有重要影响。数控/MCF-7OE-UBE2O细胞用雷帕霉素(一种内源性mTOR抑制剂)处理。Westernblot分析显示，mcf-7治疗后，cdh 1表达降低，间充质(cdh 2和vientin)增强，肿瘤干细胞(CD 44，abcg 2，oct 4和myc)表达消失。OE-UBE2O雷帕霉素细胞。7A)。细胞功能实验证实了MCF-7的迁移、侵袭、增殖和cps的增强。OE-UBE2O雷帕霉素处理后细胞消失。7b-f).

aWesternblotting显示mda-mbb-231中有p-Raptor的表达增加。sh-UBE2O#1表明mTORC 1通路受到抑制。作为mTORC 1的下游效应者，p-S6K的表达也降低。相反的结果发生在MCF-7中。OE-UBE2O细胞。b–fmda-mbb-231中α2被击倒。sh-nc/MDA-MB-231sh-UBE2O#1细胞。然后,b抓痕试验，c入侵检测，d菌落形成试验，eCCK-8试验和f球体形成测定：上放大×10 0，比例尺1 0 0μm，下：放大率×4 0 0，比例尺2 0μm。g采用westernblot方法检测mdm-mb-231抑制mdm-mb-231后，EMT标记物(cdh 1、cdh 2、波形蛋白和鼻塞)、CS标记(CD 44、abcg 2、Oct 3/4和myc)和mTORC 1通路相关标记(p-Raptor和p-s6k)的表达。sh-nc/MDA-MB-231sh-UBE2O#1细胞。数据以平均±S.D表示。学生的t检验用于统计分析：*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. The data represent at least three independent experiments.

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a麦克-7数控/MCF-7OE-UBE2O雷帕霉素(100 N)处理细胞M用Westernblot法检测EMT标记物(Cdh 1、Cdh 2、波形蛋白和鼻塞)、CS标记物(CD 44、ABCG 2、Oct 3/4和MYC)和mTORC 1通路相关标记的表达。b–f麦克-7数控/MCF-7OE-UBE2O雷帕霉素(100 N)处理细胞M)，以及b细胞迁移，c入侵，d, e增殖和fCsPs(上：放大×100，刻度条，100μm，下：放大×400，刻度条，20μm)。数据以平均±S.D表示。学生的t检验用于统计分析：*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. The data represent at least three independent experiments.

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鉴于UBE2O在BC中的重要作用，针对UBE2O的化疗策略可能是一种很有前途的抗癌治疗方法。以往的研究表明，UBE2O的AMPK泛素化是通过分子内硫代酯机制发生的。砷可以交联相邻的半胱氨酸，进而抑制其泛素化。1。因此，临床相关浓度的三氧化二砷(ATO)(0.5-1米)M)，用于治疗急性早幼粒细胞白血病，抑制UBE2O泛素化。图中的结果。S3A结果表明，在临床相关浓度下，α2在MCF-7细胞中的表达明显增强。结果表明，ato能降低ube2O对ampkα2的多泛素化降解活性。数控/MCF-7OE-UBE2O用ATO细胞进行细胞功能实验。westernblot检测证实了mcf-7中EMT和肿瘤干细胞标志物的上调作用。OE-UBE2O细胞被ATO处理所阻断(见图)。S3b)。功能实验进一步表明MCF-7的迁移、侵袭、增殖能力和cps的增强。OE-UBE2O细胞经ATO处理后消失(如图所示)。S3丙-S3f)。这些结果表明，UBE2O通过AMPKα2/mTORC 1轴促进了BC细胞的增殖、EMT和CSPs，靶向UBE2O可能是一种很有前途的BC治疗策略。

MYC转录促进Bc细胞UBE2O表达并发挥正反馈作用

如上所述，UBE2O在BC中普遍过表达，因此我们研究了UBE2O在BC细胞中的调节机制。利用Jaspar数据库鉴定潜在的UBE2O转录因子。巧合的是，我们发现在UBE2O启动子区域有两个潜在的MYC结合位点。8A)。此外，我们还证明了UBE2O和MYC在BC患者中存在显著的线性相关(图一)。4D)。因此，将靶向MYC的siRNAs转染MDA-MB-231和MCF-7细胞.用Westernblotting法检测MYC沉默的效率。8B)和qRT-PCR。S3g)，以及相对的UBE2O表达式。结果表明，UBE2OmRNA和蛋白表达水平(见图)。8B，c)MDA-MB-231和MCF-7细胞的MYC沉默后下降.然后，我们构建了两组荧光素酶报告质粒(序列1和序列2)，其中含有UBE2O启动子区域的野生型或突变型MYC结合位点。图中的数据。8D结果表明，在293 T细胞中共转染MYC和UBE2O-Sequence 1报告质粒可提高荧光素酶活性，且增加率与MYC质粒剂量呈正相关。然而，我们未能观察到突变组间荧光素酶活性的差异。序列2的荧光素酶报告试验表明，随着MYC质粒剂量的增加，野生型和突变型质粒群的荧光素酶活性没有显著差异。这些结果表明，MYC可以结合UBE2O启动子区域的序列1，激活UBE2O的转录。此外，芯片分析证实，MYC可以直接结合到MDA-MB-231和MCF-7细胞中UBE2O启动子特异性区域的序列1。8E)。这些结果共同证实了MYC能够激活UBE2O的转录，从而在BC细胞中形成一个正反馈环。

a利用Jaspar数据库预测了UBE2O启动子区两个可能的MYC结合位点。b, c将靶向MYC的siRNAs转染MDA-MB-231和MCF-7细胞.用qRT-PCR和westernblot方法检测UBE2O的表达变化.d分别将针对MYC两个结合位点的野生型或突变型UBE2O启动子报告载体转染293 T细胞。转染不同量的MYC质粒，并进行荧光素酶检测。e用IgG或MYC抗体对所指示的BC细胞进行芯片检测。用qRT-PCR检测UBE2O启动子区的片段.f结构图显示，UBE2O/AMPK、α2/mTORC 1/MYC轴构成BC细胞的正反馈环。数据以平均±S.D表示。学生的t检验用于统计分析：*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. The data represent at least three independent experiments.

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通过以上实验，我们可以得出以下结论：(1)UBE2O在BC组织中高表达，这种高表达与BC患者预后不良有关。(2)UBE2O促进BC细胞增殖和EMT，维持BC细胞CSPs。(3)UBE2O通过介导AMPKα2泛素化，靶向UBE2O/AMPKα2/mTORC 1轴，促进BC细胞的恶性表型。(4)MYC作为UBE2O的下游癌蛋白，在BC细胞中促进UBE2O的表达，并发挥正反馈作用。

UBE2O作为一种巨大的E2泛素结合酶，同时具有E2和E3的活性，UBE2O的解除调控与人类各种癌症的发生有关。UBE2O以泛素化依赖的方式降低了野生型混合系白血病(MLL)的稳定性，从而加速了MLL细胞的增殖，并导致侵袭性白血病。32。Vila等人28将UBE2O缺失引入一系列转基因小鼠自发肿瘤模型中，发现UBE2O能以UBE2O/AMPKα2/HIF-1a-依赖的方式促进肿瘤的进展和转移。然而，BC患者UBE2O状态与其临床病理状况的关系尚未得到充分报道。我们的研究表明UBE2O在BC组织中过表达。UBE2O高表达的BC患者肿瘤转移风险高，预后差。此外，我们使用临床相关浓度的ATO治疗BC细胞，结果证实ATO能显著降低UBE2O的促肿瘤能力。因此，药物阻断UBE2O可能是治疗BC的一个很有前途的靶点。

AMPK是一种重要的细胞内能量和代谢传感器，其功能异常与多种类型的人类癌症有关。高等人33报道了AMPKα2亚基在所有人类癌症中的突变频率为0.2%-10%。AMPKAMPK 2的解除管制破坏了α的肿瘤抑制能力，进而诱导肿瘤细胞的进展。我们的研究证实UBE2O促进BC细胞EMT，并以AMPKα2泛素化依赖方式赋予BC细胞CSPs。EMT在肿瘤的侵袭和转移中起着至关重要的作用。在bc进展过程中，emt使bc细胞具有自我更新的能力，并驱动癌干细胞标志物的表达，从而促进bc细胞的耐药、免疫逃逸和转移。34。在本研究中，ampkα2基因敲除可显著逆转mda-mb-231中抗emt和抗csp的作用。sh-UBE2O#1细胞。雷帕霉素处理MCF-7细胞破坏了UBE2O过表达所建立的原EMT和原干细胞特性。这些结果证实UBE2O以AMPKα2/mTORC 1依赖的方式介导BC细胞的生物瘤行为。此外，AMPK还能通过激活p53、p27和抗Warburg效应来抑制肿瘤的进展。35,36,37。AMPK还有其他抗肿瘤功能有待进一步研究。

MYC是一种特征良好的癌蛋白，在30-50%的BC患者中被上调.MYC参与BC细胞的增殖和转移，诱导多种肿瘤生物学过程中的CSPs38。MYC是一种转录因子，调节超过15%的人类基因的转录，如ccnd、cdk 4和e2f1，这些基因参与肿瘤的进展。39。在本研究中，我们证明UBE2O通过AMPKα2/mTORC 1轴上调了MYC的表达，并与UBE2O的启动子区结合，从而促进了UBE2O的表达。自我控制的正反馈回路进一步强调了UBE2O/AMPKα2/mTORC1-MYC轴在BC中的意义。

结论：UBE2O可作为BC的潜在预后指标，UBE2O/AMPKα2/mTORC-MYC轴在BC细胞中形成正反馈环，促进BC细胞增殖和EMT，并向BC细胞注入CSPs。我们的研究为UBE2O在公元前的作用提供了重要的理论依据。