乳腺癌是全世界妇女中最常见的恶性肿瘤。虽然越来越多的证据表明，长时间的非编码RNA(IncRNAs)在乳腺癌的发生和发展过程中起着关键作用，但大多数INcRNAs在乳腺癌中的参与程度仍不清楚。在目前的研究中，我们证明LINC 00665促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。越来越多的证据表明，许多INcRNA可以作为内源性miRNA海绵，通过竞争结合共同的miRNAs。在本研究中，我们证明LINC 00665是miR-379-5p的海绵，降低了miR-379-5p抑制Lin28b的能力。LINC 00665通过上调Lin28b的表达，促进乳腺癌的进展，并诱导上皮-间充质过渡样表型。与TCGA数据库中的正常乳腺组织相比，乳腺癌组织中LINC 00665表达增强，miR-379-5p表达下降。此外，LINC 00665的表达与miR-379-5p的表达呈负相关。综上所述，我们的结果揭示了LINC00665-miR-379-5p-Lin28b轴，并为乳腺癌治疗提供了线索。

乳腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，也是全世界妇女与癌症相关死亡的主要原因。1。虽然早期诊断和系统治疗改善了乳腺癌患者的预后，但复发、转移和耐药性是乳腺癌患者成功治疗的障碍。此外，我们对乳腺癌发病机制的认识仍然非常有限。因此，识别与乳腺癌相关的新基因和新途径将有助于发展更快、更安全的诊断方法，并改善乳腺癌的预后和治疗。

90%以上的人类基因可以被转录成rna，但只有1-2%的基因能编码蛋白质。2。长非编码RNA是一类长度大于200 bp的非编码RNA.已经发现了大约50，000个incRNAs，但只有少数几个已经进行了初步研究。3。incRNAs高度保守，虽然它们本身不编码蛋白质，但它们通过影响转录、表观遗传学和翻译后修饰来调节靶基因。4。最近积累的证据支持incRNAs参与染色质重塑、转录、转录后和翻译的调控。5,6,7,8.

在多种恶性肿瘤中，incRNAs经常被调控，它们既是肿瘤抑制因子，也是癌基因，在肿瘤发生和发展过程中起着重要的调节作用；而且，它们也是有助于诊断和预后的标记物。9,10。LINC 00665位于染色体19q13.12。多项研究表明LINC 00665在肿瘤发生和发展中起着癌基因的作用。最近，芯片分析显示LINC 00665在肺腺癌中被上调。11。数据库分析还发现linc 00665在肝细胞癌中过度表达，并可能通过调节细胞周期途径来促进肿瘤的进展。12。如上所述，LINC 00665在肺腺癌中的表达增加，而LINC 00665的上调与肺腺癌的预后不良有关。此外，Linc00665作为miR-98的miRNA海绵，通过ERK信号通路促进AKR1B10的表达，从而促进肺癌的进展。13。此外，LINC 00665的下调通过与EZH 2的相互作用和PI3K/AKT通路的失活降低了对吉非替尼的抗性。14。然而，有关LINC 00665在乳腺癌中的作用的知识仍然是有限的。

在目前的研究中，我们研究了LINC 00665在乳腺癌发生和发展中的作用。我们证明LINC 00665通过海绵miR-379-5p促进乳腺癌的进展，并诱导上皮-间充质转换(EMT)样表型。此外，我们还确定Lin28b是miR-379-5p的直接靶标。我们的研究揭示了LINC00665-miR-379-5p-Lin28b轴在乳腺癌中的作用，并为解释乳腺癌的进展提供了一种新的机制。

LINC 00665的缺失抑制乳腺癌的进展

为探讨LINC 00665在乳腺癌发生、发展中的作用，采用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测了LINC 00665在6株乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮细胞株MCF10A中的表达。我们观察到LINC 00665在乳腺癌细胞株中的表达高于MCF10A细胞。此外，LINC 00665在TNBC细胞株中的表达较ER+乳腺癌细胞系高。1A)。与细胞株的结果一致，TCGA数据库中TNBC患者LIC 00665的表达增加(如图所示)。斯1)。我们通过将LINC 00665 siRNAs导入MDA-MB-231和BT 549细胞株，进一步探讨了LINC 00665对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，这两个细胞系的内源性LINC 00665表达水平高于其他乳腺癌细胞系(图1)。1B)。MTT、集落形成和EDU分析结果表明，LINC 00665的缺失抑制了乳腺癌细胞的增殖。1C，e)。此外，Transwell和伤口愈合试验结果表明，LINC 00665的耗竭抑制了MDA-MB-231和BT 549细胞的迁移和侵袭能力。1F，g)。接下来，我们生成了稳定的LINC 00665-耗竭的MDA-MB-231细胞(ShLINC 00665)和对照细胞系(ShControl)(如图所示)。斯2A)。将231-shControl或231-shLINC 00665细胞接种于雌性SCID小鼠，观察肿瘤生长情况。我们观察到，与对照组相比，shLINC 00665组肿瘤体积明显减少(图1)。斯2b和C)。这些结果表明LINC 00665的缺失可以抑制乳腺癌的进展。

a采用RT-qPCR方法检测LINC 00665在正常乳腺细胞系和乳腺癌细胞系中的表达。b用RT-qPCR方法检测转染靶向LINC 00665 siRNAs的MDA-MB-231和BT 549细胞LINC 00665的表达。c–e用集落形成法评价细胞生长抑制作用。c，MTTd和Edue中描述的细胞中的检测b. f中描述的划痕损伤后伤口愈合试验的代表性图像b. g中所描述的细胞的Transwell侵袭试验b. ***P < 0.001.

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LINC 00665过度表达促进乳腺癌进展

接下来我们研究LINC 00665过表达是否会影响乳腺癌细胞的癌变。我们通过转染pcDNA3.1-LINC00665表达质粒和载体对照细胞系获得稳定的LINC 00665-高表达T47D细胞。2A)。MTT、集落形成和EDU检测结果表明，LINC 00665的过表达促进了T47D细胞的增殖。2B-d)。Transwell检测结果表明，LINC 00665的过表达促进了T47D细胞的侵袭。2E)。然后，将T47D-LINC00665或T47D载体细胞接种于雌性SCID小鼠，观察肿瘤生长情况。我们观察到LINC 00665组肿瘤体积明显增加，与对照组相比有显着性差异(图1)。2F，g)。这些结果表明LINC 00665促进了乳腺癌的进展。

a用RT-qPCR方法检测LINC 00665表达载体或空载体转染的T47D细胞中LINC 00665的表达。b–d用集落形成评价生长抑制作用。b，MTTc和Edud中描述的细胞中的检测a. e中所描述的细胞的Transwell侵袭试验a. fT47D-LINC00665或对照细胞在收获时形成肿瘤的典型照片。g异种移植小鼠T47D-LINC00665或对照细胞在指定时间内的肿瘤体积。***P < 0.001, **P < 0.01.

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LINC 00665诱导乳腺癌细胞EMT样表型的研究

EMT是乳腺癌发生发展的重要机制之一，其中上皮细胞获得侵袭性间充质表型。我们观察到T47D-载体细胞保持鹅卵石样形态，而LINC 00665-高表达细胞呈成纤维细胞样形态。3A)。用RT-qPCR技术检测间充质和上皮标记物的表达。3B)，西方杂交(图1.3C)和免疫荧光。三维空间)。LINC 00665-高表达的T47D细胞对E-钙粘蛋白有明显的下调作用，但对间充质标记物Vimentin和N-cadherin的表达有明显的上调作用。免疫组织化学染色证实T47D-LINC 00665小鼠肿瘤中Vimentin表达上调，E-cadherin表达下调，与T47D载体小鼠肿瘤中这些蛋白的表达有关。3E)。这些结果表明LINC 00665诱导乳腺癌细胞出现EMT样表型。

aLINC 00665过表达T47D细胞图像及对照细胞形态。b和cmRNAb和蛋白质c中描述的细胞中EMT标记的表达水平a分别用RT-qPCR和WESTERNBLOTTING进行评价。d细胞内EMT标记物的免疫荧光分析a. e采用免疫组织化学方法检测T47D-LINC 00665和T47D载体异种移植物肿瘤中EMT标记的表达。***P < 0.001.

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LINC 00665通过充当Cerna来调节miR-379-5p。

为了进一步探讨LINC 00665致癌作用的潜在机制，我们用荧光原位杂交(FISH)技术检测了LINC 00665的亚细胞定位。4A)和亚细胞分馏，然后是RT-qPCR(如图所示)。4B)。我们观察到LINC 00665主要在细胞质中表达。细胞质INcRNAs通过竞争结合共同的miRNAs，可以作为miRNA海绵发挥作用。LINC 00665被预测为miR-379-5p的海绵。4C)。为了进一步评价miR-379-5p是否能与LINC 00665结合，我们构建了含有野生型(LINC 00665-wt)LINC 00665和LINC 00665的荧光素酶报告，并对miR-379-5p结合位点(LINC 00665-mut)进行了突变。如图所示。4D与miR-379-5p共转染LINC 00665-mUT可显著降低293 FT细胞的荧光素酶活性。此外，通过RNA免疫沉淀(RIP)分析，LINC 00665和miR-379-5p在含AGO 2的微核蛋白复合物中明显富集，提示LINC 00665和miR-379-5p与乳腺癌细胞中的AGO 2直接结合(图1)。4E)。此外，MIR-379-5p在LINC 00665-耗竭的MDA-MB-231细胞中的表达明显上调。4FT47D-LINC 00665细胞与对照细胞比较，T47D-LINC 00665细胞的T47D-LINC 00665细胞明显减少(如图1所示)。4F(右)接下来，我们构建了稳定的过表达MDA-MB-231细胞，LINC 00665/miR-379-5p-过表达MDA-MB-231细胞，以及对照细胞系。斯3A)。我们观察到miR-379-5p的过表达消除了LINC 0065诱导的乳腺癌在体外和体内的进展。斯3乙-第三代)。综上所述，我们的结果表明LINC 00665以部分依赖miR-379-5p海绵的方式促进乳腺癌的进展。

a有代表性的鱼类图像显示LINC 00665在MDA-MB-231细胞(绿色)中的亚细胞定位。细胞核用DAPI(蓝色)染色。b相对LINC 00665在MDA-MB-231细胞细胞核和细胞质组分中的表达水平。c预测miR-379-5p在LINC 00665中的结合位点。MUT序列包含miR-379-5p目标种子区的一个8碱基突变.d用双荧光素酶报告法验证miR-379-5p与LINC 00665的相互作用。eMDA-MB-231细胞内源性AGO 2与RNA结合的RIP分析。以IgG为对照。用RT-qPCR法测定LINC 00665和miR-379~5P水平。f用RT-qPCR方法检测MIR-379-5p在LINC 00665-耗竭的MDA-MB-231细胞(左)、LINC 00665-高表达T47D细胞(右)及相应的对照细胞中的表达水平。***P < 0.001.

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Lin28b是miR-379-5p的目标。

Lin28b经Starbase鉴定为miR-379-5p靶标。5A)。为了进一步证实这种调控关系，在荧光素酶ORF下游克隆了Lin28b3‘-UTR和相应的包含miR-379-5p结合位点突变的突变体。与对照组相比，转染miR-379-5p的293 FT细胞荧光素酶活性明显降低，抑制率为40%。5B(左)这种效应在转染了突变的Lin28b3ʹ-UTR的细胞中被消除，其中miR-379-5p的结合位点发生了突变(如图所示)。5B(右)此外，我们观察到mda-379-5p过表达的md-mB-231细胞中Lin28b的表达降低，mR-379-5p缺失的T47D细胞中Lin28b的表达高于对照组(见图)。5C)和西方杂交(图1.5D)。因此，这些数据表明Lin28b是miR-379-5p的目标。

a预测miR-379-5p在Lin28b3ʹ-UTR中的结合位点。b用双荧光素酶报告法验证了Lin28b作为miR-379-5p靶标的有效性。MUT序列在miR-379-5p目标种子区存在一个8碱基突变.c, dmRNAc和蛋白质d用RT-qPCR和Westernblotting分别检测mR-379-5p-过表达MDA-MB-231和miR-379-耗竭的T47D细胞及相应的对照细胞中Lin28b的表达水平。eWesternblotting法检测LINC 00665过表达的T47D细胞中Lin28b和EMT标记的表达水平，以及转染或不转染针对Lin28b的siRNAs和相应的对照细胞中的表达水平。f, g用集落形成评价生长抑制作用。f和MTTg中描述的细胞中的检测e. h中描述的细胞形态的图像e. I中所描述的细胞的Transwell侵袭试验e. ***P < 0.001, **P < 0.01.

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LINC 00665通过调节miR-379-5p/lin28b轴来促进乳腺癌的进展。

接下来我们研究LINC 00665是否通过调节Lin28b的表达来调节乳腺癌的进展。我们将靶向Lin28b的siRNAs转染到LINC 00665-高表达的T47D细胞中。在LINC 00665过表达细胞中，Lin28b的表达增强，而转染靶向Lin28b的siRNAs后，Lin28b的表达下降，Westernblotting证明了这一点(图)。5E)。MTT和集落形成实验结果表明，Line28b的缺失逆转了LINC 00665对T47D细胞增殖的促进作用。5F，g)。另外，转染pcDNA3.1-LINC 00665的T47D细胞呈成纤维细胞样形态，而Line28b-缺失细胞仍保持鹅卵石状形态。5H)。此外，Line28b-缺失的T47D细胞表现出明显的E-钙粘蛋白上调，但对间充质标记物Vimentin和N-cadherin的表达有明显的下调作用，如Westernblotting所示(见图)。5E)。因此，当Lin28b的表达被耗尽时，LINC 00665不能再增加T47D细胞的侵袭(图1)。5I)。Lin28b负责多种癌症中let-7转录后的下调。我们观察到LINC 00665/miR-379-5p/Lin28b轴对LET-7有调节作用。斯4).

最后，我们测定了LINC 00665在乳腺癌中的临床相关性。从TCGA数据库中检测到LINC 00665、miR-379-5p和Lin28b在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达，发现LINC 00665和Lin28b表达上调，miR-379-5p在乳腺癌组织中表达下调(见图)。6A-c)。更重要的是，我们在TCGA数据库中观察到LINC 00665、miR-379-5p和Lin28b的表达之间存在着显著的相关性(图一)。6d-f)。综上所述，我们的结果表明LINC 00665通过调节miR-379-5p/轴来促进乳腺癌的进展。

a–cLINC 00665的表达a、Lin28bb，以及miR-379-5pc在乳腺癌和正常乳腺组织中的TCGA数据库中。d和eTCGA数据库中LINC 00665、Lin28b与miR-379-5p表达的关系

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在目前的研究中，我们发现LINC 00665在乳腺癌中起着癌基因的作用。LINC 00665促进乳腺癌的进展，并诱导EMT样表型。此外，Lin28b是miR-379-5p的靶点，LINC 00665的过表达通过海绵miR-379-5p促进Lin28b的表达。因此，我们的结果揭示了LINC00665-miR-379-5p-Lin28b轴参与了EMT在乳腺肿瘤发生和发展中的调节作用。

在肿瘤发生和发展过程中，INcRNAs功能障碍与多种细胞过程有关，如凋亡、增殖、侵袭、迁移、血管生成和转移等。15。最近，linc 00665被确认在肺癌中起致癌作用。13,14和肝癌12。然而，LINC 00665在乳腺癌中的作用尚不清楚。与以前对其他癌症的研究结果一致，我们的结果提供了乳腺癌组织中LINC 00665被上调的证据，TCGA数据库的分析证明了这一点。此外，我们发现LINC 00665促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。EMT已被证明在癌症进展中起着关键作用。在EMT过程中，上皮细胞失去细胞极性和细胞粘附，形成侵袭性间充质表型。上皮标记物E-cadherin表达下调，间充质标记Vimentin和N-cadherin表达上调常发生在EMT过程中。16。在本研究中，LINC 00665降低了E-cadherin的表达，诱导了N-cadherin和波形蛋白的表达，而内源性LINC 00665在乳腺癌细胞中产生相反的作用，提示LINC 00665是乳腺癌EMT的诱导剂。

除了通过与dna、rna或蛋白质直接相互作用而介导的incRNAs的调节作用外，Cerna假说也得到了大量研究的支持，它被提出来描述RNAs的一种新的调节机制。17,18。LINC 00665作为miR-98的海绵，促进肺腺癌的癌变。13。然而，LINC 00665在乳腺癌中的作用机制尚不清楚。在这里，我们提供了一个新的Cerna调控网络的证据，其中LINC 00665充当miR-379-5p的海绵。越来越多的证据表明，许多miRNAs在乳腺癌中经常发生功能障碍，在乳腺癌的发生和发展过程中起抑癌基因或癌基因的作用；而且miRNAs是乳腺癌潜在的诊断和预后指标。19,20。例如，mir-379-5p在包括膀胱癌在内的多种癌症中被确认为一种抑癌剂。21、肝癌22、胶质瘤23、胃癌24骨肉瘤25,26和乳腺癌27。我们有证据表明LINC 00665通过抑制miR-379-5p的表达而促进乳腺癌的进展。这些结果为Cerna监管网络提供了进一步的证据。

据报道，incRNAs作为miRNAs的内源性诱饵，作为ceRNAs发挥作用，进而影响miRNAs与目标的结合。28。lin28b是一种rna结合蛋白，具有癌基因的作用，是治疗癌症的潜在靶点。29,30。Line28b的上调促进上皮细胞向未分化阶段的转化，并维持肿瘤细胞在此干细胞期的分化。31,32。在我们的研究中，我们确定Lin28b是miR-379-5p的直接靶点。与LINC 00665作为miR-379-5p海绵的功能相一致，我们发现miR-379-5p对Lin28b的抑制作用在LINC 00665的加入中被部分挽救。因此，LINC00665-miR-379-5p-Lin28b轴可能是乳腺肿瘤发生和发展的关键因素。

总之，我们证明LINC 00665在乳腺癌中起着癌基因的作用。LINC 00665促进乳腺癌的进展，并诱导EMT样表型。此外，LINC 00665通过miR-379-5p-Lin28b轴作为Cerna发挥乳腺癌的恶性特征。我们提出了一个模型，强调LINC 00665在乳腺癌进展过程中调节EMT的作用(图1)。7)。综上所述，我们的结果表明LINC00665-miR-379-5p-Lin28b轴是乳腺癌进展的关键因素，是乳腺癌治疗的一个很有前途的靶点。

LINC 00665在乳腺癌进展中的作用模型

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细胞培养

从中国科学院细胞库(上海)获得正常人乳腺上皮细胞系MCF10A、人胚肾细胞系293 FT和乳腺癌细胞系mcf 7、bt 474、bt 549、mda-mb-231、mda-mb-468和t47d。16。所有细胞株均经STRDNA分析证实为支原体阴性。

质粒、miRNAs和抗体

MIR-379-5P抑制剂，miR-379-5P模拟物，并以广州RiboBio为对照。合成了含有miR-379-5p结合位点的Lin28b和LINC 00665的3个ʹ-UTRs，并将其亚克隆到psiCHECK 2载体(Promega，Madison，WI，USA)中，分别构建了Lin28b-wt和LINC 00665-wt结构。利用QuikChange站点定向突变试剂盒(转基因，中国北京)，根据制造商的指示，生成Lin28b3ʹ-UTR突变体(Lin28b-mut)和LINC 00665-mut报告载体。合成了全长LINC 00665，并将其克隆到pcDNA3.1表达载体中。抗Vimentin抗体(D21H3)、抗N-cadherin(13A9)、抗E-cadherin(24E10)、抗-Lin28b(D4H1)和抗β-actin(8H10D10)。

稳定的LINC 00665-高表达细胞株的转染与构建

质粒或miRNAs分别按照制造商的指示，使用快速转染试剂(Promega)或FuGENE HD转染试剂(Promega)转染到不同的细胞系中。为建立过表达LINC 00665细胞株，将pcDNA3.1-LINC00665或空载体μg转染T47D细胞。细胞在含1000μg/mL G 418(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)的培养基中培养3周。用有限稀释法获得单克隆耐药细胞，并在添加500μg/mL G 418的培养基中保存。

WESTERNBLOTTING

用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒片的RIPA缓冲液(50 mm Tris，150 mm NaCl，0.5%EDTA，0.5%NP 40)提取总蛋白，并在12，000 rpm离心20 min。在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺梯度凝胶上负载50μg总蛋白。将这些蛋白转移到PVDF膜(Milli孔隙，Bedford，MA，USA)上，在室温下用5%的脱脂牛奶封闭1h，然后在4℃下与抗Lin28b、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin和β-actin的初级抗体共同孵育1小时(美国贝弗利市)。在室温下与辣根过氧化物酶结合二次抗体孵育1h，用ECL试剂检测蛋白质。

增殖试验

采用MTT法、edu法和平板集落形成法评价细胞增殖能力。33.

荧光原位杂交

对于FISH分析，根据制造商的建议，从RiboBio购买了FISH Kit。用RiboBio设计合成了荧光共轭型LINC 00665探针。细胞固定在4%甲醛中，用PBS洗涤。固定细胞在含0.5%TritonX-100的PBS中渗透，在预杂交缓冲液中预杂交。然后，在4°C的杂交缓冲液中，用50 nm的探针隔夜孵育细胞。第二天，用PBST洗涤细胞，用4‘，6-二氨基-2-苯环吲哚(DAPI)进行染色。

RNA提取和逆转录-定量PCR

从培养的细胞中提取总RNA。TM巴黎TM设备(生命技术)根据制造商的指示。利用TaqMan miRNA反转录试剂盒(LifeTechnologies)进行TaqmanRT-qPCR检测成熟miRNAs的表达。用GoTaq qPCR主混合(Promega)进行qPCR。每个基因的CT值按三重反应平均。基因表达由2。−ΔCT方法。

荧光素酶报告试验

荧光素酶报告试验用miR-379-5p模拟或模拟对照和1000 ng的Lin28b-wt/mut或LINC 00665 wt/mut共转染293 FT细胞。细胞接种于24孔板中，转染48h后收集。荧光素酶的活性是根据制造商的建议由双荧光素酶报告分析系统(Promega)确定的，如前所述。34。所有转染均一式三份。

Transwell和伤口愈合试验

细胞侵袭能力的评估在Transwell包被Matrigel(BD生物科学，圣地亚哥，CA，美国)如前所述。16。在伤口愈合实验中，细胞在6孔板中培养至70%-80%汇合，然后用200μ1无菌移植物针尖进行损伤。经PBS洗涤后，细胞在无血清培养基中培养。在每个时间点采集图像。

异种移植模型

雌性SCID小鼠(5周龄，每组5只)皮下注射肿瘤细胞(2×10)。6含有100μg Matrigel(BD生物科学)的细胞进入乳腺脂肪垫。用卡钳式仪器测量肿瘤细胞所形成的肿瘤，并根据以下公式计算肿瘤体积：体积(Mm)。3)=宽度2(毫米)2)×长度(Mm)/2。考虑动物福利，5周处死小鼠，测定肿瘤组织的最终体积和重量。所有动物研究均经天津医科大学肿瘤研究所和医院动物伦理委员会批准，并按照“癌症研究中动物福利和使用指南”和“国家法律”进行。

免疫组织化学

小鼠肿瘤在4°C下用4%多聚甲醛固定，然后用石蜡包埋。连续切片(2μm厚)与原抗体(抗Vimentin和抗E-cadherin)在室温下孵育2h，在室温下与抗小鼠HRP结合二次抗体孵育1h。用PBS冲洗三次后，用二氨基联苯胺染色，再用苏木精染色。

统计分析

数据作为平均±标准差从至少三个独立的实验。所有计算均用IBM SPSS统计软件进行(IBM公司，美国纽约州阿蒙克)。用学生的方法分析各组间的差异t-测试和P-数值<0.05被认为是有统计学意义的。