摘要
引入本地分辨率极大地帮助了对cryo-EM图的理解。但是，对于任何给定的像素，它都是一个全局的汇总值，这使得不可能单独分析不同投影方向的贡献。我们介绍了MonoDir，这是一种全自动的无参数方法，仅从最终的cryo-EM图开始，将局部分辨率分解为不同的投影方向，从而提供了对最终图的详细分析级别。定向局部分辨率的许多应用都是可能的，我们在此集中于地图质量和验证。
重建地图后，将估算其分辨率以避免可能的过度解释。分辨率可以全局或局部确定。全局参数是确定整个地图可靠性程度的单个参数；作为FSC最常见（有关解决措施的综述，请参见参考资料1）。相比之下，局部方法确定由该体素的体素的可靠性通过不同的方法，两个半部之间窗FSC 2，或高于噪声电平的结构特征的检测3，4。
由于在成像和处理级别上样品发生多种效应，因此出现了对局部分辨率方法的需求，例如：样品异质性的存在，灵活性，单个粒子的角度分配错误，投影球体的角度覆盖不良，存在首选方向或辐射损坏等。局部分辨率图可以将所有这些限制因素的综合作用量化为最终的cryoEM图；但是，他们无法单独隔离每个因素的影响。最近的作品，例如3DFSC 5或效率6试图单独解决引入定向分辨率概念的一些问题。但是，这些方法本质上是全局的，确定了一个好的功能，可告知存在不良的角度覆盖范围。尚未研究这些效应的局部测量，这是我们研究的目标之一，据我们所知，首次将方向性和局部性结合在一起。在这项工作中，提出了一种局部方向分辨率测量方法。我们将在这里展示的是，相对于只是局部解决方法2，3，4通过执行完整的“定向局部分辨率”分析来扩展（体素）局部性的概念，出现了另一种分析冷冻电磁图信息内容的方法，从而为从图验证和质量控制到链跟踪提供了许多新的可能性等等。本文重点介绍一些建议的地图质量评估定量指标。在所有情况下，我们要注意两个重要点：（1）我们方法的唯一输入是最终的cryo-EM图，而无需了解原始粒子或其分配的投影方向，（2）我们的方法基于基于MonoRes 4的强大的单基因信号数学框架7（请参见“方法”部分）。
我们称为MonoDir的新算法将沿3D方向的一组方向计算局部分辨率（请参见“方法”部分）。本质上，给定一个体素位置（），我们将计算来自每个方向的信息对其汇总的本地分辨率的贡献。换句话说，每个位置（体素）都将与一组分辨率值相关联，这些分辨率值等于所分析方向的数量；它们称为局部方向分辨率值。注意，从本质上讲，我们正在做的是将局部分辨率不仅仅是一个“值”，方向分辨率运算符为每个体素的每个方向分配一个实数，因此，更改的内容具有非常基本的数学性质（因此，这是产品空间上的函数 在哪里 组件是体素， 组成部分是方向。先前定义的本地分辨率运算符仅在。将本地分辨率的概念扩展到是本文的主要贡献。）因此，难怪MonoDir提供了从全新的角度分析cryo-EM映射的可能性，远远超出了我们在本文中介绍的全部针对地图验证的有限示例集。
我们可以想到的最简单的质量指标是“最高（例如3Å）和最低（例如10Å）的局部分辨率地图”。最高分辨率的地图会告知最高分辨率值，，对于每个像素， ，而不考虑该分辨率的测量方向。同样，可以使用相应的最低分辨率值获得最低分辨率图，。通常，最高和最低分辨率方向不需要彼此正交。为了获得统计上“稳健”的地图， 和 分别被视为所有可能方向的分辨率分布的百分位数0.05和0.95。
我们引入的下一个指标是“平均方向分辨率”（ADR）。只需要检测有助于最高分辨率的方向 （这是最大分辨率值），并以同样的方式降低到最低分辨率 ，两者均在前面提到的稳健统计意义上。ADR在数学上定义为：
ADR提供有关地图质量的有价值的信息，并告知可能存在的首选方向。但是，要推断此信息，需要与本地分辨率图进行比较，而ADR图本身并不是本地各向异性度量。从某种意义上讲，它就像是由局部各向异性加权的局部分辨率图。注意当值 和 相似，这意味着地图呈现出较低的局部分辨率各向异性，因此所有方向均显示相同的质量。相反，如果存在局部各向异性，则最低分辨率的值将显着小于最高分辨率的值，从而降低了平均值。为了补充ADR并获得分辨率各向异性的估计值，引入了色散度量，因此，对于每个体素，我们引入了统计上稳健的度量，其四分位间距的一半介于0.17和0.83个百分位数之间（选择这些百分位数代表一个标准单位）分布正常时的偏差）。提醒您，对于每个体素，MonoDir会计算一组方向的局部方向分辨率；因此，局部方向分辨率与计算方向的数量一样多。从这种局部方向分辨率的分布中计算出百分位数。必须强调的是，作为色散度量，四分位数间距是我们建议的用于测量局部分辨率各向异性的度量。
显然，ADR和四分位间距的一半告知分辨率分辨率，但它们不告知哪个是首选方向。但是，通过引入投影方向的其他经典图的修改，可以非常轻松地测量此信息。新图将称为极坐标图，它表示沿特定方向具有最高分辨率的体素的数量。换句话说，极坐标图表示投影球体上最高局部方向分辨率值的直方图，其中沿每个方向的计数数量由点的大小表示，请参见图1中的示例 。因此，我们不仅能够识别系统缺乏粒子视图的情况（如正常的极坐标图那样），而且还能识别角度分配中的错误。确实，如果我们的3D对齐算法未正确分配给确实来自不同方向的特定投影方向图像，则此错误将在地图上沿该方向引入模糊，因此，分辨率最高的体素数量将减少。因此，对于等向图，我们的新角度图应呈现出投影球体的均匀覆盖范围，否则我们将缺少投影方向或角度分配不正确。
将原子模型PDB-3j7h转换为密度图，首先是针对考虑所有投影方向然后缺少方向的图，其中显示（a）平均方向分辨率（ADR），（b）角图，（c）径向平均值局部方向分辨率图（切向粉红色点，径向蓝色圆圈，以及最低和最高）是：在以下情况下：标准偏差为1.2度的随机角度误差，标准偏差为1度的随机位移误差和无误差重构考虑过的。
MonoDir计算沿特定方向集的局部方向分辨率图。但是，也有可能沿着可能与地图的关键特征相关的特定方向分析局部方向分辨率。在这种情况下，特别有趣的是分析沿与地图的极性分解相关的两个方向的分辨率：径向和切向方向。在计算径向局部分辨率的情况下，对于地图的每个点，我们都会计算将点连接到地图中心的线的方向，并沿着该方向计算局部分辨率，请参见补充图 1。。对于切向分辨率，在地图中的每个点上，我们都会计算其切向平面，并对该平面上的所有方向分辨率求平均值。期望这些方向对角度对齐的误差特别敏感，尤其是当沿着半径绘制沿这些方向的分辨率时。具体地，可以观察到分辨率的半径和径向平均值之间的近似线性关系，其是与角度对准中的角度误差相关的斜率（如通过简单的几何考虑所期望的，至少对于切向分辨率而言）。补充信息中对此进行了详细描述。请注意，角度图和径向平均分辨率曲线显示了有关重建图的全局信息，
我们首先使用结构模型在完全受控的合成环境中测试了MonoDir -半乳糖苷酶对应于PDB条目 8，9。该综合示例的目的是详细说明MonoDir提供的信息。因此，首先将原子模型转换为电子密度图 10，并以已知的角度分配获得了500个随机投影的画廊。然后添加具有零均值和2 au的标准偏差的高斯噪声。我们用这些数据进行了两次实验，结果如图 1所示。 。第一个实验旨在模拟在低温EM网格上具有首选方向的情况，因此我们移除了所有倾斜角小于40度（缺少圆锥）的粒子。缺少沿丢失方向的信息自然会在地图中引入分辨率各向异性。此外，MonoDir通过建立统计测试来阐明信号的局部能量是否高于噪声的能量。沿着丢失的圆锥方向，没有什么可比较的，分配的分辨率是最低的。第二个实验在不去除任何粒子方向的情况下获得了重建的结构，该实验解决了径向和切向分辨率的径向轮廓与对齐误差之间的关系。通过这种方式，
开始与ADR，值显然不同的地图从所有颗粒图重建 1和在缺少角间隙所示的情况下获得的一个 1一个。不出所料，在存在各向异性的情况下，ADR的值要比在没有各向异性的情况下低得多。然后，我们测试了新的投影方向极坐标图的行为，显示了每个方向上分辨率最高的体素数量。图 1b。显然，（1b）中的曲线对应于没有角度间隙的情况（左b-），比显示角度投影间隙的情况（b-右）还要均匀得多。在后一种情况下，形成40度圆锥的角间隙在图的中心非常清晰（丢失的圆锥周围的投影方向以某种方式夸大了具有最高分辨率的体素，这在我们注意到过渡区，显然是合成施加的缺失锥的结果，因此，在实验情况下不应发生这种影响）。
最后，每个半径的径向和切线分辨率的图非常有用地说明了对准误差，并证实了我们先前引入的期望；为了测试这个问题，已知粒子的角分配和位移围绕真实方向随机分配；对于角度分配，考虑标准偏差为1.2度的高斯分布，对于平移考虑为1像素的标准偏差。以这种方式，对应于在投影方向的分配中没有错误的情况的图。图 1（c，左）显示了平坦的轮廓和接近奈奎斯特的最高方向分辨率。然后，只引入了位移误差的曲线图 1（c，中心）也具有平坦的轮廓，但其值已移至较低的分辨率。最后，当引入角度误差时，图1（c，右）出现一个清晰的斜率 ，表明存在角度误差（及其重要性-较大的误差会导致较大的斜率）。请注意，切线和径向分辨率在较低半径处的行为类似，大致对应于大分子内完全包含的最大球体，但它们发散到该点之外，而切向分辨率通常具有较高的斜率。同样非常清楚的是，最低和最高方向分辨率的估计值也都遵循半径的明显斜率，即MonoRes估计值始终接近最大分辨率，尽管较低（考虑到如何定义，这是一种逻辑行为）。
我们从两个数据集开始，即20S蛋白酶体11（EMDataBank：EMDB-6287）和80S核糖体12（EMDB-2275），它们在图2中并排显示 。与ADR（图开始 2 a）所示，蛋白酶体各地图比用于核糖体低得多的值，这表明蛋白酶体地图更加各向同性的。ADR值和FSC值之间的比较也支持此观察，因为它们与报告的FSC分辨率相似。 Å（0.143）；此外，另一个指标3DFSC 5（请参见补充图）也表明各向同性。相反，核糖体的情况完全不同，ADR值的分布范围很广。然后，颗粒的定向分布（图极坐标图 2 b）显示了蛋白酶体相当均匀分布，但最高分辨率方向为核糖体分布极不均衡。最后，要注意的沿半径径向和切向的分辨率图是非常丰富（图 2 c）中，与那些从蛋白酶体来呈现良好的角的非常小的斜率的指示符指派，而那些用于核糖体显示计算出的很高的坡度。我们注意到该核糖体样品在参考文献中也用作示例。从图6中可以得出结论，即角度对准是不完美的，但是新的见识是，我们能够在不了解原始图像或其角度分配的情况下证明这一点（需要参考文献 6中的方法）。
a平均方向分辨率（ADR），（b）极坐标图和（c）沿半径绘制的局部切线（粉红色点）和径向（蓝色圆圈）方向的径向平均值，以及最高（绿色点），最低（黑色）连续）和MonoRes（紫色三角形）局部分辨率估算值。
MonoDir应用程序的最后一个实验示例如图3所示 。在这种情况下，左列和右列上的标本相同，即流感血凝素（HA）三聚体5，为其放置了两个图（在EMPIAR条目10196、10197中分别为0和40度的未过滤图），第一个一个方向受到首选方向的强烈影响，而在第二张地图中，通过倾斜EM网格，此障碍大大减小了。在图3a（左未校正图，右校正）中清楚的 是，未校正图的ADR值高于校正后的图。3DFSC 5最初支持地图校正的成功（请参见补充图 3）。DFSC和分散）。极性角分布曲线（图 3 b）中显示出最高的局部方向分辨率的非均匀分布，表明优选方向，在这种情况下的俯视图的存在。相反，对于倾斜的采样，相同的图显示了投影球的更均匀的局部分辨率覆盖范围，尽管在中心圆锥体内部的覆盖范围很小但不是可以忽略不计。最后，径向和切向的分辨率（图径向曲线 3 c）中指示所述未校正的地图比对校正地图较高斜率，正如预期的。
一个 ADR，（b）角度图，和（C ^）径向平均值如图 1。
我们进一步将“局部分辨率”的概念扩展为“定向局部分辨率”，其中分别分析了对与不同方向相关联的局部分辨率估计的贡献。分辨率的概念不仅取决于地图位置，而且在不同方向上具有不同的值。这一事实为研究低温电磁图谱的能力增加了新的维度。在本文中，我们介绍了一些“地图质量指标”，但在完全不同的应用领域中，可以想象得到更多，例如自动链跟踪或迭代角度对齐算法中的质量检查。因此，我们提出了一种非常通用的工具及其在地图验证中的初始应用，但是我们希望该工具在cryo-EM中具有更广泛的影响。
我们还显示了如何使用局部方向测量值提供有关重构地图质量，识别角度对准误差以及存在首选方向和分辨率各向异性的新信息；此外，该信息是从重建的地图中提取的，而无需访问原始图像集或与之相关的任何其他信息（这是MonoDir的独特且非常强大的功能，其他方法都无法做到）。关于MonoDir的容量为了识别对准误差，我们提供了清晰的示例，其中切向和径向的径向图的斜率可以与较高的较低角度误差定性相关，提供了以前在该领域中不存在的独特指导工具。此外，在《补充信息》中，我们更深入地分析了这种影响，证明了对准误差与切向和径向分辨率斜率之间的线性行为近似成立，尽管需要更多的工作来完全表征这种影响，可能是分析比例尺尚未考虑在内，因此最终我们可以对此关系进行定量描述。
总之，在此使用MonoDir进行分析的示例集代表了一个概念证明，即将局部分辨率视为标量而不是方向测量有多重要。在所有情况下，MonoDir都能提供cryoEM映射的新视图，通过提供有关影响映射的可能错误源的前所未有的详细程度，帮助我们更好地了解其质量。在这方面，我们认为“定向局部分辨率”的可能性才刚刚开始，未来的工作将提出适用于该领域许多工作领域的新颖扩展。
MonoDir的根源是MonoRes 4，其中对单基因信号及其在不同频率处的局部振幅的估计被用于通过冷冻EM图的假设检验来确定信号（大分子结构）估计是否显着高于噪声估计。任何给定的频率。口罩可以区分噪音和蛋白质。为了测量局部方向的分辨率图以及因此的各向异性，必须事先应用方向滤波器。
我们的目标是对电子密度图进行定向滤波，然后计算定向滤波图的局部分辨率，从而获得所谓的局部分辨率图。在补充附图中，示出了测量过程的方案。通过确定体积的傅立叶变换并用仅将频率保持在其中的圆锥覆盖傅立叶变换来定义定向滤波器。圆锥轴沿计算局部方向分辨率的方向排列，并且圆锥角由用户设置（在我们的示例中，我们使用30度）。通过计算逆傅立叶变换，可以获得定向滤波图。
然后，我们使用MonoRes 4测量了这些经过方向过滤的地图的局部分辨率。MonoRes计算噪声和信号的局部幅度。不幸的是，尽管在傅立叶空间中使用了平滑滤波器，但定向滤波还是会产生一些振铃，尤其是在边界周围以及垂直于测量方向的平面上。此振铃可能会修改噪声统计信息。为了避免这种情况，对原始的MonoRes算法进行了修改。这些修改可以在补充信息中找到。
重复测量局部方向分辨率的过程，直到我们覆盖了整个投影球为止。在我们的示例中，我们以15度的角度采样计算了81个方向。一旦分析了所有方向，便会组合局部方向分辨率信息以产生不同的输出（最低，最高，径向/切向分辨率图以及局部平均方向分辨率图）。
本文使用的所有已发布数据集均来自电子显微镜数据库（https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/），其条目为：EMD-2984，EMD-2275，EMD- 6287和EMD-8731（最后一个也是EMPIAR（https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/）条目10097和10096）。
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