基于人类腺病毒(HAdV)载体的肿瘤病毒治疗(OV)在肿瘤转移的局部、腹腔内传递是可行的情况下，对晚期卵巢癌的治疗有着重要的应用前景，绕过了血管内传递的许多复杂性。以HAdV-C5为基础的OV的疗效由于缺乏肿瘤选择性而受到阻碍，肿瘤的主要受体HCAR在恶性转化过程中通常被下调。相反，叶酸受体α(frα)在卵巢癌细胞上高表达，为肿瘤选择性地提供病毒治疗提供了一个引人注目的靶点。在这里，我们确定了高亲和力的FRα结合寡肽的遗传掺入到HAdV-C5载体中.在噬菌体颗粒的背景下，生物鞣剂鉴定出一种12聚体线性肽DWSSWVYRDPQT和两种7-聚半胱氨酸约束肽CIGNSNTLC和CTVRTSAEC，它们与FRα结合。合成的铅肽CTVRTSAEC与FRα特异结合，可被叶酸竞争性抑制。为了评估已阐明的FRα结合寡肽靶向OV至FRα的能力，我们将这些肽基因整合到HAdV-C5纤维旋钮HI环中，包括基因烧蚀的HCAR相互作用载体中。不幸的是，由于FRα进入FRα后细胞内贩运缺陷，重组载体未能有效地靶向通过FRα进行转导。这表明，虽然所鉴定的多肽可能具有靶向药物传递的应用潜力，但它们需要对靶向病毒治疗应用进行进一步的改进。

卵巢癌是英国第六大最常见的癌症死亡原因，每年在英国造成4000多人死亡，全世界有15.2万人死亡。https://www.cancerresearchuk.org/health-professional/cancer-statistics/statistics-by-cancer-type/ovarian-cancer)。大约90%的卵巢癌起源于上皮，分为浆液性、黏液性或子宫内膜。1]。这种疾病通常在早期无症状，通常导致晚期病人的出现和诊断，5年生存率为46%。2]。以铂为基础的化疗是一线治疗；然而，患者往往会出现化疗耐药(https://www.cancerresearchuk.org/health-professional/cancer-statistics/statistics-by-cancer-type/ovarian-cancer) [2].

以腺病毒为基础的抗肿瘤病毒疗法具有很大的应用前景，因为它们能够在肿瘤内自我放大，诱导免疫细胞死亡，并表达病毒基因组内编码的治疗方式。在卵巢癌的情况下，其在临床上的应用尤其有吸引力，因为通过腹膜内途径对肿瘤转移进行局部分娩是可行的，可以绕过许多与血液输送相关的限制。迄今为止，HAdV-C5作为最常用的HAdV载体用于癌症基因治疗，由于缺乏对癌细胞的选择性，其疗效一直受到阻碍。3,4,5]。一种方法是识别细胞受体的配体，这些受体是在正常组织中低表达或缺失的肿瘤细胞中特有的或过度表达的。针对癌症的多肽具有靶向给药的潜力，可提高治疗效益，并将非靶点毒性降至最低[6]。在病毒治疗方面，将肿瘤靶向肽加入腺病毒纤维旋钮的HI环，即衣壳蛋白，与本地腺病毒受体柯萨奇腺病毒受体(Car)相互作用，是开发高亲和力、延迟hadv载体的合适的靶向策略。7]。最近，我们描述了一种基于肿瘤相关整合素(αvβ6)的“精确病毒疗法”的开发方法，该方法使用先前鉴定的20氨基酸αvβ6结合肽A20。合成病毒疗法，Ad5零-A20，显示了清除腹腔内卵巢癌模型中移植的SKOV 3卵巢癌的显著能力[8]。然而，αvβ6在大约33%的晚期卵巢癌中过度表达。9因此，大多数晚期卵巢癌患者可能无法接受针对αvβ6的精确病毒治疗。

抑制HAdV载体向叶酸受体α(FRα)的定向是治疗卵巢癌的一种很好的方法。FRα是一种糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定膜蛋白，结合和内化叶酸用于嘌呤和胸苷的生物合成、修复和甲基化。FRα具有肿瘤生长优势，与肿瘤的组织学分期、分级及整体生存率均呈正相关。在正常组织中，frα的表达严格局限于极化上皮细胞的根尖膜，在正常卵巢上皮中不表达，但在70%以上的原发性卵巢癌和80%的复发性卵巢癌中表达。10]。叶酸受体是叶酸受体纳米粒用于癌症检测和治疗的重要靶点。这类由聚合物、胶束、树状大分子和脂质体组成的叶酸纳米共轭物，在叶酸受体阳性癌细胞纳米粒子靶向的研究中有一定的应用前景，并在其他地方作了综述。11]。在病毒抑制叶酸受体的背景下，先前的一项研究表明，叶酸与小鼠Moloney白血病(逆转录病毒)载体的化学结合不能传递叶酸受体阳性细胞。虽然叶酸衍生病毒与细胞有显著的特异性结合，但病毒并没有被有效地内化，这可能是由于叶酸受体对病毒的内吞作用不佳，可能与病毒的本土性不相容所致。这表明，即使病毒与细胞膜紧密结合，也并非总能转化为有效的转导能力。12]。事实上，对于叶酸受体通路是否是纳米粒子和病毒载体的可行途径存在争议。工程腺病毒载体推迟到叶酸受体代表了一个很好的方法来解决这个问题。

噬菌体展示是一种筛选程序，用于阐明肽结合伙伴与某一特定目标的关系。13,14,15]。商业噬菌体库通常基于丝状噬菌体M13，通常由10个噬菌体组成。10随机肽序列表达为噬菌体外壳蛋白PIII的融合。对整个细胞的生物筛选需要与表达感兴趣靶点的细胞孵育噬菌体库，在用已知的受体相互作用激动剂特异性地洗脱与感兴趣的受体结合的噬菌体之前，先清除未结合的噬菌体。在随后的几轮生物选择中，洗脱噬菌体被收集、扩增和富集为目标特异性结合噬菌体。

编码病毒内每一肽的DNA与外壳蛋白上表达的肽有物理联系，从而快速阐明了目标结合肽的DNA序列。虽然一些临床前噬菌体展示研究显示有可能应用于肿瘤靶向肽[16, 17]，临床数据表明，在提高受体亲和力、酶不稳定性和药代动力学方面，需要进一步优化翻译成功。18, 19]。许多临床试验正在探索针对FRα的潜在治疗机会，并在其他地方进行了广泛的回顾[20]。FR单克隆抗体Farletuzumab(MORAB-003)显示出相互矛盾的疗效数据，但在评价叶酸结合药物Vintafolide(MK-8109，EC 145)的试验中效果有限。IMG 853(Mirvetuximab Soravtansine)是一种与细胞毒性药物结合的抗Frα抗体，目前正在进行一期临床试验。21]。与基于抗体的药物相比，小的肿瘤靶向肽具有体积小的优点，有可能容易渗透到组织中，降低免疫原性，易于合成和放大[18]。从噬菌体库中鉴定的用于HAdV抑制肿瘤血管的肽包括rgd结合的细胞整合素[22，NGR肽结合氨基肽酶N(APN)[23人表皮生长因子(EGFR)Ge11肽24]。基于hadv的病毒疗法可以很容易地进行基因改造，在腺病毒纤维旋钮蛋白的允许区域内加入针对肿瘤限制受体的多肽；然而，需要进一步改进，以克服与非目标摄取相关的临床疗效的限制[25].

本研究利用噬菌体展示库对SKOV 3卵巢癌细胞进行全细胞生物筛选，鉴定FRα特异性肽，并检测其在体外的结合特异性。为了评估产生一种针对FRα的“精确病毒疗法”的潜力，我们将FRα结合的寡肽基因整合到腺病毒纤维旋钮结构域的HI环中，并评价它们在体外向FRα定向病毒方向的能力。

细胞株

SKOV 3细胞(源于腹水的人卵巢腺癌)来源于美国型培养物(ATCC)。细胞在Dulbecco改良的Eagle‘s培养基(DMEM)中培养和保存，附加10%胎牛血清(FCS)，2mm。L谷氨酰胺、青霉素100 U/mL、链霉素100 g/mL。细胞保持在37°C和5%CO2。所有试剂都是从吉布科或热科学公司购买的(Paisley，英国)。细胞常规检测支原体(每3-6个月一次)。

SKOV 3细胞受体表达的流式细胞术分析

SKOV 3细胞密度为1.5×105在一个96井的平板中每口井的细胞。细胞用200 L的洗涤液(pbs/1%BSA)洗涤，与含1：500抗人抗人单克隆抗体(RmcB，Milli孔隙，Watford，UK)的100 L洗涤液，小鼠抗人单克隆抗叶酸结合蛋白抗体(克隆EPR 4708(2))(克隆EPR 4708(2))(克隆EPR 4708(2))或小鼠IgG控制抗体(德国海德堡圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz BioTechnology，Heidelberg，德国))孵育1h。细胞洗涤3次，用1：500稀释的山羊抗小鼠AlexaFluor 647抗体(英国Invitrogen)孵育30 min。细胞在4°C固定于4%多聚甲醛中20 min，共2×10。4门控事件在BD Accuri C6(BD生物科学，美国)流式细胞仪上的FL-4频道获得，数据用BD Accuri C6软件版本1.0.264.21(Becton Dickinson，美国)进行分析。流式细胞术分析CAR与FR结合情况，并与IgG同工型结合。

噬菌体库

−12博士、−7博士和−C7C噬菌体展示肽库是从新英格兰生物多样性图书馆购买的。随机十二肽(Ph.D.−12)和七肽(Ph.D.−7和Ph.D.−C7C)的组合文库与M13噬菌体的小外壳蛋白(PIII)融合。所显示的肽(分别为12-聚体和7-聚体)在PIII的N端表达.图书馆由1×10组成13空斑形成单位(PFU)/mL噬菌体(含10)9随机序列产生每个序列的100拷贝。

噬菌体生物筛选

5×10接种SKOV 3细胞5DMEM 6孔板，10%FCS，37°C，5%CO培养的细胞2。24h后，细胞冷却至4°C 30 min。细胞用冷PBS清洗两次。噬菌体库添加量为2×1011噬菌体总体积为1mL DMEM/1%BSA，4°C温和摇动1h，去除未结合噬菌体(4°C保存)。细胞在PBS/1%BSA中洗4次2 min。在PBS(100 g/mL)中加入1mL叶酸(Acros organics，Fisher Science，UK)洗脱结合噬菌体，在4°C下竞争抑制1h。噬菌体在4℃保存，待分析(未扩增洗脱液)。对未扩增的噬菌体进行标记，以确定每一轮生物筛选的成功与否。

噬菌体滴度

在37°C，150 rpm条件下，在罗里亚贝塔尼(LB)肉汤中用四环素隔夜培养一个ER 2738菌落。未扩增噬菌体十倍系列稀释液(10)1–104)在LB中，一夜之间就准备好并添加到ER 2738种培养物中。将噬菌体在室温下孵育1~5 min，转至含4°C琼脂糖顶3mL的试管中。在短暂的漩涡后，将细菌培养倒入预先加热的LB/IPTG/Xgal平板上，冷却5 min，第二天在37°C下孵育一夜，计数菌斑形成单位数。

噬菌体扩增

将ER 2738菌群与四环素在37°C，150 rpm的LB液中过夜培养，在20 mL LB中加入3mL的隔夜培养液，加入未扩增的洗脱液。37℃，150 rpm扩增噬菌体。培养以10，000 rpm(12，000×)离心。g)4°C培养20 min，上清液转入新鲜试管离心。上清液上清液80%(~19 mL)转入新鲜管，加入1/6体积(~3mL)PEG/NaCl。噬菌体在4℃下一夜沉淀。

PEG沉淀

PEG沉淀于10，000 rpm离心15 min，4°C离心15 min，上清液丢弃，再作短暂离心，去除残留上清液。噬菌体再悬浮于1mL TBS中，每分钟1，000转离心，4°C离心5 min，上清液经1/6体积(~166 L)PEG/NaCl沉淀，冰孵育30 min，4°C离心13，000 rpm，10 min离心，上清液丢弃，离心去除残留上清液。球团在0.025 NaN的200升中重新悬浮。3离心1 min，制成颗粒残留不溶性物质。在扩增的洗脱液中，将上清液转移到干净的管中。扩增后的洗脱液按上文所述，用10标记。8–1011扩增噬菌体洗脱液稀释液。

菌斑扩增纯化

未扩增的洗脱液如前所述。盘子在37℃下孵育不超过18h，取无菌吸管尖的蓝色斑块，室温下孵育2h。在LB中用ER 2738隔夜培养，在3mL LB中加入1：100稀释液(30L)。在37℃下培养一夜(不摇动)。共培养1.5mL，经14，000 rpm离心10 min后测序，500 L噬菌体上清液转入新鲜管，其余1 mL再离心，上清液80%转入新鲜管(扩增噬菌体库)。在200 L PEG/NaCl培养基中加入500 L噬菌体上清液，在室温下倒置混合培养10 min。噬菌体在4°C下离心10 min，4℃离心10 min，上清液丢弃，颗粒在100 L碘化物缓冲液中重新悬浮，大力敲打试管，加入250 L乙醇，室温孵育10 min，4°C离心10 min，上清液丢弃，70%乙醇洗涤，37℃干燥，小球再悬浮于Tris/EDTA中。直接测序共用5L。

肽合成

TVRTSAE含有硫醇基(TVRTSAEGGCGG)，由ArchieChem(UK)合成，与Alexa Fluor 647 C2 Maleimide(Thermo Fisher，UK)结合。TVRTSAE标记FITC(TVRTSAEGGCGG-COOH)是因诺瓦根(瑞典隆德)商业化合成的，转化为乙酸盐用于活细胞。用HPLC法和ESI-MS法分别测定肽的纯度和质量.

噬菌体结合试验

SKOV 3细胞接种于8井Nunc实验室-tek中。TMII室幻灯片(英国，热科学)，密度为2×104细胞/在300升DMEM中加入10%FCS，2mmL谷氨酰胺、青霉素100 U/mL、链霉素100 g/mL。细胞在5%CO中孵育2、37°C生长至~80%汇合度(24h)。细胞用PBS清洗两次，感染2×10。10PBS/1%BSA中噬菌体总体积为100μL，在LB/IPTG/Xgal平板上滴加隔夜培养，适当稀释。细胞在4℃孵育2h，用PBS/1%BSA/0.1%吐温-20冷洗5次，与小鼠抗M13抗体(AbCAM，ab9225)孵育1：50稀释，4℃下用1%BSA稀释1h，室温下用Alexa Fluor 488山羊抗小鼠(Invitrogen，A11017)孵育细胞，在室温下稀释1：2000。细胞经低温PBS/1%BSA洗涤4次，室温下用4%PFA固定20 min。用PBS冲洗细胞，用Invitrogen(Invitrogen)标记延长金刚石的切片。

TVRTSAE肽剂量反应及细胞结合的流式细胞仪分析

SKOV 3种子密度为1×10。5在一个96井的平板中每口井的细胞。细胞用200 L洗涤缓冲液(PBS/1%BSA)和100 L含100 M、300 M或500 M TVRTSAEGGCGG肽或PBS的100 L洗涤缓冲液(PBS/1%BSA)在4°C下洗涤1h。细胞在4°C下用4%多聚甲醛浸泡1 h，4°C固定20 min，共2×10。4门控事件在BD Accuri C6(BD生物科学，美国)流式细胞仪上的FL-4频道获得，数据用BD Accuri C6软件版本1.0.264.21(Becton Dickinson，美国)进行分析。流式细胞术分析TVRTSAEGGCGG与PBS的结合。

叶酸作用下TVRTSAE肽结合细胞的免疫荧光分析

SKOV 3细胞接种于8井Nunc实验室-tek中。TMII室幻灯片(英国，热科学)，密度为2×104细胞/在300升DMEM中加入10%FCS，2mmL谷氨酰胺、青霉素100 U/mL、链霉素100 g/mL。细胞在5%CO中孵育2，在37°C生长至80%左右汇合(24 H)。细胞用PBS洗涤两次，用0.5mm叶酸在PBS/1%BSA中孵育，或在4°C用总体积为300 L/孔的完全培养基孵育1h。细胞用PBS洗涤，用0.5mm FITC标记的TVRTSAEGGCGG-COOH肽在PBS/1%BSA中孵育，总体积为300 L/孔，4°C为1h。细胞经低温PBS/1%BSA洗涤4次，室温下用4%PFA固定20 min。用PBS冲洗细胞，用Invitrogen(Invitrogen)标记延长金刚石的切片。

含FRα结合肽的HAdV-C5纤维旋钮蛋白的预测模型

用瑞士人模型对含肽插入的HAdV-C5纤维旋钮的结构进行了模拟。26以HAdV-C5纤维旋钮蛋白为模板(PDB 6 HCN)的最佳晶体结构27]。结构在PyMol[28].

HAdV载体的产生

利用HAdV-C5荧光素酶表达的基因组，通过缺失早期基因(ΔE1/ΔE3)，使复制缺陷的HAdV基因组产生一组重组HAdV基因组，并通过AB环中S408E和P409A的突变，使腺病毒与CAR结合的KOI突变出现。将Frα特异性肽DWSSWVYRDPQT、CIGNSNTLC和CTVRTSAEC插入到纤维旋钮的HI环中，在AB环中通过S408E和P409A导入KO1突变。重组HAdV-C5基因组大肠杆菌菌株SW 102。首先在HAdV-C5基因组中插入一个SACB选择盒，然后用每个代表FRα特异性肽的寡核苷酸序列替换。DNA的提取和纯化采用微型制备法(Chiagen)进行.采用扩增HI-Fi PCR技术，筛选出含有100 bp同源性臂的盒体和寡核苷酸(Roche应用科学，英国)。对正确克隆序列的确认通过直接DNA测序证实了使用商业测序服务。

为产生腺病毒，在10 mL培养8h内扩增出小片段DNA，隔夜加入250 mL培养物中。用BacMax 100试剂盒(Macherey-Nagel，Duren，德国)进行纯化，并在T25组织培养瓶中转染T-Rex-293细胞。细胞病变效应(CPE)产生后，用四氯乙烯对细胞进行颗粒化和病毒提取(Fisher Science，Loughborough，UK)。用5×T 150合流T-Rex-293瓶对病毒进行扩增。用两轮氯化铯(CSCL)梯度离心纯化病毒。对含10%甘油、10 mm Tris-HCl(pH 7.8)、135 mm NaCl和1mm MgCl的缓冲液进行透析，将CSCL从病毒中去除。2·6H2在1μg蛋白等于4×10的前提下，用微量二异氰酸酯(BCA)法测定O.病毒滴度。9病毒粒子(VP)

WESTERNBLOTTING

采用Westernblotting方法检测含肽插入的HAdV-C5纤维旋钮蛋白的结构完整性。共计1×1010用SDS-PAGE在预制的10%NuPAGE聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Paisley，UK)上运行VP/病毒库，通过半干法将其转移到HyBond-P-硝基纤维素膜(GE Healthcare Life Sciences，Little Chalfonn，UK)上。硝化棉膜用5mL的皮尔斯米塞尔抗体扩张剂(热科学)处理10 min，用蒸馏水冲洗7次。在含0.05%吐温-20和0.05%Triton X-100(TBS-T)的5%乳中，4°C隔夜阻断膜。在37℃下，将原代抗腺病毒纤维抗体4D2(AbCAM，ab3233)(1：2000)孵育1 h，用TBS-T洗涤5 min，用抗小鼠IgG-HRP结合物(1：2000；英国温布利生物技术有限公司)在室温下孵育1h。在TBS-T中再洗涤5分钟后，在超级信号西皮科化学发光基质(Thermo Science)中孵育10分钟，并在GelDoc autoChemi照相机(英国剑桥紫罗兰制品有限公司)上进行分析。

腺病毒介导的体外细胞转导

简而言之，细胞的密度为2×10。4细胞/井在96井板中。24小时后，细胞感染荧光素酶表达的hadv载体，剂量为5000 vp/细胞，总体积为100 vr无血清培养基，并在5%CO浓度下孵育。2取37°C培养3h，用2 0 0μL的完全培养基(RPMI 16 4 0+10%(v/v)FCS、10 0 U/mL青霉素、10 0 g/mL链霉素)代培养45h，细胞在1X细胞培养液(Promega，UK)中溶解，在−70°C冷冻，解冻细胞，用10 0L荧光素酶分析试剂在白色96孔板中混合。用多模平板阅读器(FLUOSTAR Omega，BMG LabTech，Aylesbury，UK)立即测定相对光单位(RLU)中的荧光素酶活性。用BCA法测定RLU/mg蛋白中总蛋白含量。总计2×104如前所述，门控事件在BD Accuri C6上的FL-1通道中被获取。

腺病毒标记与共聚焦显微镜

腺病毒颗粒在10%甘油/100 NM NaHCO中与过量20倍的Alexa Fluor 488-TFP(分子探针)在室温下孵育1.5h。3/PBS缓冲液，pH 7.2。用PBS缓冲液中的10%甘油交换缓冲液，用两个ZIBA自旋脱盐柱(Pierce)去除标记病毒中的未结合染料。

SKOV 3细胞接种于24孔板上，密度为2×10。4细胞/很好。2天后，在无血清培养基中加入标记腺病毒(250，000 VP/细胞)，在冰上孵育45 min。将细胞转移到37°C，30或60 min后固定(2%多聚甲醛，室温12 min)，渗透(0.1%Triton X-100，室温2 min)，与Alexa Fluor 555 Phalloidin(Thermo Fisher)孵育。用含DAPI的南方生物技术(FluoromountG，SouthernBiotech)标记细胞核。采用63×物镜的Leica TCS SP8显微镜进行成像。利用LAX(Leica Microsystems，德国)软件对这些图像进行了分析，它们显示出最大的共焦堆栈投影。

统计分析

如有关图图所示，数据以一式三份或一式四份的形式进行。所有分析和图表都是在GraphPad Prism版本6.03中创建的(GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA，USA)。P≤0.0 5值被认为具有统计学意义。

FRα结合肽的鉴定

流式细胞仪首次证实Frα在SKOV 3细胞上的表达。1A)以确保这是适合我们的生物筛选策略的细胞株。将−7(7-mer)、Ph.D.−C7C(7-mer)和Ph.D.−12(12-mer)噬菌体展示库分别在SKOV 3细胞上孵育，用叶酸(100μg/mL)洗脱，以规避FRα特异性结合肽。共进行了6轮生物筛选。随机抽取噬菌体克隆，进行DNA测序鉴定。12-mer和7-mer(Ph.D.−C7C)库的一致性序列如表所示1。线性7-聚体文库(博士−7)未能识别出任何一致的序列.每一轮淘洗后，对噬菌体进行命名，以确定噬菌体的回收率。噬菌体呈现肽的同源溶液被用于SKOV 3细胞的结合研究。1B)并计算了相对于无插入噬菌体的折叠变化(图二)。1C)。CTVRTSAEC噬菌体对SKOV 3细胞的回收率最高，其次为CIGNSNTLC。为进一步评价表达铅肽序列CTVRTSAEC、CIGNSNTLC和DWSSWVYRDPQT的噬菌体克隆与SKOV 3细胞体外结合的情况，在SKOV 3细胞上孵育同源噬菌体溶液，用抗M13抗体检测其结合情况。免疫细胞化学分析表明，显示CIGNSNTLC、DWSSWVYRDPQT的噬菌体，尤其是CTVRTSAEC与SKOV 3细胞的结合能力优于对照噬菌体。1D).

aSKOV 3细胞FRα表达的特征b叶酸洗脱SKOV 3细胞噬菌体肽的回收。叶酸洗脱的SKOV 3细胞中均质噬菌体克隆的细胞结合c折叠变化相对插入-无噬菌体。杆代表平均±S.D.#P≤0.05与DRLADGV(非共识)对照肽.*P≤0.05与无插入对照肽。d噬菌体克隆体外结合SKOV 3细胞。7-聚环噬菌体肽(CTVRTSAEC，CIGNSNTLC)和12-聚体线性肽(DWSSWVYRDPQT)与SKOV 3细胞结合。细胞感染2×1010噬菌体的PFU为4℃，用抗M13抗体检测。以一个空(无插入)噬菌体克隆作为对照。

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TVRTSAE结合SKOV 3细胞的评价

为了确定TVRTSAE肽是否在噬菌体病毒的约束下与SKOV 3细胞结合，将Alexa Fluor 647标记肽(TVRTSAEGGCGG)在100 M、300 M和500 M的作用下与SKOV 3细胞结合，用流式细胞仪检测细胞结合情况(图1)。2A)。数据显示，随着肽剂量的增加，SKOV 3细胞的结合量也相应增加。不使用任何肽(PBS)作为对照。为证实TVRTSAE肽通过FRα与SKOV 3细胞结合，检测了TVRTSAEGGCGG-COOH(500 M)对SKOV 3细胞的竞争性抑制作用。叶酸(0.45M)是FRα的天然配体。用免疫细胞化学方法测定叶酸预处理细胞后，肽结合被阻止(如图1所示)。2B).

a合成的与SKOV 3细胞结合的TVRTSAE肽随着肽浓度的升高而增加。用不同浓度的多肽(100、300、500μm)在4°C下孵育SKOV 3细胞1h，用流式细胞仪进行分析。用PBS作为无肽对照。bFITC-TVRTSAE肽通过FRα与SKOV 3细胞结合.典型的免疫荧光图像显示FITC-TVRTSAE肽与SKOV 3细胞结合.FITC标记的TVRTSAEGGCGG-COOH肽(0.5mm)在PBS/1%BSA的SKOV 3细胞上孵育1h。叶酸(0.5mm)作用于PBS/1%BSA的细胞在4℃下孵育1h，再用肽(下板)处理。

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含FRα结合寡肽的HAdV-C5纤维旋钮蛋白的预测结构模型

为了评估FRα结合寡肽基因掺入到HAdV-C5纤维旋钮蛋白中的可能性，我们对预测的结构进行了建模分析(图1)。3)。用瑞士人模型模拟了含有每个肽插入的HAdV-C5旋钮蛋白(基于PDB6HCN)的结构，并用PyMol对其结构进行了可视化。每个结构都是在野生型HAdV-C5纤维旋钮蛋白中模拟的，以及在纤维旋钮AB环中包含两个突变体S408E和P409A的汽车结合消融突变体。由此得到的结构表明，肽插入是以一种远离纤维旋钮蛋白的方式以有利于受体相互作用的方式呈现的。肽插入与纤维旋钮蛋白中的假定的CAR结合位点有很远的距离。因此，预测的结构使人相信，合成的载体应该是可行的，并以一种与受体结合的方式呈现FR、α-相互作用的寡肽。

与CAR结合有关的突变残基(KO1突变、408 S、409 p、蓝棒)与腺病毒5纤维旋钮三聚体(腺病毒5纤维旋钮三聚体)的插入位点(绿色表面)相距较远。a)居住在单体单元的横向部分(b)。含有肽的三聚体(白条、红表面)DWSSWVYRDPQT(c)，CIGNSNTLC(d)和CTVRTSAEC(e)在三聚体纤维旋钮蛋白中突出显示(红色)。在纤维旋钮的单体单元中，肽(红色卡通)DWSSWVYRDPQT(f)，CIGNSNTLC(g)和CTVRTSAEC(h)是形象化的，似乎有不同的确认。

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HAdV-C5载体在纤维旋钮蛋白中整合FRα特异性肽的基因工程

我们开发了一组延迟的hadv载体，将腺病毒纤维旋钮中的frα肽结合序列作为一种选择性靶向frα的方法。2)。重定向HAdV是由前面描述的Adz同源重组产生的[29]。缺失E1和E3基因(∆E1/∆E3)使HAdV-C5亲本载体复制缺陷。肽序列被整合到hadv-c5纤维旋钮结构域HI环的hadv-c5基因组中。2)由于这个区域是允许加入肽的[30]。通过将点突变S408E和P409A(KO1)纳入纤维旋钮结构域的AB环中，开发了自结合烧蚀HAdV-C5载体(表)。2)。这样的KO1突变排除了腺病毒与细胞进入CAR的天然受体之间的相互作用[31]。在同源重组区域和侧翼区域对HAdV基因组直接测序证实了正确的腺病毒基因组序列(如图所示)。4A)。采用Westernblot方法检测含肽插入的延迟HAdV纤维旋钮的结构完整性。4B)。所有重定向的HAdV纤维旋钮在60 kDa处显示出一个明显的带，与完整的HAdV纤维旋钮一致。

a直接测序得到重组HAdV-C5和HAdV-C5.KO1载体，证实肽整合成功。核苷酸翻译成氨基酸序列用斜体表示。b用抗腺病毒纤维单体和三聚体的单克隆抗体[4D2]证实重组Ad纤维旋钮的结构完整性。为了简单起见，图中的HAdV-C5缩写为Ad5。

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FRα阻滞HAdV载体转导的评价

我们测试了我们的HAdV矢量面板在换能车中的效率。低层/FRα-阳性的SKOV 3细胞。不幸的是，我们的数据表明，与亲本HAdV-5载体相比，FRα结合寡肽的掺入并不能显著增强FRα的转导。5)，而不管父母病毒的装车状态如何。未经修饰的对照HAdV 5的荧光素酶表达量为9.8×10。4RLU/mg蛋白、病毒HAdV-C5.DWSS、HAdV-C5.IGN和HAdV-C5.TVR达到4.36×10水平。4，4.59×104和4.68×104RLU/mg蛋白。同样，HAdV-C5.KO1型控制病毒的荧光素酶表达量为2.87×10。4RLU/mg蛋白，而病毒HAdV-C5.KO1.DWSS、HAdV-C5.KO1.IGN和HAdV-C5.KO1.TVR达到3.95×10水平。4，3.1×104和1.36×104RLU/mg蛋白。

a流式细胞仪检测SKOV 3细胞受体的表达。b用荧光素酶表达HAdV-C5、HAdV-C5.DWSS、HAdV-C5.IGN、HAdV-C5.TVR、HAdV-C5.KO1、HAdV-C5.KO1 DWSS、HAdV-C5.KO1.IGN或HAdV-C5.KO1.TVR 5×10转染SKOV 3细胞。3VP/细胞在无血清培养基存在下。感染48 h后用荧光素酶活性测定细胞转导，双软骨酸法(RLU/mg)测定细胞内蛋白质含量。数据表示为每个三份样本的平均RLU/mg蛋白±S.D。n=4项实验)。为了简单起见，图中的HAdV-C5缩写为Ad5。

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FRα阻滞腺病毒载体细胞结合和转运的评价

为了评估FRα阻滞腺病毒载体所观察到的有限转导能力是否是由于细胞与FRα结合的缺陷或病毒进入后细胞内贩运途径受损所致，我们使用荧光标记的HAdV-C5载体进行了共聚焦成像研究。我们将这一分析局限于纯汽车连接的HAdV-C5载体和完全的FRα重定向载体HAdV-C5.KO1.TVR。病毒附着和贩运的共聚焦成像显示，FRα重定向的HAdV.KO1.TVR载体比汽车介导的HAdV-C5载体更有效地附着和内化到Skov-3细胞中。6)。这可能是由于Skov-3细胞上的CAR表达水平相对较低所致(如图所示)。5A)与高水平表达的FRα进行比较。1A)。观察到内化的HAdV-C5能有效地向微管组织中心(MTOC)输送，并在核周区累积60 min。相反，FRα内化了HAdV-C5.KO1.TVR似乎无法有效地传输到mtc或核周区域。综上所述，这些数据表明，虽然frα阻滞的病毒载体似乎与细胞结合和摄取兼容，但通过frα进入并不符合病毒进入后的有效传播，从而导致病毒没有效率地传递到核孔复合体(Npc)。

细胞与250，000 VP/细胞在无血清培养基中孵育，在冰上孵育45 min。细胞转移至37°C，0、30、60 min后传代。有代表性的免疫荧光图像显示。绿色；Alexa Fluor 488标记HAdV-C5或HAdV-C5.KO1.TVR；蓝核DAPI染色；红-肌动蛋白细胞骨架染色Alexa Fluor 555 Phalloidin。为了简单起见，图中的HAdV-C5缩写为Ad5。

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Hadv-c5是最常用的hadv载体，用于基因和病毒治疗；然而，hadv-c5的临床应用受到以下因素的严重影响：缺乏肿瘤特异性、预先存在的抗体中和以及与凝血因子的相互作用将腺病毒隔离到肝脏[24, 32,33,34,35,36,37,38,39,40]。为了提高HAdV载体对卵巢癌细胞的特异性，我们开发了一组抑制FRα的载体。肽被遗传地结合在HAdV-C5纤维旋钮HI环的一个允许区域，HAdV-C5纤维旋钮是参与细胞结合的衣壳蛋白。噬菌体展示是一种强有力的技术，可用于确定癌细胞中各种靶标的靶向配体。41].

我们鉴定了三种噬菌体肽DWSSWVYRDPQT、CIGNSNTLC和CTVRTSAEC，它们在体外与SKOV 3细胞具有结合特异性。SKOV 3细胞噬菌体回收鉴定CTVRTSAEC为铅肽。我们发现合成的TVRTSAE肽与SKOV 3细胞呈剂量依赖性结合，并通过FRα结合，因为FRα配体叶酸预处理后结合受到抑制。在类似的研究中，肽MHTAPGWGYRLS被确定为FRα特异性肽，使用相同的Ph.D-12噬菌体展示库对SKOV 3细胞进行生物筛选。42]。SWQIGGN肽在体外对卵巢癌细胞HO8910有抑制作用，抑制细胞活力、迁移侵袭和细胞粘附。SWQIGGN肽处理BALBC/c裸鼠腹腔注射HO 8910细胞与对照组相比，体内腹水量减少，肿瘤结节形成减少。43]。肽NPMIRRQ也被报道为卵巢癌细胞HO 8910的特异性结合剂[44]在靶细胞结合肽序列中显示可塑性。据我们所知，我们的研究是第一次从噬菌体展示生物筛选中鉴定CTVRTSAEC肽。一种类似的肽CTVRT南共体，与谷氨酰胺替代天冬氨酸(两种带电氨基酸)不同，在体内专门针对前列腺癌细胞。45]。与本研究中相同的Ph.D-C7C噬菌体库用于前列腺癌组织上皮间充质转换(EMT)标记物-B型纤维连接蛋白(EDB-FFN)。Cy5标记的CTVRT南共体在裸鼠体内和体外对前列腺癌(PC3)细胞的EDB-纤维连接蛋白表达增强。有趣的是，TVRTSAD和在此发现的线性IGNSNTL版本的CIGNSNTLC肽在活体小鼠模型中以人肺癌细胞为靶标。46]。将A 549来源的异种移植瘤小鼠经尾静脉静脉注射−C7C噬菌体库。从切除肿瘤中筛选出噬菌体克隆。TVRTSAD和IGNSNTL肽都是最常见的噬菌体肽，但当用Cy5.5标记肽并注射到同一小鼠模型的尾静脉时，则是最常见的噬菌体肽。虽然这两种多肽对A 549异种移植物肿瘤都有特异性的靶向作用，但它们在肿瘤中的累积量不如其他候选肽，因此没有得到进一步的研究。

本研究所鉴定的DWSSWVYRDPQT肽在体外以结肠癌细胞为靶点，经硅分析提示该肽靶点为圣公会-3(肝素硫酸蛋白多糖(HSPG))。47]。我们用SAROTUP(靶非相关肽的扫描器和报告者)对本研究中鉴定的所有肽进行了检查。DWSSWVYRDPQT肽被认为是一种潜在的假阳性肽，其中WXXW序列与与目标没有实际亲和力的塑料结合，而是与(塑料表面)固相结合。48]，尽管来自其他方面的数据[47)会提出相反的建议。

我们通过将每个噬菌体肽基因导入腺病毒纤维旋钮的HI环，即衣壳蛋白与本地腺病毒受体CAR相互作用，开发了一组延迟的HAdV载体，并考虑了一个合适的靶向位点。49, 50]。我们评估了HAdV-C5重组载体是否具有KO1突变背景，从而排除了腺病毒与本国CAR的相互作用。我们的数据表明，除HAdV-C5.KO1外，所有推迟的HAdV载体，无论是否与CAR结合，SKOV 3细胞与亲本HAdV-C5相比，转导能力较差。这些数据与一项类似的研究相一致，该研究将从体内噬菌体中分离出的已知肿瘤靶向肽RGD、NGR和ASL整合到HAdV-5的HI循环中。hadv载体通过在HI环中加入肽而被阻滞，并以car和hspg突变作为非靶向载体，与无肽插入的非靶向载体相比，在一些低car表达的细胞类型的转导上有极小的改善，在某些情况下，减弱了腺病毒的转导[51]。其他研究表明，将rgd基序整合到HI循环中可以减少本地CAR的结合[52]。他们的发现的一个可能的解释是所呈现的肽的构象结构。HAdV载体表达环化NGR肽(由半胱氨酸残基和确定循环结构的二硫键形成)的HAdV载体能使腺病毒进入APN，而含有线性NGR肽的HAdV载体将腺病毒转化为氨基肽酶N(尽管亲和力较低)[23]。这是一个可能的解释，为什么被阐明的肽可能无法在噬菌体病毒蛋白的背景下有效地靶向，而噬菌体肽是从噬菌体病毒蛋白中筛选出来的。另一种解释是，纤维旋钮蛋白内肽的呈现可能与细胞表面的受体连接相兼容，但细胞进入的路径与内化病毒的高效率进入后贩运不相容。有趣的是，我们对标记的HAdV-C5和HAdV-C5.KO1的共焦分析似乎证明了后者是这样的。本研究中产生的Frα阻滞载体与FRα介导的细胞附着和内化有明显的相容性，但在细胞内转运后存在缺陷，导致整体转导效率低下。

总之，我们证明TVRTSAE肽在体外与SKOV 3细胞结合FRα，可能是通过脂质体或其他病毒或非病毒基因转移应用于多肽结合药物或基因传递的潜在平台。在延迟HAdVS的背景下，由于细胞内转运缺陷，我们的多肽组未能增强FRα介导的SKOV 3细胞的转导。需要进一步研究FR、α重定向的HAdV载体的缺陷贩运的原因。