正常的免疫反应、液体平衡和脂类再吸收都需要淋巴系统的正常运作。多种调控机制被用来确保淋巴管的正确形成和功能；然而，参与这一过程的表观遗传调控因子和机制却鲜为人知。在此，我们评估了组蛋白H3赖氨酸(K)79(H3K79)甲基转移酶DOT1L在淋巴形成中的调节作用。基因消融DOT1L在Tie 2(+)内皮细胞(ECs)中，而在LYVE 1(+)或Prox 1(+)淋巴管内皮细胞(LECs)或Vav1(+)最终造血干细胞中，则会导致灾难性的淋巴异常，包括皮肤水肿、血液淋巴混合和多器官淋巴管发育不全。值得注意的是，Tie 2(+)ECs靶向DOT1L丢失会导致完全穿透性淋巴管发育不全，而DOT1L在同一细胞中过度表达导致肠系膜部分增生淋巴管。遗传学研究表明，在肠系膜淋巴管形成过程中，DOT1L在c-Kit(+)血源性ECs中起着重要的作用。机械地说，DOT1L的失活会导致H3K79me2水平的降低以及对LEC的发育和功能重要的基因的表达。因此，我们的研究证实DOT1L介导的LEC祖细胞的表观遗传启动和转录调控保护淋巴管的正常发育和功能。

淋巴系统在免疫监测和调节体液平衡和脂类再吸收中起着重要的作用。1,2。淋巴管生物学中一个重要的问题仍然没有得到很好的解决，那就是协调淋巴管内皮细胞(LEC)的发育和功能的表观遗传机制。尽管最近的研究表明器官特异性的lecs有一个独特的来源。3,4,5,6人们普遍认为，在小鼠胚胎大约9.5天(E9.5)，起源于主静脉(CV)内皮细胞(Ecs)的极化蛋白1(Prox 1)的出现。7,8。LECs的发育受到多种转录因子调控机制的严格控制，如性别决定区Y(SRY)-方框18(Sox 18)。9,10，核受体亚家族2，F组，成员2(Nr2f2，又称政变-TFII)11，以及普洛斯彼罗同源盒1(Prox 1)8,12，以及血管内皮生长因子C(VEGFC)-血管内皮生长因子受体3(VEGFR 3)信号通路。13,14,15,16。Sox 18与PROX 1启动子激活其表达9，而nr2f2与prox 1相互作用并调节其活性。17,18。淋巴管生成因子VEGFR 3通过一个阳性的prox 1-VEGFR 3反馈环被证明是维持lec祖细胞中prox 1表达所必需的。12。系-致力于LECs从CV中萌芽，并开始迁移到高浓度的VEGFC，形成原始的淋巴囊。LECs中VEGFC-VEGFR 3轴的部分或完全阻塞会引起各种淋巴缺陷，包括皮肤和肠系膜无瘤淋巴管、皮肤水肿和Prox 1(+)LEC祖细胞的异常迁移。16,19。淋巴瓣膜畸形导致血液淋巴分离不当，导致血液-淋巴混合.已鉴定出许多涉及这些过程的基因，包括叉头盒C2(FOXC 2)20,21，GATA-结合蛋白2(GATA 2)22, PROX 121，间隙连接蛋白，α4(GJA 4)21,23，以及整合素α9(Itga 9)24。研究表明，基因突变或关键淋巴基因的异常调控与人类淋巴疾病有关。25,26.

此外，新的证据表明淋巴的发育和功能也可能受到表观遗传的调节。27,28。Brahma相关基因1(BRG 1)是一种ATP依赖的染色质重构因子，在发育中的静脉中调控Nr2f2的表达。另一种染色质重塑因子，染色质结构域解旋酶dna结合蛋白4(Chd 4)，通过调节尿激酶纤溶酶原激活物受体(乌帕尔)表达27。此外，组蛋白去乙酰化酶3(HDAC 3)功能是通过调节淋巴管形成来实现的。GATA 2剪切应力响应表达式29。最近，组蛋白乙酰转移酶p 300被证明通过激活对血液EC(BEC)-LEC分化过程至关重要的淋巴基因来促进LEC的规范。30。然而，组蛋白甲基化在LEC发展和功能中的作用尚不清楚。

端粒沉默1-样[DOT1L，又称赖氨酸甲基转移酶4(KMT 4)]的干扰物是一种组蛋白H3赖氨酸79(H3K79)甲基转移酶，在包括心脏在内的各种器官的稳态中起着关键作用。31和软骨32、造血33,34,35，以及单元重编程36。以往的研究表明，人DOT1L与白血病融合蛋白的相互作用与白血病的发生有关。37,38,39，而这个组织DOT1L基因敲除(Ko)导致胚胎死亡，原因是胚胎外血管网的形成有缺陷。34,40。然而，对于导致这种血管表型的细胞类型，以及DOT1L是否参与其他血管类型的形成，包括胚胎血管和淋巴管的形成，还知之甚少。在此，我们证明了DOT1L对LEC祖细胞的表观遗传启动通过控制对LEC发育和瓣膜形成起重要作用的基因的表达，使其具有精确的发育和功能。因此，本研究建立了另一种参与LEC发展和功能的调控机制。

Tie 2(+)细胞DOT1L丢失导致恶性淋巴异常

此前的研究表明，DOT1L缺乏可导致妊娠中期胚胎死亡，导致卵黄囊血管发育不良和心肌肥大。31,40。为了解DOT1L在ECs中的作用，对一株携带DOT1L的复合小鼠胚胎血管发育进行了研究。DOT1L−/−;Tie2-CRE；R26R(补充图。S1a，d)。与之前的报道一致，在E9.5和10.5(补充图)的突变脑中，更少的分支和更多的杂乱无章和扩张的血管，如Lacz报告所示。S1a，b)40。CD 31的整体免疫染色和血管分支点的定量进一步证实了这一观察结果(附图)。S1c，d)。为了探讨血管发育受损的基础，我们研究了带条件的小鼠对DOT1L功能的BEC自主作用。DOT1L带有TG的等位基因(Tie2-CRE)菌株DOT1LΔEC老鼠。出乎意料，DOT1LΔEC胚胎在E12.5之前发育正常，没有明显的血管形成缺陷(附图)。S1E-g)，表明E9.5/10.5中观察到的血管表型DOT1L−/−胚胎最有可能是由BEC无关的DOT1L活性引起的。然而，从E13.5开始，DOT1LΔEC动物表现出致命性，皮肤上有严重的水肿和类似出血的斑点，尤其是在颈部(见图)。1A)。这些表型在后期变得更加严重，并且存活下来。DOT1LΔEC新生儿出现乳糜性腹水。1B)；没有一人活过3周(补充表)沙一)。免疫组织化学及用抗-emcn、抗-tl 119和抗-lyve 1抗体进行的全程免疫染色显示，DOT1LΔEC在E15.5和E17.5时，导致包括心脏、膈肌和肠系膜在内的多器官的皮肤水肿和充满血液的低增生淋巴管(图1)。1C；补充图。2A-f)。在突变小鼠的肠系膜(空肠至回肠)可见淋巴管发育不全(分别为7枚或<50%LYVE 1(+)淋巴管)。1E，f)。突变小鼠肠系膜囊内淋巴管与正常小鼠比较也有显着性差异(图1)。1E)。免疫荧光染色证实肠系膜淋巴表型与其他LEC标记物相一致，包括prox-1、NRP 2和VEGFR 3(数据未显示)。然而，DOT1L的丢失对皮肤淋巴管的形成几乎没有影响(补充图1)。S2g，h)。这些数据表明，在历史上表达Tie 2的细胞中，DOT1L的丢失会导致淋巴管而不是血管的缺陷。

a, b有代表性的DOT1L∆EC控制胚胎E13.5-15.5和新生儿。标尺=2毫米。P1：产后第1天。cE15.5胚胎免疫组化分析EMECn(棕色)和LYVE 1(红色)在对照和DOT1L∆EC老鼠。白色矩形表示右侧面板上的放大图像。标尺=500米。放大图像的刻度条=100公厘。箭头：皮肤水肿。dE15.5胸骨中抗T 119和LYVE 1抗体的全贴装共焦图像。标尺=100公厘。e抗LYVE 1和抗Emcn抗体染色的E17.5胚胎的全屏共焦图像。LYVE 1阳性点：巨噬细胞。标尺=200公厘。fE17.5肠系膜LYVE 1(+)覆盖率的定量研究DOT1L∆EC (n=11)及少管(n=15)胚胎。

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DOT1L ΔEC损害淋巴管形成

鉴于不正常的淋巴管形成会引起血液-淋巴混合，我们接下来要研究的是DOT1L在淋巴管形成中的作用，而不是DOT1LΔEC小鼠作为多器官淋巴管的形成，在小鼠体内是受损的。因此，DOT1L暂时取消了使用一个健壮的诱导CRE驱动器，rosa 26-克里尔DOT1L伊科对小鼠和肠系膜淋巴管进行检查。自本构KODOT1L我们首先确定了对胚胎存活影响最小的他莫昔芬(TM)剂量，最佳剂量为E9.5胚胎0.5 mg/25 g，E10.5~13.5 1.25 mg/25 g，因为E9.5高剂量(1.25 mg/25 g)可导致E14.5~15.5的胚胎完全死亡。在E9.5注射低剂量(0.5mg/25g)后，近一半的E17.5突变胚胎表现为肠系膜淋巴管低塑性(≥50%覆盖率的7个胚胎中有3个)，而在较高的TM剂量下，E10.5时肠系膜出现严重且频繁的淋巴管发育不全(8个胚胎中有6个胚胎覆盖率<50%，8个胚胎中有2个胚胎的≥覆盖率为50%)。当这个剂量的TM在后期注射时，表型得到缓解(在E11.5时注射10个胚胎中有7个胚胎，E12.5胚胎中有1个胚胎，E13.5没有胚胎)(见图)。2A，b)。然后，为了便于评估DOT1L调节淋巴管形成的Tie 2(+)细胞，从E11.5TM注入的肠系膜中提取了E17.5肠系膜。DOT1L伊科用免疫荧光法分析小鼠抗Prox 1和抗LYVE 1抗体，然后进行形态计量学分析。如图所示。2C，d中发现的淋巴管数目明显减少。DOT1L伊科肠系膜淋巴管。

aE17.5胚胎(上面板，标度为2mm)及其抗LYVE 1和抗-Emcn抗体的全身免疫荧光染色(下板)在单个TM注射后(E9.5和E10.5胚胎分别为0.5mg和1.25mg)的大体概况。标尺=200公厘。bTm注射E17.5中LYVE 1(+)淋巴覆盖的定量研究DOT1L伊科肠系膜(n=3-16个胚胎/组)。c, dE17.5型淋巴管典型免疫荧光图像及形态计量学分析DOT1L伊科E11.5注射TM后肠系膜病变。绿色：LYVE 1。红色：PROX 1。数据以平均值±S.E.M表示。*p-≤值为0.05。

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LEC祖细胞中的DOT1L启动是适当的LEC发展所必需的。

由于Tie 2(+)细胞可以发育为LECs、HSCs和BECs，我们接下来将确定是否在DOT1LΔEC小鼠是由LECs或HSCs缺乏DOT1L所致。为此，携带条件的老鼠DOT1L等位基因与一位特定于LEC的CRE司机杂交，LYVE 1EGFP/CRE，以生成DOT1LΔLEC菌株(图1.3A)。有趣的是，LYVE 1EGFP/CRE-介导的DOT1L缺失既没有引起胚胎死亡，也没有引起观察到的淋巴表型。DOT1LΔEC老鼠(图1.3B). DOT1LΔLEC小鼠按预期孟德尔比例出生，出生后健康。缺乏淋巴表型DOT1LΔLEC并不是因为cre重组酶效率低下，如LYVE 1EGFP/CRE在E10.5 CV BECs及邻近LECs和E17.5肠系膜淋巴管中显示预期的CRE活性(补充图)。S3A，b)。为了证实这一观察，老鼠携带DOT1L条件等位基因与另一种LEC特异性诱导CRE驱动器TG(PROX 1-CreerT2)，以生成DOT1LIΔLEC应变。E17.5无DOT1LIΔLEC胚胎显示淋巴管缺损DOT1LΔEC4-羟基他莫昔芬(4-OHT)连续给药2天后，分别给E9.5/E10.5或E10.5/E11.5。3C，d).

a, c, e有代表性的胚胎图像(标度为2mm)和LYVE 1染色的肠系膜淋巴管(标度为200米)：DOT1L∆LEC (a，E14.5和17.5)，DOT1LI∆LEC (c，E17.5)，以及DOT1L∆DHSc (e、E14.5和17.5)。b, d, fE17.5中LYVE 1(+)淋巴管覆盖的定量研究DOT1L∆LEC (b、控制=8、KO=9)及DOT1LI∆LEC (d，对照组=8，KO=10和3)胚胎经4-OHT处理后分别为E9.5/10.5和E10.5/11.5，E17.5。DOT1L∆DHSc (f、对照=10、KO=11)胚胎。

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鉴于Vav1(+)dHSCs对心脏淋巴管的发展有贡献3接下来，我们用TG分析了dHSCs中DOT1L损耗对LEC发育的影响。Vav1-iCre菌株(DOT1LΔDHSc)。没有一个突变胚胎在皮肤或肠系膜淋巴管中出现缺陷(图一)。3E，f)，这与之前的一份报告一致，该报告表明DOT1LΔDHSc菌株是可行的，但表现为造血功能受损。37。这些结果证实了BECs/LEC祖细胞功能的丧失，而不是LECs或dHSCs的功能丧失，介导了所观察到的淋巴缺陷。

c-kit(+)血内皮细胞的DOT1L功能是肠系膜LEC发育所必需的

最近的一项研究表明，肠系膜淋巴管的形成是由cv becs的已有淋巴管的淋巴管生成和c-kit(+)hes的淋巴管生成所介导，两者可能都来自卵黄囊和主动脉-性腺-中肾(AGM)。4。也有证据表明心脏lecs部分来源于卵黄囊来源的hes。3。此外，在HES在肠系膜内活跃形成时，DOT1L被取消时，出现了最严重的淋巴表型。DOT1L伊科老鼠(图1.2A，b)。因此，为了直接评估c-kit(+)hES中DOT1L对肠系膜LEC分化的调节作用，我们在E17.5中对肠系膜进行了检测。DOT1L2fl/2fl;ckitCreERT 2 (DOT1LΔHE在E9.5/E10.5、E11.5/E12.5或E12.5/E13.5上连续注射2天。在E17.5的一个子集中观察到肠系膜淋巴管的不完全形成。DOT1LΔHE胚胎(E9.5/E10.5注射16枚，E11.5/E12.5注射4枚)，E12.5/E13.5注射后发现轻度淋巴缺损(7枚胚胎中有2枚)。4A，b)。这些结果表明，在LEC分化过程中，包括Tie 2(+)和c-Kit(+)细胞在内的LEC祖细胞中DOT1L的表观遗传启动对肠系膜淋巴管的形成是必不可少的。此外，由于卵黄囊中的HES为LYVE 1阳性，而AGM的HES为LYVE 1阴性。41我们的发现也暗示，DOT1L功能在卵黄囊衍生的HES中可能对肠系膜LEC的分化没有什么影响。

aE17.5胚胎的典型图像(上面板，刻度棒=2mm)和全身免疫荧光染色DOT1L∆HE肠系膜抗LYVE 1抗体和抗-Emcn抗体(下面板，标度为200 m)连续注射4-OHT后肠系膜。提示不完全淋巴管形成(箭头)。bE17.5中LYVE 1(+)覆盖的量化DOT1L∆HE及控制淋巴管(n=每组6~16个胚胎)。

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DOT1L耗竭改变淋巴转录程序

为了解DOT1L介导的LEC发育调控机制，从E15.5分离的LECs进行RNA测序(RNA-Seq)。DOT1LΔEC做了皮肤手术。结果表明，971和1241基因被下调和上调。DOT1LΔECLECs，分别(图1.5A)。重要的是，许多已知对淋巴发育和瓣膜形成至关重要的基因在KO LECs中被下调，包括索克斯189,10, VEGFR 312,14,15, Ramp 242，和FOXC 220,21(无花果)5A)，经qRT-PCR进一步证实。5B)。DOT1L条件基因敲除(CKO)抑制基因的基因本体(GO)和基因集富集分析(GSEA)显示，参与血液和淋巴管发育的基因明显富集。5C，d)。有趣的是，与免疫有关的基因群在DOT1LΔECLECs(图1.5C).

aE15.5对照LECs RNA-Seq分析散点图n=3)和DOT1L∆EC (n(2)胚胎。n=2和3：每个RNA-Seq文库的混合生物复制。提示淋巴管形成和功能的关键基因。红点和蓝点表示下调和上调基因DOT1L∆ECLECs，分别。bqRT-PCR分析证实E15.5基因表达减少DOT1L∆EC真皮LECs与野生型(n=2/组)。误差条显示平均值±S.E.M。c, d基因本体(GO)术语分析和基因集富集分析(GSEA)DOT1L∆EC莱克。每个红色(CKO中的抑制基因)和蓝色(CKO中的上调基因)分别代表每个GO期的一个基因。NES归一化富集评分，FDR错误发现率。

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DOT1L失活可降低淋巴基因H3K79me2的富集

为了确定DOT1L的直接靶基因，在DOT1L抑制剂EPZ 5676作用下对LECs进行了H3K79me2芯片-Seq检测。我们的分析表明，DOT1L的失活导致第1组(启动子+基因体，1088个基因)，第2组(基因体)的H3K79me2水平显著降低。高，2503个基因)和第3组(基因体)低层，2873个基因)。6A)。重要的是，242个基因(第1组19个，第2组121个，第3组94个，第1+2+3组8个)参与血管生成、淋巴管发育和血管发生，H3K79me2水平和基因表达下调(图一)。6B，c)。值得注意的是，在大多数常见的被抑制基因中，H3K79me2基因减少了(见图)。6B)。在IGV基因组浏览器中显示了具有代表性的基因，这些基因对LEC的分化、迁移和瓣膜形成非常重要。6d)。这些基因包括索克斯18, VEGFR 3, Ramp 2, FOXC 2, Efnb 2，和EphB 4。独创性通路分析(IPA)显示，DOT1L失活的基因中有一部分与水肿和淋巴管生成异常有关(如图1所示)。6E)。加在一起，DOT1L介导的LECs H3K79甲基化有助于在LEC发育过程中正确表达对淋巴管形成和功能重要的基因。

a平均标记密度图显示DMSO-或EPZ 5676处理的小鼠原代真皮LECs中H3K79me2富集的k-均值聚类(n=3，3：每个芯片的池生物复制-Seq库)。根据H3K79me2的富集模式，峰被划分为第1组(启动子+基因体，1088个基因)，第2组(基因体)。高，2503个基因)和第3组(基因体)低层，2873个基因)。在转录起始点(TSS)周围，H3K79me2峰位于-5~+5kb之间。bVenn图和饼图显示了每个基因簇中表达和H3K79me2水平共同下调的基因数目。c对常见242个基因进行Go定期分析。每个术语中的基因数在括号中表示。-日志10(p-值)用于标尺。d下调DOT1L靶基因的基因组浏览器视图(索克斯18, VEGFR 3，RAMP 2，FOXC 2，Efnb 2，和Eph4)对LEC发展至关重要。e通过表达和H3K79me2芯片-Seq分析鉴定的基因的独创性途径分析(IPA)。注意，DOT1L丢失使小鼠和人的淋巴管生成异常和水肿相关基因明显下调。图例中的每个形状和线条颜色分别代表蛋白质功能和功能交互作用。

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Tie 2(+)或LYVE 1(+)细胞中DOT1L过表达可导致淋巴形成异常

为了补充功能缺失的研究，我们建立了一种新型的敲入(Ki)小鼠品系。DOT1LcDNA-IRES-EGFP用浮子3×聚(A)插入rosa 26轨迹(附图)S4a，b)。这些Ki小鼠与TG杂交。Tie2-CRE)获得高表达的复合菌株DOT1L在教统会(DOT1LECOE)。通过评估，证实了CRE介导的多聚(A)信号切除后在ECs中的转基因表达。EGFPE17.5中的表达DOT1LECOE肠系膜血管(附图)S4C)。肠系膜淋巴管扩张，尤其是回肠肠系膜扩张，在12 E17.5米中有10例明显。DOT1LECOE胚胎(图1.7A-c)。有趣的是，12枚胚胎中有2枚和12枚胚胎中有1枚分别表现为肠系膜淋巴管发育不良和皮肤血淋巴混合表型(图1)。7a，b)。接下来，找出哪一种EC类型对m中观察到的表型负责。DOT1LECOE老鼠，米DOT1LLECOE使用LYVE 1EGFP/CRE排队。不像mDOT1LECOE在E17.5 m肠系膜上观察到小鼠不连续和发育不良的淋巴管。DOT1LLECOE老鼠(图1.7D，e)。这些数据表明DOT1L根据细胞类型(即LEC分化前后)发挥着不同的作用。最后，我们试图确定是否增加了DOT1LBECs表达可增强淋巴基因对DOT1L丢失的抑制作用。为此，我们利用催化死亡的Cas9(Dcs 9)激活内源DOT1L在小鼠原代皮肤BECs中的表达(附图)。S4d)。如图所示。7F，强迫DOT1L过度表达导致关键淋巴基因的适度增强，例如FOXC 2, Sox 17, Tie1, 索克斯18, VEGFR 3，和Ramp 2第7天后转导。综上所述，我们的分析表明，在BECs或淋巴祖细胞中精心调节DOT1L功能对正常LEC分化和淋巴发育至关重要。

aE17.5胚胎概况(刻度棒=2毫米)。扩大的图像显示淋巴管-血液混合在DOT1LECOE皮肤。b抗LYVE 1和抗Emcn抗体的免疫荧光DOT1LECOE肠系膜。标尺=200公厘。cE17.5肠系膜淋巴管形态计量学分析DOT1LECOE (n=10)和少白蚁控制胚胎(n=10)。误差条显示平均值±S.E.M。d抗LYVE 1和抗Emcn抗体的典型免疫荧光DOT1LLECOE肠系膜。eE17.5肠系膜淋巴管LYVE 1(+)覆盖的形态计量学分析DOT1LLECOE (n=5)和少白蚁控制胚胎(n=3)。fBECs高表达淋巴管基因的qRT-PCR分析DOT1L. n=2。

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功能性淋巴循环的形成和维持是哺乳动物生理的关键。本研究发现DOT1L对LEC祖细胞的表观遗传启动在淋巴管发育和瓣膜形成中起着重要作用。DOT1L是已知的唯一不含标准组蛋白甲基转移酶结构域的H3K79甲基转移酶，称为SU(Var)3-9，增强子的ZAST和Trithorax(Set)结构域。19,43,44。研究表明，DOT1L通过与RNA聚合酶II(PolII)磷酸化C末端结构域的相互作用，在活跃转录基因上富集。因此，基因中二甲基化和三甲基化H3K79(H3K79me2/3)的富集与PolII的延伸和转录效率呈正相关。45,46,47。我们的基因组分析一致表明，DOT1L直接与协调淋巴发育和功能的关键淋巴基因结合。在DOT1L CKO动物中观察到的最显著的表型是淋巴发育不全、水肿和淋巴瓣膜发育不足。本研究所描述的表型与以往的KO研究是一致的。以前的研究表明，Sox 18和FOXC 2的KO干扰了LEC与BECs的分化，分别导致无瘤淋巴管和淋巴管形成。9,20,21。越来越多的证据表明DOT1L对人类疾病有上下文依赖的有利或不利影响。例如，DOT1L可以促进神经母细胞瘤的发展，而它可以防止紫外线诱发的黑色素瘤的发生。48,49。Nguyen等人证明DOT1L功能是维持心血管稳态正常所必需的，因为心肌细胞中DOT1L功能的丧失导致扩张型心肌病，抑制了dystrophin的表达。31.

DOT1L失活后H3K79me2被抑制的基因包括对LEC分化和瓣膜形成至关重要的几个转录因子(Sox 18、Sox 17和FOXC 2)，以及对LEC增殖和迁移至关重要的信号分子(VEGFR 3)。9,10,16,20,21。人SOX 18突变与肝硬化-淋巴水肿-毛细血管扩张症(Omim 607823)有关，其特点是下肢淋巴水肿、皮肤毛细血管扩张和浅表血管扩张。50,51。此外，VEGFR 3和FOXC 2的突变分别与罕见的非尼-米洛伊淋巴水肿(Omim 153100)和淋巴水肿-椎间盘病综合征(lds，omim 153400)有关。52,53,54,55。非NE-Milroy淋巴水肿或LDS患者也表现为严重淋巴水肿，尤其是下肢淋巴水肿。符合这些疾病的病理特征，DOT1L埃奇科小鼠出现严重的皮肤水肿，淋巴管形成受损。人们普遍认为MAPK信号通过sox 18的转录激活启动静脉EC到lec的转分化，进而诱导prox 1的表达。56,57。然后，prox 1与nr2f2形成异二聚体复合物，调节包括VEGFR 3和pdpn在内的多个淋巴基因的表达。17,18。VEGFC/VEGFR 3信号通路通过促进LEC的增殖、迁移和存活，对离心淋巴管生成没有明显区别。16。然而，对参与淋巴管发育和功能的核心转录因子的表观遗传调控却知之甚少。据我们所知，我们的第一项研究表明组蛋白甲基化是通过转录因子和信号转导直接调节LEC发展的关键因素。同样，最近的一项研究表明组蛋白乙酰化在LEC的发育和功能中起着关键作用。高脂肪酸β-氧化(FAO)对组蛋白乙酰化的调节作用，保证了LEC分化和功能的正确表达。30。FAO的增强是由Prox 1靶向的CPT1A表达介导的，并导致线粒体乙酰辅酶A的产生，它可以作为p 300介导的组蛋白乙酰化的辅助因子。小鼠hda 3功能丧失减少淋巴管形成和血淋巴混合，基因转录异常29。因此，我们的数据和其他研究表明，表观遗传机制对淋巴管的形成和功能具有重要的转录调控作用。

最近的证据表明，器官类型特异性的lecs可能不是单一来源，而是来源不同。3,4,5,6。特别是，心脏和肠系膜LECs至少一部分来自卵黄囊和/或AGM HES。3,4。我们的发现进一步支持Tie 2(+)/c-kit(+)/vve 1(-)hes可能引起肠系膜LECs，因为两者都明显存在淋巴缺陷。DOT1L埃奇科和DOT1LΔHE老鼠。值得注意的是，在DOT1L埃奇科胚胎并不是由于LECs凋亡所致，因为我们未能检测到Caspase-3阳性LECs的增加(数据未显示)。然而，目前尚不清楚DOT1L的丢失为何或如何对BEC的发展和功能几乎没有或根本没有影响。DOT1L埃奇科老鼠。有几种可能的解释。首先，虽然DOT1L是广泛表达的，但我们的RNA-Seq分析表明，DOT1L在AGM c-Kit(+)/CD 31(+)细胞中比在c-Kit(-)/CD 31(+)细胞中表达更多，这表明DOT1L在HES中起着关键作用(数据未显示)。其次，虽然还没有发现其他的H3K79去甲基化酶，但H3K79甲基化和去甲基化在BECs中比在LECs中具有更大的动态性，这是因为一种尚不清楚的H3K79脱甲基酶的活性。事实上，H3K79甲基化似乎是积极可逆的。另外，与LECs相比，一种未知的H3K79脱甲基酶可能在BECs中高表达。最后，以前的研究表明DOT1L可以与不同的结合伙伴相互作用，形成一个蛋白质复合物。这些蛋白质包括MLL融合伙伴(AF4，AF9，AF 10和enl)和P-TEFb，后者是RNA PolII的激酶。58,59。AF17分别通过竞争AF9结合来调控DOT1L介导的H3K79me2的放置和干扰DOT1L向细胞核的转运。因此，也有可能是未知的DOT1L相互作用蛋白在细胞类型中差异表达，以调节DOT1L的活性或目标色素的可达性。

我们的DOT1L过表达研究表明DOT1L介导的表观遗传调控具有明显的细胞类型和时间依赖性；DOT1LLEC分化前/分化过程中，肠系膜淋巴管过度表达，而肠系膜淋巴管增生。DOT1LLEC分化后过度表达，表现为淋巴管发育不良。

总之，我们证明DOT1L控制淋巴系统中的转录回路，为制定更好的治疗策略来治疗DOT1L相关白血病患者，特别是妊娠患者提供了基础。此外，我们的结果表明DOT1L作为基因筛选的候选生物标记物，可用于鉴别包括乳糜性腹水和淋巴水肿在内的特发性淋巴疾病的病因。

小鼠

所有动物研究都得到了Gachon大学动物保护和使用委员会(IACUC#lCDI-2014-0045)、茶大学(IACUC#180001)和Konkuk大学(IACUC#KU 18027)的审查和批准。生代DOT1LKo和条件等位基因小鼠在先前的一项研究中被描述过。40。热重Tie2-CRE)(股票#004128)，TG(Vav1-iCre)(股票#008610)，LYVE 1EGFP/CRE(股票#012601)，rosa 26克里尔(股票#004847)和R26R(股票#003474)小鼠被购买从杰克逊实验室(酒吧港，美国)。生成TG(PROX 1-CreerT2)60和ckitCreERT 2小鼠61在以前的研究中被描述过。获得DOT1LΔ欧共体, DOT1LΔLEC, DOT1LIΔLEC, DOT1LΔDHSc, DOT1L伊科，和DOT1LΔHE胚胎，雌性DOT1L2F/102 fl小鼠与雄性交配DOT1L2fl/+；CRE(+)或DOT1L2F/102 fl；Creer(+)小鼠；小白蚁DOT1L2fl/2fl；CRE(-)或Creer(-)胚胎作为对照，DOT1L2fl/2fl以CRE(+)或Creer(+)胚胎为实验组。定时交配时，在中午检查阴道塞，并在指定的胚胎日收获胚胎。

若要生成DOT1L高表达等位基因，4.6kb全长小鼠DOT1LcDNA克隆入pBSApBpACAGftIGn载体62在SFII站点，以及PAC我-ASC将pBSApBpACAGftIGn载体的I片段亚克隆到pROSA26PAS中。63含向量CAGG启动子和IRES-EGFP。经电穿孔和普罗霉素筛选，从胚胎干细胞中提取基因组DNA，用生态和用Southern杂交分析；预期尺寸生态基因敲入(Ki)和野生型等位基因的RI酶切片段分别为6.8和15.6kb。标准协议用于生成DOT1LKi嵌合小鼠64。获得mDOT1LLECOE和mDOT1LECOE品系：Ki雌性小鼠与雄性小鼠杂交。LYVE 1EGFP/CRE和TG(Tie2-CRE)线。

对胚胎和动物卵黄囊或尾尖进行基因分型，用25 mm NaOH溶液在95℃下裂解2h，经1M Tris-Cl中和后，以最大速度离心，以含基因组DNA的上清为模板进行PCR扩增。扩增条件为：95℃变性5 min，95°C变性35次，58℃退火30 s，72°C扩增30s。

为诱导CRE活性，将溶解在玉米油(0.5 mg/25 g或1.25 mg/25 g)或4-羟基他莫昔芬(H 6278，Sigma)中的他莫昔芬(T 5648，Sigma)腹腔注射到孕雌体内，并于指定时间采收胚胎器官。

整体式染色、成像和量化

取胚/器官按样品大小在4°C下固定2%多聚甲醛，用PBS洗涤，在甲醇系列(25、50、75和100%)中脱水15 min，每步15 min，在室温下旋转，在蒸馏水(1：2=蒸馏水：15%DMSO在甲醇中)过夜(O/N)。漂白后，用50%甲醇、25%甲醇和PBS分别在50%、25%甲醇和PBS中连续再水化15 min，用0.1%PBST×100(0.1%TritonX-100，PBS中0.1%TritonX-100)漂洗2h。Then，samples were incubated in blocking solution(0.1%PBST×100 with 3%milk/5%normal serum)and in primary antibodies against CD31(550274，BD Pharmingen)，Lyve1(11-034，AngioBio)，Endomucin(Emcn，sc-65495，Santa Cruz Biotechnology)，Ter119(550565，BD Pharmingen)，and Nrp2(AF567，R&D Systems)O/N at 4°C.After washing，samples were incubated with secondary antibodies O/N at 4°C，washed in PBST，fixed in 4%paraformaldehyde，and analyzed under a confocal laser microscope(LSM700，Carl Zeiss).利用z叠加函数得到胚胎和器官图像的最大强度投影.与原抗体反应后，用4°C与生物素结合的次级抗体O/N洗涤，与亲和素-生物素复合物(ABC，PK-6100，载体实验室)共同孵育，在4°C下用O/N溶液处理，用3，3‘-二氨基联苯胺溶液(SK-4100，载体实验室)处理，直至显色。

X-半乳糖染色用固定液(1%甲醛，0.2%戊二醛，2mm MgCl)孵育胚胎。25 mm EGTA，0.02%np-40在pbs中用pbs冲洗10 min，在x-gal溶液(5 Mm K)中染色。4Fe(CN)6，5毫米K3Fe(CN)6·3H2O，2mm MgCl2、0.01%去氧胆酸钠、0.02%NP-40和0.75 mg/ml X-半乳糖(100 mm磷酸盐缓冲液)O/N(37°C)。

用全小肠(空肠至回肠)测量LYVE 1(+)淋巴管复盖率。DOT1LΔ欧共体, DOT1LΔLEC, DOT1LIΔLEC, DOT1LΔDHSc, DOT1L伊科, DOT1LΔHE，mDOT1LLECOE，和mDOT1LECOE肠系膜。然后，测量LYVE 1(+)覆盖范围，收集与emcn(+)血管平行的淋巴管，分为无淋巴管(无淋巴管)、≥50%(肠系膜淋巴管超过半数的动物)、<50%(肠系膜内淋巴管不足一半的动物)和完全(连续淋巴管)(如一项研究所述)。4。在胚胎头、膈肌、心脏和皮肤的血管形态计量学分析中，选择实验组和对照组的解剖匹配区域，用Zen(Carl Zeiss)和ImageJ软件测量LYVE 1(+)或CD 31(+)血管分支点或长度。m的LYVE 1(+)面积的量化DOT1LECOE和mDOT1LLECOE根据ImageJ软件的图像量化协议，对肠系膜、LYVE 1(+)采集淋巴管的像素值进行测量。

免疫组织化学

取胚用2%PFA溶液O/N固定4°C，用PBS洗涤，用50、70、95和100%乙醇连续脱水30 min，每步30 min，用二甲苯孵育30 min，石蜡包埋，切成7m切片。切片分别在二甲苯中分离10 min，在100、95、70%乙醇和PBS中连续再水化10 min/步，与抗LYVE 1抗体和抗Emcn抗体(各为1：200)孵育1h。用PBS冲洗后，用二次抗体孵育1 h，用Polink DS-RRT-Hu/MsA试剂盒(DS211A-18，GBI实验室)显色(Emcn为棕色，LYVE 1为红色)。

定量RT-PCR

用RNeasePlus微型试剂盒(74104，Chiagen)从培养的BECs或胚胎LECs中提取总RNA，并根据生产厂家的指示，用更智能的PicoPCRcDNA合成试剂盒(634928，TAKARA)和Advant2PCR试剂盒(639206，TAKARA)合成总RNA。QRT-PCR是在一个STEP One Plus™系统(应用生物系统)中使用快速SYBR绿色主混合(4385616，应用生物系统)进行的。

细胞培养与磁激活细胞分选

从C57BL/6胚胎中获得原代小鼠真皮LECs，并在完整的小鼠内皮细胞培养液中添加补充剂(C57~6064L&M 1168，细胞生物制品)。所有体外细胞培养实验均在第5代内进行，DOT1L灭活培养在含2M EPZ 5676(DMSO，A 12735，Adooq)的LEC培养基中培养7d。对经EPZ 5676处理的LECs进行芯片-Seq分析.在先前的一项研究中描述了从胚胎皮肤中分离LECs的方法。65。E15.5胚胎皮肤用含有II型和IV型胶原酶的培养基和DNaseI(分别为LS 004176、LS 004188和LS 006344；Worthington生化公司)酶解。分离细胞经40 m细胞过滤器过滤20 min后，分别在F4/80和CD 45抗体(分别为13-4801和13-0451；eBioscience)中孵育1h，耗竭巨噬细胞，用山羊抗大鼠IgG包被微球(130-048-101，Miltenyi Biotec)收集。F4/80(-)/CD 45(-)细胞与LYVE 1抗体(13~0443，eBioscience)和次级抗体共同孵育。对LYVE 1(+)LECs进行RNA-Seq和qRT-PCR分析.

慢病毒的产生与细胞转导

用导向RNA(GRNAs)催化死Cas9(Dcs 9)过表达。DOT1L在BECs。预测的gRNA序列DOT1L启动子或5‘DOT1L上游利用CRISPR-ERA和Quilt工具获得。设计的gRNA序列如下：DOT1L-OE1；5‘-TTGTTTGGCGTAAGTCGTGCGTCGGT-3’，5‘-AAACACCGACGCACGCACTCGCCAA-3’，DOT1L-OE2；5‘-CACCGTTTCCGGGCCGCTTC-3’，5‘-AAACGAAGCGGGGACCCGGGAAAC-3’，DOT1L-OE3；5‘-TCCCAGATTTGAACTTCCGCC-3’，5‘-AAACGGCGGGGTCATTCAATCT-3’，DOT1L-OE4；5‘-CCTCGCGGAGGGGGGAGTCCAAG-3’，5‘-AAACCTTGGACTCGCTCCTCCGC-3’。含gRNAs的合成BBS一个位点，四个候选的gRNAs被克隆到BBSI-酶切的gRNA克隆载体(Addgene#53186，53187，53188和53189)，并进行测序.然后，用金门法将4种gRNAs及其启动子亚克隆到含dCas9的慢病毒载体(Addgene#59791)中。伦蒂-DOT1LOE病毒就像前面描述的那样产生。66。在DMEM中加入10%FBS和1%Pen/Strep培养HEK293T细胞。一旦细胞达到~85%的汇合率，Lenti-DOT1LOE包装载体[psPAX 2(Addgene#12260)和pMD2.G(Addgene#12259)]用超完美试剂(Chiagen)转染，细胞在Freestyle 293 T培养基中保存。分别于转染后26、38和50h收集含病毒颗粒的上清液，用Am图标Ultracell 100 K柱进行浓缩。将浓缩的慢病毒导入BECs。简单地说，这些细胞被保存在内皮细胞培养基中，当细胞聚集度达到50%时，用聚丁烯(10μg/ml)进行转导。病毒转导后，用血管内皮细胞培养液加入VEGF-C(100 ng/ml)。以Lenti-空病毒为对照。转染后第7天，用FACSAria(BD生物科学)对EGFP(+)细胞进行分类，并进行qRT-PCR分析。

RNA-Seq与分析

对从2~3个生物复制体中提取的混合RNA样品进行了RNA-Seq实验.从对照中提取总RNADOT1LΔ欧共体采用RNeasePlus Mini试剂盒(74134，Chiagen)检测皮肤LECs，用生物分析仪(Agilent)评价其总RNA含量和质量。应用ScriptSeq v2试剂盒(Illumina)，将RIN值>7.0的RNA样品用于RNA-Seq文库的制备。在MiSeq(Illumina)上进行了配对末端测序，并使用星型工具(v2.5.2b，v2.5.2b)将读序列映射到MM9小鼠基因组。https://github.com/alexdobin/STAR)67。绘制地图后，用袖扣计算每千粒酶百万(FPKM)片段(v2.2.1)。68工具使用以下特定于链的库夫规范选项：-库-类型=fr-第二链。用David(v6.8)和基因集富集分析(GSEA，v2.2.4)对差异表达基因(DEGS)进行功能注释和富集分析。69用r(v3.3.2)软件包进行统计分析和散点图生成，用整合基因组观察器(IGV)可视化rna-seq结果。70.

芯片-Seq与分析

芯片-Seq实验与三个生物复制/组混合进行。DMSO或EPZ 5676与1%甲醛(F 8775，Sigma)交联10 min，与0.125 M甘氨酸(1610718，Bio-Rad)中和。细胞经冰冷pbs洗涤后，在1.5毫升的试管内，在裂解缓冲液(5 mm管，pH8.0，85 mm KCl，1%NP-40，1 mm pmsf，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒[11836153001，roche])中，4°C离心15 min，离心后，细胞球再悬浮于400μl的胞核裂解缓冲液(50 mm Tris-Cl，pH 8.0，10 mm，pH 8.0，1%SDS，1mm PMSF，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒)中，在4°C核中孵育30 min(Q 500，Q 500)。Qsonica)在4°C下进行20次循环(30 s/30 s，40%振幅)，将DNA剪切成300~400 bp的片段。离心后加冰冷稀释缓冲液(50 mm Tris-Cl，pH7.5，150 mM NaCl，0.25%脱氧胆酸钠，1mm EDTA，pH8.0，1%NP-40，1mm PMSF，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒)于上清液中加入剪切染色质，与H3K79me2抗体(ab3594，AbCAM)和Dynabead结合的次级抗体(10004D，LifeTechnologies)O/N在4℃孵育，保存部分非免疫沉淀染色质供输入对照。洗涤后，用蛋白酶K(P2308，Sigma)处理免疫沉淀DNA，用酚/氯仿萃取，乙醇沉淀。将DNA溶于洗脱液(10 mm Tris-Cl，5 mm EDTA，300 mm NaCl，0.5%十二烷基硫酸钠，2.5μg/ml DNase(11119915001，ROCHE))中，用生物分析仪评价其含量和质量。芯片-Seq库是根据制造商的指示使用Truseq芯片样本工具包(Illumina)生成的，原始读取用Bowtie 2(v2.2.9)对齐到小鼠MM9基因组，然后是Samtools(v1.2)。71用于数据安排。使用以下MACS 2调用芯片-Seq峰(v2.1.0)72参数：-B-f BAM-g mm-宽-p 1e-5.NGS地块(v2.61)和seqminer(v1.3.3e)73分别绘制读取平均密度和热图。芯片-Seq读取显示使用IGV。疾病相关基因经DOT1L灭活后，基因表达下调，H3K79me2富集，经独创性途径分析(IPA，Chiagen)鉴定。

统计分析

数据采用正态性检验(Shapiro-Wilk检验)和等方差检验。两组间LYVE 1(+)区、血管分支点和淋巴管长度连续数据的差异有统计学意义(P<0.05)。t使用GraphPad Prism 5(v5.01，GraphPad软件)进行测试。结果表示为平均±S.E.M.，以及p-小于0.05的数值被认为是重要的。