摘要
在哺乳动物细胞中，> 25％的合成蛋白通过分泌途径输出。然而，通路的复杂性掩盖了其对不同蛋白质分泌的影响。揭示其对多种蛋白质的影响对于生物制药生产尤其重要。在这里，我们描述了核心的分泌途径功能，并将其与人类，小鼠和中国仓鼠卵巢细胞的基因组规模代谢重建相整合。由此产生的重构使得能够计算每种分泌蛋白的能量成本和机械需求。通过整合其他组学数据，我们发现高度分泌的细胞已适应减少其他昂贵宿主细胞蛋白的表达和分泌。此外，我们预测了生物治疗蛋白质的代谢成本和最大生产力，并确定了对蛋白质分泌影响最大的蛋白质特征。最后，该模型成功预测了沉默高表达选择标记后单克隆抗体分泌的增加。这项工作代表了哺乳动物分泌途径的知识库，可作为系统生物技术的新工具。
为了与环境相互作用，细胞产生大量的信号蛋白，激素，受体和结构蛋白。在哺乳动物中，它们至少包括2641个分泌蛋白（例如酶，激素，抗体，细胞外基质蛋白）和> 5500个膜蛋白1，其中大多数是在分泌途径中合成和加工的。
分泌途径由一系列复杂的过程组成，这些过程主要发生在内质网（ER），高尔基体和内膜系统中。该途径在生物技术和生物制药行业中尤其重要，因为大多数治疗性蛋白质是在哺乳动物细胞系中产生的，例如HEK-293，PerC6，NS0和中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，它们能够折叠并添加必需的对目标产品的翻译后修饰（PTM）2。对于任何给定的生物疗法，可能需要分泌途径中的不同机制，并且每个步骤都可以对细胞产生不可忽略的代谢需求。然而，该途径的复杂性使得不清楚不同分泌蛋白质的生物合成成本和细胞需求如何变化，而每种蛋白质对细胞资源的需求却不同。因此，对分泌途径的生物合成成本的详细了解可以指导为任何所需产品改造宿主细胞和生物过程的努力。哺乳动物分泌途径的能量和物质需求可以通过充分扩展代谢模型的范围来解决。事实上，最近的研究已掺入分泌途径的部分在酵母的代谢模型3，4，5。此外，隆德等。6重建了小鼠分泌途径和未折叠的蛋白质反应的遗传相互作用网络，并在CHO细胞的背景下对其进行了分析。然而，这种网络不包括分泌途径中涉及的生化反应的化学计量重建，也不与哺乳动物细胞的现有代谢网络耦合。
在这里，我们介绍与蛋白质分泌耦合的哺乳动物新陈代谢的第一个基因组规模的化学计量重建和计算模型。具体来说，我们为人类，小鼠和CHO细胞分别构建了RECON2.2，iMM1685和iCHO2048。我们首先得出一个表达式，用于计算每个蛋白质分子的ATP当量分子来合成和分泌产物的能量成本。我们使用这种表达并分析蛋白质分泌的能量负担如何导致对哺乳动物细胞中更昂贵的分泌宿主细胞蛋白质的整体抑制。鉴于其在生物治疗生产中的主导作用，我们将进一步关注CHO细胞的生物合成能力。然后，我们证明了给定重组产物的特定生产力作为约束条件，可以建立产物特异性分泌途径模型来估计CHO细胞的生长速率。我们确定对蛋白质成本和生产率有最大影响的分泌蛋白质的特征。最后，我们使用我们的模型来识别竞争细胞资源的蛋白质，从而提出细胞工程的目标。通过这项研究，我们证明了分泌途径的系统观点现在使分析控制哺乳动物细胞中蛋白质表达的功效和成本的许多生物分子机制成为可能。我们设想我们的模型是研究生物技术中正常生理过程和工程细胞生物过程的有价值的工具。本研究中使用的所有模型和数据均可在以下位置免费获得 我们确定对蛋白质成本和生产率有最大影响的分泌蛋白质的特征。最后，我们使用我们的模型来识别竞争细胞资源的蛋白质，从而提出细胞工程的目标。通过这项研究，我们证明了分泌途径的系统观点现在使分析控制哺乳动物细胞中蛋白质表达的功效和成本的许多生物分子机制成为可能。我们设想我们的模型是研究生物技术中正常生理过程和工程细胞生物过程的有价值的工具。本研究中使用的所有模型和数据均可在以下位置免费获得 我们确定对蛋白质成本和生产率有最大影响的分泌蛋白质的特征。最后，我们使用我们的模型来识别竞争细胞资源的蛋白质，从而提出细胞工程的目标。通过这项研究，我们证明了分泌途径的系统观点现在使分析控制哺乳动物细胞中蛋白质表达的功效和成本的许多生物分子机制成为可能。我们设想我们的模型是研究生物技术中正常生理过程和工程细胞生物过程的有价值的工具。本研究中使用的所有模型和数据均可在以下位置免费获得 从而提出细胞工程的目标。通过这项研究，我们证明了分泌途径的系统观点现在使分析控制哺乳动物细胞中蛋白质表达的功效和成本的许多生物分子机制成为可能。我们设想我们的模型是研究生物技术中正常生理过程和工程细胞生物过程的有价值的工具。本研究中使用的所有模型和数据均可在以下位置免费获得 从而提出细胞工程的目标。通过这项研究，我们证明了分泌途径的系统观点现在使分析控制哺乳动物细胞中蛋白质表达的功效和成本的许多生物分子机制成为可能。我们设想我们的模型是研究生物技术中正常生理过程和工程细胞生物过程的有价值的工具。本研究中使用的所有模型和数据均可在以下位置免费获得https://github.com/LewisLabUCSD/MammalianSecretoryRecon。
在任何细胞中，分泌机制都在同时处理数千种分泌蛋白和膜蛋白，所有这些蛋白和蛋白竞争竞争分泌途径资源并造成代谢负担。为了量化此负担，我们根据消耗的ATP等效分子总数估算了CHO和人类分泌组和膜蛋白质组中合成和/或分泌5641和3538内源蛋白的能量消耗（请参见方法）。将这些蛋白质成本与CHO细胞中通常产生的5种重组蛋白质的成本进行了比较（图 1a）。为了完善估计，我们预测了信号肽7，GPI锚定附件信号8，并通过实验测量了CHO蛋白质组中N-连接聚糖的数量，并在CHO蛋白质组学数据中整合了O-连接的聚糖的公开发表数量9。在整个CHO分泌组中，蛋白质的合成成本相差很大，重组产品的平均价格也更高（图 1a）。例如，因子8（F8）是在CHO细胞中的难于快速蛋白质由于其聚集倾向在ER，这促进了其过早降解10，11。我们的分析进一步强调，F8的每个分子都需要大量的ATP才能生产（9488 ATP分子）。这给通常表达便宜得多的内源蛋白的CHO细胞的分泌机制带来了很大的负担。
计算每种分泌的CHO（a）和人（c）蛋白的生物能成本。为了比较目的，显示了在CHO细胞中产生的五个代表性生物治疗剂的生物能成本（见表 1）。b通过Kallehauge等人的CHO细胞中的核糖体谱分析和蛋白成本（每种蛋白的ATP数量）测量的基因表达的散点图和Spearman相关性。12在文化的指数增长早期。d斯皮尔曼跨越人类组织ATP成本和基因表达水平（通过RNA-SEQ测量）之间的相关性1，58，59。将人类蛋白质图谱的基因转录水平与产生翻译蛋白质的ATP成本进行了分析。与每个相关性关联的所有p值均<1×10 -20。高度分泌的组织显示出分泌的蛋白质成本与mRNA表达水平之间最强的负相关性。RPKM =每千个转录本的千分之一的读数。源数据作为源数据文件提供。
鉴于不同蛋白质的生物合成成本范围很广，我们想知道哺乳动物细胞中负责高水平蛋白质分泌的基因表达是否受到分泌蛋白质的ATP成本的影响。也就是说，这些分泌细胞是否抑制了其蛋白质表达以更有效地分配营养素？为了测试这一点，我们首先研究了CHO细胞，这些细胞经过了广泛的选择，以获得能够以高滴度分泌重组蛋白的细胞，然后比较了具有一定分泌能力的不同人体组织。
除非特定的蛋白质是必需的，否则CHO细胞可能会优先抑制能量上昂贵的蛋白质。因此，我们分析了来自重组CHO细胞系12的核糖体谱分析（Ribo-Seq）数据，并将每个转录本的翻译与相关分泌蛋白的ATP成本进行了比较（请参见方法）。确实，在培养的早期指数生长期，核糖体占有率与ATP成本之间存在显着的负相关-0.43（Spearman R s，p值<1×10 -20）（图 1b）。想知道减少的翻译是否受转录调控，我们进一步分析了来自同一重组细胞系和另一非重组CHO-K1细胞系的RNA-Seq数据13。RNA表达也与ATP成本呈负相关（请参见补充图 2）。
为了评估这是否是哺乳动物分泌细胞的普遍趋势，我们分析了来自人类组织和人类蛋白质图谱（HPA）1中永生化细胞系的RNA-Seq数据。对于HPA中的所有RNA-Seq数据集，mRNA表达水平与ATP成本之间呈负相关（图 1d）。有趣的是，我们发现高度分泌的组织（例如肝脏，胰腺和唾液腺）具有最强的相关性，尽管没有像选择了高分泌的重组CHO细胞那样强。Feizi等。14最近发现，这些组织可以微调蛋白质二硫键异构酶基因的表达，这表明，由于分泌的单克隆抗体（mAb）包含相对较高的二硫键（17），CHO细胞的内质网中可能发生类似的调节过程。 。总之，在CHO和天然分泌组织中，明显倾向于抑制合成，折叠和分泌成本高昂的蛋白质的表达和翻译。
我们绘制了哺乳动物细胞（即人，小鼠和中国仓鼠）分泌和膜蛋白合成所涉及的核心过程。这包括CHO细胞中的261个成分（基因产物）和人和小鼠中的271个成分。这些成分参与了跨12个子系统的分泌反应（即，分泌途径的功能模块；图 2a）。）。这些成分代表了靶蛋白从胞浆中的未成熟状态（即翻译后）转变为最终形式（即当它包含所有翻译后修饰并分泌到细胞外时）所需的核心分泌机制。空间）。重建中的每个成分要么催化靶蛋白的化学修饰（例如ER内腔/高尔基体中的N联糖基化），要么参与促进蛋白质折叠和/或转运的多蛋白质复合物。催化酶和复合物形成组分之间的区别对于建模目的很重要，因为催化组分消耗或产生直接与代谢网络相连的代谢产物（例如ATP，糖核苷酸）。 2b），我们产生了物种特异性的分泌途径重建，并用它们来扩展各自的基因组规模的代谢网络（Recon 2.2 15，iMM1415 16，iCHO1766 17）。按照新陈代谢对应物的命名约定，我们将这些新的新陈代谢分泌重建物命名为：iMM1685s，iCHO2048s和Recon 2.2s，分别代表1685、2048和1946基因。成分，反应和相关基因的详细列表可以在补充数据 1中找到。
a重组物包含CHO细胞中的261种蛋白质以及人和小鼠中的271种蛋白质，分布在12个子系统中。不同的组件编号来自以下事实：中国仓鼠蛋白质组注释仅包含一个α和一个β蛋白酶体亚基，而人和小鼠则包含12个不同亚型的亚基。b在CHO和人类中发现蛋白质具有高度相似性，在每个子系统中具有较高的均值同一性（使用序列比对工具BLAST计算）。C涉及单克隆抗体（mAb）分泌的反应和子系统的简化示意图。翻译，折叠，运输，糖基化和分泌mAb总共需要八个子系统。子系统名称的颜色指示反应是否发生在细胞质（橙色），ER内腔（红色）或高尔基体（蓝色）中。所有组件的详细说明都可以在补充数据1中找到 。GPI糖基磷脂酰肌醇，ER内质网，ERAD ER相关降解。
我们首先验证使用增长和IgG产生两个独立的研究CHO细胞株的生产率iCHO2048s预测的准确度12，18。为此，我们使用治疗性单抗利妥昔单抗的PSIM矩阵中的信息建立了分泌IgG的iCHO2048s模型。然后，我们在每个研究中使用报告的生产力值限制了模型的利妥昔单抗特异性分泌途径，并使用FBA预测了生长（图 3a）。后来，为了评估iCHO2048s在CHO细胞产生非抗体蛋白的情况下预测生长速率的能力，我们从使用Enbrel和C1抑制剂产生的等基因CHO细胞系的两个分批培养实验中收集了数据。我们针对每种情况构建了两个iCHO2048s模型，并预测了培养的早期指数生长阶段的生长速率，同时将蛋白质分泌速率限制为测得的比生产率值（图 3b）。模型预测与报告的和测量的值非常吻合。在某些情况下，iCHO2048s预测的生长速度要比分批培养的第一天高得多（图 3b）。）。由于FBA在给定的限制条件下计算理论上的最大增长率，因此这些过度预测的情况表明CHO细胞无法将资源引导至生物质生产（在培养的非常早期期间），这种差异在培养的后期逐渐减弱。总之，这些结果证实了蛋白质特异性重建能够捕获每种重组产物对CHO细胞代谢施加的特定能量需求的能力。
一个生长速率用的IgG特异性iCHO2048s模型计算，并与实验测得的生长率从六个数据集使用IgG产生细胞线的两个以前的研究12，18。NT和TK指定了这两项研究的第一作者的名字的缩写（Neil Templeton，Thomas Kallehauge）。b从Enbrel和产生C1INH的CHO细胞获得了更多的生长，生产力和代谢组学数据，并构建了模型。在指数生长期中，模型预测的增长率与在几乎所有时间点上产生Enbrel的CHO细胞和产生C1INH的CHO细胞的实验增长率一致。在所有情况下，都必须限制iCHO2048s模型以测得的单位生产率生产重组蛋白。在补充数据3中报告了用于约束每个iCHO2048s模型的值 。误差棒代表三个生物学重复的标准偏差。源数据作为源数据文件提供。
为了生产特定的产品，CHO细胞可以根据蛋白质属性和翻译后修饰（PTM）利用分泌途径的不同模块。例如，mAb的合成需要使用多个过程并消耗几种不同的代谢产物，例如用于蛋白质翻译的氨基酸，用于形成二硫键的氧化还原当量，用于囊泡转运的ATP等效物以及用于蛋白质糖基化的糖核苷酸（图。 2c）。因此，我们为CHO细胞中常见的生物治疗方法生成了八种特定于产品的分泌途径模型（图 4a））：骨形态发生蛋白2和7（BMP2，BMP7），促红细胞生成素（EPO），Enbrel，VIII因子（F8），干扰素beta 1a（IFNB1），利妥昔单抗和组织纤溶酶原激活剂（tPA）。给定每个模型17测得的葡萄糖和氨基酸摄取率相同，由此产生的iCHO2048s模型用于计算最大细胞生长（μ）和比生产率（q P）之间的帕累托最优边界。（请参阅补充数据 3）。
针对通常在CHO细胞中产生的生物治疗药物，构建了八个针对特定产品的iCHO2048s模型。该蛋白质结构60，61，62，63，64，65，66，67所示是从蛋白质数据库（下载www.rcsb.org用的ID）（以顺时针方向顺序从顶部开始）：1au1，5brr，1HZH ，3alq，1m4u，2h64、4bdv和1eer。b使用相同的约束条件和补充数据3的实验数据，为八个iCHO2048s模型计算了增长-生产率折衷曲线的帕累托最优边界。 。阴影区域对应于在CHO细胞培养物中通常观察到的生长速率下最大生产率的范围。图例中显示了每种生物治疗剂的分子量（以道尔顿为单位）。c使用所有蛋白质功能（PTM，跨膜结构域和氨基酸组成）来拟合多元线性回归，以预测比生产率。模型系数（β）量化了它们对解释的单位生产率变化的贡献。误差棒代表拟合系数的标准误差。源数据作为源数据文件提供。
我们计算了增长率（h –1）和比生产率（每个细胞每天产生的蛋白质的皮克图，或PCD）之间的权衡，作为每种蛋白质的帕累托最优曲线（图 4b）。在CHO细胞可以利用所有可用资源仅用于生物质和重组蛋白生产的假设下，该曲线定义了最大比生产率和最大生长率的前沿。一些曲线中的铰链指示受不同蛋白质需求（例如氨基酸）限制的区域之间的过渡。
对八种生物疗法的帕累托最优曲线的分析表明，在测量的生长条件下，最大生产率从普通生长率的20–100 PCD（图4b，阴影区域）到衰老的CHO细胞的70–150 PCD 不等 。分子量（MW）和产物长度都不能解释不同蛋白质最大生产率的两倍范围差异。例如，曲线显示，尽管tPA（MW = 61,917 Da）较大，但仍能以比BMP2（MW = 44,702 Da）更高的PCD表达，因为BMP2中的N-聚糖由于合成核心N-聚糖的成本较高而降低了生产率。 （见表 1），与先前在酵母5中的观察结果一致。此外，这些作用的程度和方向性将取决于养分吸收率（图 4c和补充图 1），突出显示了在CHO生物处理中需要以宿主细胞和产物特异性方式定制培养基的需求。因此，虽然直觉上较大的蛋白质可望对蛋白质分泌产生更多的生物能成本，但我们发现重组蛋白质和培养基的特定组成属性均会显着影响生物合成能力。Jupyter Notebook C中提供了有关PTM对预期生产率的影响的深入分析。
为了进一步评估分泌途径的功能对蛋白质合成和分泌成本的影响最大，我们使用iCHO2048s及其父代代谢重建iCHO1766 17计算了CHO分泌组中5461种蛋白质的分泌率（请参见方法）。尽管iCHO2048s捕获了蛋白质合成，修饰和分泌所需的所有步骤，但iCHO1766中的分泌反应仅说明了细胞质中靶蛋白的基本合成以及必要的前体（N-连接聚糖，O-连接聚糖，和GPI锚）。我们发现，分泌途径对大多数蛋白质而言具有不可忽略的成本（补充图 3b）。）。此外，与分泌蛋白质相关的蛋白质特征的成本比氨基酸和聚糖成本高出15％以上，这表明O型连接聚糖（p = 0.0065），GPI锚点（p = 0.0216 ）在统计学上富集（在超几何测试中）），跨膜结构域（p = 0.0326）和发往ER内腔的蛋白（p = 0.0142），高尔基体膜（p = 0.0065）或质膜（p = 0.0186），请参见补充图 3d和Jupyter Notebook E ）。因此，这些PTM和跨膜域为其需求增加了额外的成本。
在最近的研究中，Kallehauge等人。图12证明产生抗病毒mAb 19的CHO-DG44细胞系也表达高水平的neoR选择标记基因（图 5a，b）。在neoR击倒，效价和CHO-DG44细胞系的最大活细胞密度增加。为了测试iCHO2048是否可以复制这些结果，我们为Kallehauge等人构建了一个模型。DG44细胞系和测得的外代谢物，以及干细胞重量以参数化模型。由于neoR的表达使用了可用于抗体生产的资源，因此我们预测通过消除neoR可以合成多少其他抗体基因。我们模拟了完全敲除neoR之后的抗体产生（参见表 2和图 5b），并预测删除neoR可以在第3天（早期指数期）和第6天（晚期）将比生产率分别提高4％和29％。阶段）（图 5c）。在质量上与neoR mRNA敲低80–85％时实验观察到的2％和14％值相符。然后，我们在第6天通过计算机敲除条件计算了对照和neoR的帕累托最优曲线。我们发现，当neoR时，曲线的长度（用Δ表示）增加了18％。消除了生产（图 5d）。因此，iCHO2048可以量化多少非必需基因敲除可以通过释放能量和分泌资源来促进CHO细胞的生长和生产力。实际上，来自Kallehauge等人的核糖体图谱数据。他发现，CHO细胞中只有30种分泌蛋白占核糖体负荷的50％以上，而核糖体负荷是针对带有信号肽的蛋白质进行翻译的（图 4e）。实际上，我们最近发现，当剔除14个高丰度宿主细胞蛋白20时，可以释放大量资源，并且可以增加重组蛋白的滴度。使用本文提出的方法对其他潜在宿主细胞基因敲除的分析可以在补充数据4中找到 。
一个核糖体占用是在早期（左）与核糖体分析测量和晚期（右）的指数增长阶段12。b显示了实验培养中活细胞密度（VCD）和滴度的时间曲线。阴影框表示与早期（第3天）和晚期（第6天）生长阶段相对应的时间点。c使用iCHO2048s模型通过计算机敲除neoR基因前后的通量平衡分析来预测比生产率（q p） 。d iCHO2048s预测了增长-生产率的权衡，并表明在neoR之后可能会增加18％在计算机淘汰赛中。权衡改进的计算公式（）显示在图表中。L WT =剔除前的权衡曲线的 长度，L KO =剔除后的权衡曲线的长度。e从Kallehauge等人分析了所有携带信号肽序列的mRNA的核糖体占有率。12项研究表明，分泌的前30种蛋白质占核糖体占有蛋白质的50％以上。误差棒代表三个生物学重复的标准偏差。源数据作为源数据文件提供。
哺乳动物细胞通过其分泌途径合成和加工数千种蛋白质。这些蛋白质中的许多蛋白质，包括激素，酶和受体，对于介导哺乳动物细胞与其环境的相互作用都是必不可少的。因此，许多作为药物或靶标具有治疗重要性。重组蛋白的表达和分泌表示显著合成代谢需求，从细胞代谢排出几种底物（例如，氨基酸，糖核苷酸，ATP）21，22。此外，重组蛋白需要参与其转录，翻译，折叠，修饰和分泌的支持蛋白充分表达。因此，出现了在工程哺乳动物分泌途径，以增强蛋白生产的兴趣日益增加23，24，25，26。尽管在该领域的重大进步27，目前的战略来改造分泌途径仍然主要经验28，29。最近的建模方法，然而，有不同的遗传和环境条件下启用的重要真核细胞的代谢能力分析17，30，31，32。与蛋白质产生细胞，如CHO的基因组尺度模型的开发17，HEK-293 33，和杂交瘤34，35，现在有可能获得一个系统级了解哺乳动物蛋白质生产的表型的36。
已经在努力列举蛋白质生产所需的机械。例如，隆德等。6最近重建了小鼠分泌途径的综合遗传网络。通过比较小鼠和CHO-K1基因组并将CHO基因表达数据映射到该网络上，作者确定了CHO细胞工程的潜在靶标，证明了系统生物学研究和理解动物细胞中蛋白质分泌的潜力。尽管这种遗传网络重建可用于组学组学数据（例如RNA-Seq），但并未用于模拟蛋白质生产，也未与其他细胞过程（如代谢）整合在一起。因此，我们的工作是相辅相成的，因为它允许我们通过描述细胞中所有生物合成步骤和生物能过程的机制来量化蛋白质生产的成本和细胞能力。
在这里，我们提出了与代谢耦合的哺乳动物细胞中分泌途径的第一个基因组规模的重建。我们将其连接到当前的代谢网络，从而产生人，小鼠和CHO细胞的蛋白质分泌和代谢模型。这些模型汇编了数十年的高等真核生物生物化学和细胞生物学研究，并将其呈现为数学模型。使用我们的模型，我们定量估计了在CHO细胞和人类分泌物中产生几种治疗性蛋白质以及所有蛋白质的能量成本。我们还确定了限制单个产品分泌的因素，并观察到这些因素取决于产品的复杂性和培养基的组成。此外，通过将核糖体谱分析数据与我们的模型整合在一起，我们发现CHO细胞已选择性抑制了能量昂贵的分泌蛋白的表达。扩展此观察结果，我们证明了降低能量上昂贵的非必需蛋白质后，可以预期地提高特定生产力。此外，与此一致的是，我们最近发现在CHO细胞中删除14种高度丰富的蛋白质时，宿主细胞总蛋白产量减少50％以上，mAb滴度增加。未来的研究可能会进一步探索可以删除多少CHO细胞蛋白质组以进一步增强重组蛋白的分泌 我们证明了降低能量上昂贵的非必需蛋白质后，可以特异性地提高特异性生产力。此外，与此一致的是，我们最近发现在CHO细胞中删除14种高度丰富的蛋白质时，宿主细胞总蛋白产量减少50％以上，mAb滴度增加。未来的研究可能会进一步探索可以删除多少CHO细胞蛋白质组以进一步增强重组蛋白的分泌 我们证明了降低能量上昂贵的非必需蛋白质后，可以特异性地提高特异性生产力。此外，与此一致的是，我们最近发现在CHO细胞中删除14种高度丰富的蛋白质时，宿主细胞总蛋白产量减少50％以上，mAb滴度增加。未来的研究可能会进一步探索可以删除多少CHO细胞蛋白质组以进一步增强重组蛋白的分泌20。
重要的是要注意，尽管我们的模型捕获了分泌蛋白的主要特征，但是还有其他PTM（例如磷酸化，γ羧化），途径机制（例如分子伴侣）和细胞过程可能会在进一步扩展中捕获。建模框架6（例如，展开的蛋白质反应）。这些可以作为与建立和维护分泌机制有关的精力成本（伴侣蛋白3，二硫键氧化还原酶37，糖基转移酶38）包括在内；蛋白质稳定性和周转率39 ; 溶解度约束40和分子拥挤效应41。由于这些模型以蛋白质产品特有的方式被模型捕获，因此对蛋白质生产能力的预测将得到改善，并且这些模型可以为生物技术的细胞工程学或对淀粉样蛋白疾病的潜在机制提供更深入的了解。最后，我们分泌模型的简化是，它仅计算了将单个代表性的N和O连接的聚糖与分泌的蛋白质合成和连接的生物能成本（即，它不包括不同蛋白质的聚糖结构的微异质性和多样性） 。因此，我们的模型分泌的直接扩张潜力将涉及它连接到蛋白质糖基化的现有计算模型42，43。例如，给定一个捕获目标蛋白44糖型复杂性的N-聚糖反应网络，人们可以针对感兴趣的特定糖型建立分泌反应，并计算与它们各自相关的代谢需求，从而确定潜在的靶标和营养补充剂。糖工程。
总之，我们的研究结果对基于蛋白质特有属性和能量需求预测蛋白质表达的能力具有重要意义。这里的分泌途径模型是研究哺乳动物细胞以及以产物和细胞特异性方式研究生长与蛋白质分泌之间的能量折衷的新颖工具。我们提出了可以为我们的模型提供新颖见解的算法，并期望可以开发出许多其他方法来回答围绕分泌途径的各种问题，如对于代谢45。为促进这些模型的进一步使用，我们提供了有关如何在Jupyter Notebooks中构建蛋白质特异性模型的代码和详细说明，网址为：https://github.com/LewisLabUCSD/MammalianSecretoryRecon。
从文献管理，UniProt，NCBI基因，NCBI蛋白质和CHOgenome.org编制了哺乳动物分泌途径中的蛋白质和酶清单（请参阅补充数据 1）。为了促进重建过程，分泌途径被分为十二个子系统或功能模块（图 1），以根据其功能对成分进行分类。这些子系统对应于加工和分泌蛋白质所需的主要步骤。先前酵母分泌途径重建的成分3被用作初始参考。为了建立物种特异性模型，鉴定并使用了人类，小鼠和中国仓鼠的直系同源物，同时去除了哺乳动物分泌途径中不存在的酵母成分和子系统。当高级真核生物特有时，还添加了其他子系统，例如ER 46中的钙粘蛋白-钙网蛋白循环。这些都是从头建造的，并被添加到重建中。然后查阅数据库和文献，以鉴定涉及哺乳动物分泌途径每个子系统的其余成分。由于已在小鼠和人类中鉴定出哺乳动物分泌途径中的大多数成分，因此通过将BLAST设置为参考生物体并切断60％的序列同一性，利用BLAST鉴定相应的中国仓鼠直系同源物。有关哺乳动物分泌途径的概述及其与酵母分泌途径的比较，请参见 补充讨论。
PSIM（补充数据 2）包含从我们的重建中的模板反应中构建蛋白质特异性分泌模型所需的信息。PSIM中的列包括信号肽（SP）的存在，二硫键（DSB）的数量，糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚的存在，N-连接（NG）和O-连接（OG）聚糖的数量，跨膜结构域（TMD），亚细胞位置，蛋白质长度和分子量。对于大多数蛋白质，PSIM中的信息是从Uniprot数据库中获得的。必要时，可使用计算工具预测信号肽（PrediSi 7）和GPI锚点（GPI-SOM 8）。最后，从实验数据在以前的研究中所获得的关于某些蛋白质的O-连接的糖基化位点的数目更多的信息9，47。CHO和人类分泌基因组的PSIM是完整PSIM的子集，仅包含带有信号肽的蛋白质（在Uniprot中预测或确认）。可以在Jupyter Notebook D中找到所有PTM在人，小鼠和CHO蛋白组中的分布。为了分析分泌组，根据信号肽中序列中存在的信号肽，根据它们中的注释，共提取了3378种人蛋白。 UniProt数据库。同样，根据UniProt数据库，根据信号肽序列中的信号肽的存在和/或将其定位在细胞膜中，提取了5641个CHO蛋白。
PSIM中N-连接的糖基化位点的数目通过以下实验确定。CHO-K1细胞（ATCC）被胰蛋白酶裂解，变性，还原，烷基化和消化。将脱盐的肽与10 mM高碘酸钠在黑暗中孵育1 h，然后偶联至50μL（50％浆液）酰肼树脂上。温育过夜后，将非糖基化的肽用1.5M NaCl和水洗涤。N-糖基化的肽与PNGaseF在37°C下释放，并使用C18 SepPak柱脱盐。使用强阳离子交换（SCX）色谱将样品分成8个馏分。在LTQ-Orbitrap Velos（Thermo Electron，Bremen，Germany）质谱仪上分析每个级分。在质谱数据分析中，将氨基甲酰甲基化设置为固定修饰，而将氧化，焦谷氨酰胺，
我们用Python编写了Jupyter笔记本（请参阅Jupyter笔记本A），该记录从PSIM中获取一行作为输入，以生成扩展的iCHO2048，Recon 2.2s或iMM1685s代谢模型，以及相应蛋白质的产物特异性分泌途径。使用MATLAB R2015b中的COBRA工具箱v2.0 49和Gurobi求解器版本6.0.0 ，完成了通量平衡分析（FBA 48）和所有其他基于约束的分析。图中的分析。 2，3，4使用在补充数据的约束条件进行 3。对于分泌人类蛋白质的iCHO2048s模型，我们在所有模型中都设置了相同的约束条件，并计算了理论上的最大生产率（max qp），同时保持0.01的增长率（以小时为单位）。最后，由于CHO中大多数蛋白质的确切糖谱是未知的，有些甚至在培养50中会随时间变化，因此我们通过仅将核心的N-连接和O-连接的聚糖添加到分泌的蛋白质中来简化模型。
将两种适于悬浮培养的等基因CHO-S细胞系（美国Thermo Fisher Scientific）以3×10 5个细胞/ mL 接种，其中一个生产Enbrel（Etanercept），另一个生产人血浆蛋白酶C1抑制剂（C1INH）。在60mL的CD-CHO培养基（赛默飞世尔科技，USA），补充有8mM的升谷氨酰胺（Lonza）中和1每毫升μL抗结块剂（Life Technologies）中，在250个毫升的Erlenmeyer摇瓶中。将细胞在37°C，5％CO 2的潮湿培养箱中培养在120 rpm下。使用NucleoCounter NC-200细胞计数器（ChemoMetec）每24小时监测存活的细胞密度和活力7天。通过从每种培养物中吸取0.8 mL，将其以1000× g离心10 min并收集上清液并弃去细胞沉淀，来获取废培养基的每日样品以测定细胞外代谢物的浓度和滴度 。
为了量化Enbrel和C1INH效价，使用Octet RED96（Pall Corporation，Menlo Park，CA）进行生物层干涉测量。ProA生物传感器（Fortebio 18-5013）在磷酸盐缓冲液（PBS）中水合，并在10 mM甘氨酸pH 1.7中进行预处理。使用Enbrel（Pfizer）或C1INH以200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78μg/ mL制备标准曲线。离心后收集用过的培养基样品，并在30°C下以200 rpm的振荡速度进行120 s结合。使用Octet System Data Analysis 7.1软件来计算结合率和绝对蛋白质浓度。
葡萄糖，乳酸，铵（NH 4 +），用BioProfile 400（Nova Biomedical）测量用过的培养基中的谷氨酰胺。使用Dionex Ultimate 3000自动进样器通过高效液相色谱法以每分钟1毫升的流速测定氨基酸浓度。简而言之，使用20μL样品，80μLMiliQ水和100μL内部氨基酸标准液将样品稀释10倍。使用荧光检测器监测衍生的氨基酸。在340ex和450em nm处检测到OPA衍生的氨基酸，在266ex和305em nm处检测到FMOC衍生的氨基酸。定量基于源自混合氨基酸标准品（250 ug / mL）稀释液的标准曲线。定量的上限和下限分别为100和0.5μg/ mL。
我们估计了合成和分泌所有5641种内源性CHO细胞蛋白和3538种内源性人类蛋白的能源成本。选择这些蛋白质以使其序列中包含信号肽和/或定位在细胞膜中（根据UniProt数据库）。使用以下公式和假设计算分泌每种蛋白质（长度L）的能量消耗（以ATP当量数为单位）。
翻译的能量成本：对于每个产生的蛋白质分子，在转移RNA充满特定氨基酸的过程中，2 L ATP分子被裂解为AMP；在启动过程中消耗了1个GTP分子，在终止过程中消耗了1个GTP分子；L-1 GTP分子是形成L-1肽键所必需的；L-1 GTP分子对于L-1核糖体易位步骤是必需的。因此，翻译的总成本（假设没有校对）为4L。
信号肽降解的平均成本：平均而言，信号肽的长度为22个氨基酸。因此，降解信号肽中所有肽键的平均成本为22。将该平均成本分配给所有分析的蛋白质。
跨ER膜转运的能量成本：在转运启动子激活期间，两个胞质GTP分子被水解。从那里开始，通过折叠子孔46的每40个氨基酸将与折叠辅助伴侣BiP结合的GTP分子水解为GDP 。因此，运输成本为（L÷40）+ 2。
囊泡运输和分泌的能量消耗：我们使用公布的数据显示51，52，53（见补充资料 1）计算涉及囊泡运输的反应的化学计量系数。也就是说，每种囊泡（COPII和分泌囊泡）中结合到RAB和外壳蛋白上的GTP分子的数量。我们发现总共必须水解192和44个GTP，以分别将一种COPII或分泌型（即网格蛋白包被的）囊泡从原始膜转运到目标膜。由于囊泡一次不转运单个蛋白分子，因此我们估算了适合球形囊泡的分泌蛋白分子的数量（请参阅补充数据1中的估计直径和假定直径 ）。为此，我们假定分泌的蛋白质为球形，体积为V P（nm 3）与分子量MW 54成正比：
最后，我们假设目标蛋白只能占据囊泡体积的70％。因此，经由COPII囊泡囊泡运输的，带有音量成本V COPII是：
同样，水泡分泌的成本为：
所有模型都使用不同的实验摄取率集进行约束，这可以在补充数据3中找到 。为了构建帕累托最优边界，我们分别使用Matlab 2015b中COBRA Toolbox v2.0中的robustAnalysis函数，其中以生物质为对照，以重组蛋白的分泌为目标反应。
核糖体图谱数据12用于量化CHO细胞中每个转录本的核糖体占有率。1 RPKM的临界值用于除去低表达基因（从第3天分析中除去了10,045个基因，从第6天分析中除去了10,411个基因）。我们使用Spearman相关性来评估表达水平相对于蛋白质ATP成本的变化。
核糖体谱分析数据，比生产率，产物序列和产生IgG的CHO-DG44细胞系的生长速率是从先前的出版物中获得的12。从相同的培养物中，我们从用过的培养基中获得了进一步的细胞干重和代谢组学数据，用于本研究。所述mCADRE算法55，56被用于构建一个DG44线特异性细胞iCHO2048s模型。分泌的IgG的比生产率和RPKM值用于估计neoR选择标记基因的翻译率。我们假设通过neoR翻译反应的流量（以每小时每克干重的毫摩尔为单位）（v neoR）应与IgG翻译率（v IgG，由测得的比生产率计算）成正比，并与它们的表达率（即，核糖体谱数据中其基因的RPKM值）相关。
最后，添加neoR肽翻译的反应（其在细胞质中表达而在分泌途径中不被处理），以构建neoR特异性的iCHO2048s模型。在细胞培养的第3天和第6天，相关代谢物的摄取和分泌速率被用来约束我们的模型。由于重组蛋白占总细胞蛋白57的 20％，因此我们相应地缩放了模型生物量反应中所有20个氨基酸的系数（即，每个系数乘以0.8）。然后，我们使用FBA预测带有或不带有neoR的IgG的比生产率。
为了进行细胞干重测量，将六个装有2 mL具有已知细胞密度和活力的培养样品的试管冷冻干燥，称重，在PBS中洗涤，然后再次称重。重量差用于计算每个细胞的质量。该程序导致每个细胞的平均细胞干重为456 pg。为简化起见，我们假设细胞干重与培养期间的平均测量值没有显着差异，因此在所有模拟中计算通量分布时都使用了该值。
补充数据 3包含用于约束iCHO2048s模型实验的吸收和分泌速率12，22，23。当我们咨询的研究中没有明确说明利率时，我们使用了我们先前开发的方法27。简而言之，使用WebPlot Digitizer软件将合适的活细胞密度，滴度和代谢物浓度图数字化，然后我们计算出相应的速率，如下所示：
增长率（以小时为单位）：
VCD是活细胞密度（以每毫升细胞为单位）比生产率（以每小时每细胞皮克为单位）：
代谢物x的消耗量或生产率v x（以每小时每克干重的毫摩尔为单位）：
有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的《 自然研究报告摘要》。
https://github.com/LewisLabUCSD/MammalianSecretoryRecon以及补充数据和源数据文件中提供了所有支持本研究结果的数据，包括模型，表格和Jupyter笔记本。Kallehauge等人研究的Ribo-Seq和RNA-Seq数据。在具有GEO登录号GSE79512的基因表达综合中可获得12。人体组织的RNA测序数据可在Human Protein Atlas网站（https://www.proteinatlas.org/about/download）上免费获得。
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