摘要
肠毒素性脆弱类杆菌是一种肠道病原体，被描述为各种肠道感染和炎性疾病的病原体。此外，各种研究报告表明它是结直肠癌发展的主要因素。作为正常人类微生物组的一部分，由于对可用抗生素的惊人抵抗力，其治疗已成为一项挑战。尽管这种脆弱的B. gilgilis菌株对几种抗生素都表现出易感性，但有必要设计出一种有效的疫苗消除策略。迄今为止，尚无针对这种病原体的疫苗。因此，我们系统地探索了仅在有毒物质中发现的产生外膜毒素的蛋白质脆弱型芽孢杆菌通过计算机内方法来预测多表位嵌合疫苗构建体。设计的蛋白质由表位组成，这些抗原表位可预测外膜蛋白的线性B细胞，辅助细胞和T细胞，这些蛋白有望成为候选疫苗。最终的蛋白质仅在产肠毒素的脆弱类芽孢杆菌中表达，因此证明它们是排他的。首先预测蛋白质的3D结构，然后通过利用生物信息学方法对其进行完善和验证。设计的蛋白质与TLR2受体的对接预测了适体结合。免疫模拟后，在免疫细胞的表达中观察到显着水平。
人体微生物组是与人体共同进化的数万亿微生物物种的大型储存库。从人类开始以来，这些微生物就一直在建立选择性的生态系统，这些生态系统取决于特定的栖息地，同时又适应宿主的生理1。这些在人的肠道中形成稳定群落的微生物被认为是免疫和代谢止血的关键调节剂。此外，肠道微生物组还可以作为对特定病原体感染2的抵抗力的调节剂。根据多项研究，可以得出结论，根据细胞数量，智人的微生物种类更多，约占3.8·10 13细菌细胞的数量和人细胞的3.0·10 13 3。正常微生物种群的任何破坏都被认为是营养不良，这是指居住在健康个体4中的居民共生种群的组成发生了变化。由于人类微生物组已发现在宿主过程的发展中具有重要地位，因此观察到其组成的这种变化可能是导致各种病理状况发生和维持的主要因素5。人类肠道中的微生物结构可能受到各种决定因素的影响，例如饮食，宿主的基因组成，季节性感染和医疗干预，例如抗生素的频繁使用和不当使用。交替使用抗生素是使人群易患免疫疾病的主要原因6。
出不同种类的驻留在人体肠道，拟杆菌是表示在结肠十到微生物群体存在的总的百分之二十一高度支配门7。该门的成员非常重要，因为它们涉及许多重要机制。这种细菌谱系是进化过程中最早出现的一种。属于该特定组的细菌是厌氧的，无芽孢的细菌，革兰氏阴性杆菌，对胆汁8有抵抗力。脆弱芽孢杆菌是拟杆菌科动物中最引人注目的成员，因为它具有多方面的作用，可以发挥机会性病原体的作用。此外，它是临床标本中因此确定的最常见的厌氧菌，据报道是一种有毒物种9。根据细菌分泌一种名为脆弱类芽孢杆菌毒素（一种依赖于锌的金属蛋白酶）的毒素的能力，该细菌物种进一步分为两类。产生这种毒素的菌株被称为易产肠毒素的脆弱博德特氏菌（ETBF），而非分泌类被称为非致毒素性脆弱的博德利氏菌（NTBF）10。肠毒素性脆弱杆菌是肠道腹泻和炎症的主要病因，在某些情况下，它会导致大肠癌的发展。这种脆弱的芽孢杆菌菌株产生的脆菌素毒素具有裂解细胞内附着于β-catenins的E-钙粘着蛋白的能力。这种切割的结果是，胞质溶胶中游离连环蛋白的量增加，这成为c-myc癌基因转录的主要因素，而c-myc癌基因是T细胞因子的一部分。大量研究证实，脆弱杆菌毒素是第一种具有激活Tcf依赖性β-catenin核信号传导能力的细菌毒素，因此，脆弱杆菌已成为肠道细胞中致癌性转化的有力贡献者11.
结肠直肠癌是指结肠或直肠（结肠直肠）中未定义的细胞分裂，结肠或直肠是人类胃肠道的主要部分。在数量上，它在男性中被诊断为第三大复发癌症，在女性中被认为是第二大癌症12。根据世界卫生组织（WHO）收集的数据，2018年全球所有年龄段的人中都报告了近1,849,518例结直肠癌病例，而据报道，2018年全球死亡人数为880,792 13。此外，大肠癌的区域发病率相差十倍，其中澳大利亚和新西兰是登记的发病率和死亡率最高的国家中排名最高的国家，其次是欧洲和北美。相反，在中南亚和非洲发现的发病率和死亡率的最低速率13，14。根据患者的年龄组，已经报道了许多与疾病发作和变异有关的特征。由于大肠癌给公众造成的经济负担和严重的健康问题，已经启动了许多控制程序来管理这种危险的病例。疾病控制与预防中心于2005年启动了其大肠癌控制计划（CRCCP）。该计划的基本目标是有效监控患有大肠癌的人群并提供直接筛查服务。由于在50至75岁之间罹患这种癌症的风险越来越高，因此该计划的重点是为跨过50 15岁的人们提供筛查服务。
有许多用于治疗大肠癌的筛查程序，但导致其发病机理的主要驱动因素仍被忽略。有效地管理肠道中的脆弱肠毒素B.必不可少，以最大程度地减少导致疾病发生的压力环境。抗生素是治疗这种脆弱脆弱芽孢杆菌菌株的主要来源，但是由于存在抗生素抗药性现象，曾经被用来治疗所引起的感染的那些药物现在失去了功效。已发现在大多数情况下，环丙沙星，红霉素，氨苄青霉素，四环素均对脆弱的芽孢杆菌群具有抗药性16。通过考虑所有这些因素，设计新的治疗策略以解决与脆弱的产芽孢杆菌相关的危及生命的状况已变得至关重要。
各种研究已证明，革兰氏阴性细菌利用了将毒力因子转运至宿主的III型，IV型和VI型分泌系统，但是，对脆弱的产双歧杆菌的遗传分析并未表明它们的存在。系统而是显示了一个T6SS基因座。T6SS是一种多蛋白复合物，分为三个不同的基因座，分别称为GA1，GA2和GA3 17。GA3基因座特别存在于脆弱芽孢杆菌中，被认为是新型免疫蛋白和效应子的来源。但是，未发现此基因座与脆弱脆弱芽孢杆菌的毒素分泌有关。由脆弱的肠毒素性芽孢杆菌形成了由外膜囊泡（OMV）组成的大量酶，这表明这些OMV在出口过程中的重要性18。
进行了这项工作以通过计算机方法设计预防性疫苗。根据一项完善的研究，肠毒素性脆弱型芽孢杆菌由称为BfPA1的致病岛组成，该致病岛包含在接合转座子CTn86中。该研究进一步报道了与致病岛相关的排毒蛋白的存在，这些蛋白最有可能通过OMV传递给宿主。该研究计划的重点是通过使用独特的蛋白质（即仅在目标细菌的产毒菌株中发现的脆弱素溶素毒素蛋白和金属蛋白酶II蛋白），来创建一种针对脆弱的拟杆菌的强效多表位疫苗候选物19。
从NCBI数据库检索选择的蛋白质的序列，以构建针对脆弱的产双歧杆菌的多表位疫苗。本研究中使用的两种蛋白WP_005797262.1和WP_005797263.1是根据它们在肠毒素性脆弱芽孢杆菌中的唯一存在而选择的。SignalP 4.1预测了信号肽分裂后蛋白质的功能序列。根据结果，这些蛋白质具有分泌信号肽。DeepLoc和Vaxign预测了蛋白质的定位，根据这两种蛋白质都位于细胞外区室中。然后将蛋白质序列进一步进行B，T和Helper细胞的表位预测。该鼠李糖乳杆菌GG 50 s核糖体蛋白L2（AXI95322.1）从UniProt数据库中收集，由于已报道了益生菌菌株的佐剂特性及其与TLR2受体20相互作用的能力，因此在疫苗模型中用作佐剂。佐剂是疫苗制剂中的重要组成部分，因为它会增强其效力21。
各种在线服务器用于B细胞表位的预测，但仅选择复发表位来构建嵌合疫苗。BepiPred 2.0和BCPred同时预测了这些表位，因此被纳入多表位疫苗设计中（表 1 ）。
NetCTL 1.2服务器预测两种最终蛋白的总和为35个CTL（9-聚体）配体。选择默认参数来预测表位，其中基于其高结合得分最终确定了04个表位（表 1 ）。
NetMHCII 2.2 Web服务器基于IC 50得分预测了与人类等位基因（即HLA-DR，HLA-DQ和HLA-DP）对应的具有最高结合力的MHC-II表位。最终嵌合构建体总共选择了04个HTL表位（表 1 ）。
针对UniProt数据库对指定蛋白质进行的全面BLAST分析显示，发现外膜蛋白在脆弱的肠毒素B. gil 。中是高度保守的，因为它们是在其他脆弱性B. giltis和B.的非毒素菌株中不存在的毒素产生蛋白。的物种杆菌分别（表 2，3）。根据已鉴定的B细胞和T细胞表位的多序列比对，发现了产肠毒素的脆弱拟杆菌。表 1 - 3整体表现在其他蛋白质的保护拟杆菌和最终表位的同一性百分比。
总共04个线性B细胞表位，04个CTL表位和04个HTL表位用于构建多表位疫苗嵌合体。通过添加佐剂L2核糖体蛋白佐剂，构建了疫苗。AXI95322.1位于肽序列的氨基（N）末端，并通过EAAAK接头与第一个B细胞表位连接，以促进特异性免疫应答。此外，B细胞和HTL表位通过GPGPG接头连接在一起，而为了连接CTL表位，使用了AAY接头。在疫苗序列的C末端，掺入6xHis标签用于蛋白质鉴定和纯化。最终的嵌合构建体由512个氨基酸组成，分子量为54 kDa （图 1 ）。
最终的多表位疫苗蛋白的示意图。512个氨基酸长的蛋白质序列，在氨基末端包含佐剂（浅紫色），通过EAAAK接头（紫色）与多表位序列相连。B细胞表位和HTL表位使用GPGPG接头（蓝色）连接，而CTL表位借助AAY接头（深蓝色）连接。在羧基末端添加了一个6x-His标签，用于纯化和鉴定。
VaxiJen 2.0 Web服务器通过选择阈值0.4来预测佐剂疫苗设计的抗原性，细菌模型的抗原性为0.765，病毒模型的抗原性为0.622。ANTIGENpro预测其抗原性评分为0.933909。还检查了候选疫苗的抗原性，但不包括佐剂部分，在微生物模型中VaxiJen给出的评分为0.7326，在病毒模型中得分为0.4933，阈值为0.4。这些结果表明，与佐剂连接或不与佐剂连接的疫苗蛋白质序列本质上都是抗原性的。AllerTOP v.2和AllergenFP在线服务器预测，在存在和不存在佐剂的情况下，疫苗序列本质上都不会引起过敏。
ExPASY ProtParam预测特定疫苗蛋白的分子量（MW）为54 kDa。蛋白质的pI（理论等电点值）经计算为9.75。根据该值，该蛋白质被认为本质上是高度碱性的。测定的蛋白质半衰期在体外在哺乳动物网织红细胞中为30小时，在酵母中为> 20小时，在大肠杆菌中为 > 10小时。此外，基于对PROSO II的估计，发现该蛋白质在其表达中是可溶的，溶解度得分为0.558。ProtParam预测该蛋白的不稳定性指数（II）为35.64，将其列为稳定模型，因为大于40的值表示不稳定性。该蛋白质的脂族指数估计为72.27，证实了其热稳定性22。重力，该蛋白的亲水性的总平均值被预测为-0.5。负值表示该蛋白质本质上是亲水的并且可以容易地与水分子23相互作用。
RaptorX产生了嵌合蛋白的二级结构，结果表明该蛋白构成8％螺旋，27％β链和66％螺旋（图 2a，b ）。除此之外，根据氨基酸残基的可及性，预计52％被暴露，21％培养基被暴露，25％被埋藏（图 2c ）。发现总共11％的残基位于无序域中。
最终亚单位疫苗序列的二级结构特征的图形表示。（a，b）预计该蛋白质包含螺旋（8.0％），β链（25.0％）和卷曲（66.0％）（c）根据氨基酸残基的可及性，预计52％会暴露在外，预计21％的中等暴露培养基和25％的培养基被掩埋在设计的蛋白质中。
I-TASSER服务器通过使用10个线程模板预测了嵌合结构的5个三级结构模型。在这些模型中，最好的是3i1nC，5czpA，5czpY，3j3v和6hmaC。根据所选的10个模板的Z分数值（从1.78到2.86），它们具有良好的对齐方式。服务器提供的五个模型的C得分值介于-1.85至-3.22之间。标准C分数通常在-5和2之间，其中正值表示更可信。在这项研究中，从同源性模型中获得的最高C评分模型被选为未来的优化方案（图 3a–c ）。结果表明预测的TM得分为0.991，RMSD值为0.784±3.7Å。为了分析两种蛋白质结构之间的相似性，评估了TM分数，该分数消除了与RMSD值有关的所有波动。TM得分大于0.5的模型显示准确的拓扑结构，而TM得分小于0.17的模型表示非特异性相似性24。
蛋白质建模，完善和验证。（a）在I-TASSER上进行同源性建模后获得的多表位疫苗的最终3D模型。（b）通过ModeRefiner获得的改进模型（c）GalaxyRefine 改进的3D结构。用（d）Ramachandran图分析验证精炼模型，显示偏爱，允许和不允许（离群）区域分别有93.7％，4.5％和1.8％的蛋白质残留，以及（e）ProSA-web，Z值为−6.04。
最初，未加工的嵌合疫苗模型由ModRefiner进行了完善，然后在提供五个模型的GalaxyRefine上进一步完善了最终的结构。在这些模型中，基于多个参数（例如GDT-HA（0.9932），RMSD（0.254）和MolProbity（1.989））选择了模型1。计算得出的冲突得分为10.7，较差的漫游者得分为0.2，而Ramachandran图预测的得分为93.1％。因此，该模型最终被选作嵌合模型，用于以后的研究。
蛋白质模型的Ramachandran图分析预测，精制蛋白质模型的93.7％残基存在于有利区域中。该分数与通过GalaxyRefine程序获得的93.1％分数保持稳定。此外，发现4.5％的残留物存在于允许区域中，而只有1.8％的残留物存在于不允许的或离群的边界中（图 3d ）。ProSA-web和ERRAT服务器验证了整体质量以及改进模型中可能出现的错误的发生。研究中的改进模型被认为是合适的，因为使用ERRAT可以显示87％的品质因数，而ProSA-web的Z评分为-6.04 （图 3e ）。
对七个不连续B细胞表位的预测揭示了其中共有290个残基，得分从0.529至0.977不等。发现这些表位的大小在3至226个残基的范围内（表 4，图 4 ）。
ElliPro预测的B细胞不连续表位。（a-g）脆弱肠产肠杆菌的最高抗原性嵌合蛋白的构象或不连续表位的三维表示。表位由黄色表面表示，蛋白质的大部分由灰色棒表示。
为了启动疫苗嵌合体与TLR2免疫受体的相互作用，CASTp 3.0服务器预测了蛋白质和蛋白质表面疏水接触的结合。结果鉴定出结合袋，其可以用作与TLR2受体相互作用的可能位点。口袋的分子表面积为35560.7埃2与35804.9埃的分子表面体积3，嘴分子表面是5825.3埃2分子表面周长总和为6362Å。为了确认TLR2产生免疫反应的能力，有必要根据其构象估算所设计蛋白质与TLR2停靠复合物的稳定性。在这两种复合物的对接（数据驱动）之后，进行了TLR2和蛋白质以及TLR2和佐剂之间相互作用的比较。CPORT预测了提供的活性界面氨基酸残基：佐剂中的T214，T6，L7，T9，A13，G12，L208，A11，SS10，H58，I4，A20，S19，L59；以及来自嵌合蛋白的A211，A13，T6，M16，G18，S19，T27，I24，P21，L26，T9，S10，L7，P332，A11，L59，T214和H58和I46，S45，S68，S48，A71 TLR2的A链中的S70，G52，G53，A74，T65，T66，G92，A44，L50，A31，C60，L28，G49和T51。这些活性残基用于驱动对接方案。从HADDOCK结果中，选择了具有最高分子间能量的最高位姿的对接化合物（设计的蛋白质-TLR2复合物（−239.2 Kcal / mol），佐剂-TLR2复合物（−368.1 Kcal / mol），从这些HADDOCK簇中选择在界面处具有最低的平均成对主链RMSD（蛋白质-TLR2复合物（3.9Å，佐剂-TLR2复合物（0.8Å））。蛋白质-TLR2复合物的相对结合自由能（ΔG）（-9.9 Kcal / mol）和佐剂-TLR2复合物（-9.1 Kcal / mol）表明该嵌合蛋白与佐剂位点相连，从而促进了经证实的变化，从而支持了TLR2受体的刺激，此外，在两者之间形成了15个氢键。 TLR2和疫苗的活性残基，而 在佐剂-疫苗复合物的情况下，在相互作用的表面上形成14个氢键。对两种复合物之间每个属性的界面接触（IC）数量的分析表明，疫苗和TLR2复合物的预测（带电荷的IC：7，极性-极性：13，IC的非极性-非极性：7）的预测更多。比佐剂和TLR2复合物的预测值要高（带电的IC：4，带极性的IC：6，带非极性的IC：6）（图 5 ）。
亚单位疫苗与免疫受体（TLR2）的分子对接。（a）疫苗-TLR2复合物的对接复合物，蛋白色为海绿色，TLR2链A为中等蓝色，界面颜色为黄色和洋红色，（b）佐剂-TLR2复合物为佐剂为深绿色，TLR2链为彩色中等蓝色，界面为洋红色和黄色。（c）嵌合疫苗-TLR2复合物的界面活性残基，其蛋白活性残基为黄色，品红色为TLR2活性残基，以及（d）佐剂-TLR2复合物，其蛋白活性残基为黄色，而TLR2活性残基为品红色。
为了优化大肠杆菌（K12菌株）中嵌合肽的密码子以最大程度地展现蛋白质，使用了Java密码子适应工具（JCat）。通过该工具优化的密码子序列的长度为1500个核苷酸。CAI也称为密码子适应指数，计算得出为0.988，适应序列的平均GC含量为51.36％。这样的GC值表明所设计的疫苗在所选微生物宿主中的潜在稳定表达（图 6 ）。良好的GC含量的最佳范围是30％至70％。此外，将设计的序列整合到大肠杆菌中pET-28a（+）载体可实现最佳基因表达。这是通过并入限制性酶切位点，然后通过SnapGene软件将遗传序列克隆到载体中来实现的（图 7 ）。
最终疫苗蛋白质的密码子优化。如图所示，优化密码子的CAI为0.988，平均GC含量预计为51.36％。
最终蛋白质计算机内限制性克隆到pET28a（+）载体中。红色部分代表设计的疫苗蛋白的基因序列，黑色部分代表大肠杆菌载体的骨架。6xHis标签位于克隆的构建体的羧基末端。
为了分析最终嵌合疫苗构建体产生的免疫反应，免疫模拟器C-ImmSim进行了与免疫系统形成的真实反应相匹配的模拟。这些反应表明次级免疫反应的启动中有很高的峰值。相对地，在第二反应和第三反应期间，在第一反应中记录了高水平的IgM，然后是B细胞群激增。此外，随着抗原浓度的最小化，发现IgG1 + IgG2，IgG + IgM抗体与IgM一起增加（图 8a ）。轮廓说明了反复暴露后免疫系统中的记忆形成（图 8b ）。随着记忆的进一步增强，据报道在细胞毒性和辅助细胞群中有预期的反应（图 8c，d ）。
嵌合蛋白的分子模拟。（a）对随后的抗原注射产生免疫球蛋白的产生（黑色竖线）；彩色峰表示免疫细胞的亚类。（b）注射3次后B细胞群的变化。（c）注射后每个状态的T辅助细胞的发育和（d）T细胞毒性细胞群。重复暴露的结果是，未表达抗原的细胞以静止状态表示，而显示出对抗原耐受性的T细胞则以无反应状态表示。
肠毒素B. fragilis是临床标本中鉴定出的最常见的厌氧菌，可引起与肠道和泌尿生殖道有关的不同类型的感染25。据报道，该产毒菌株引起严重的脓肿形成和菌血症，因为它被认为是唯一的感染微生物26。无氧感染是造成全球死亡的主要原因，而产肠毒素的脆弱类芽孢杆菌经常与此类感染相关，死亡率为19％。据估计，这个速度可以高达60％，如果引起的感染脆弱拟杆菌不及时治疗27。此外，在各种鼠科动物模型中，已经发现了肠毒素致弱的B. gilgilis与大肠癌的发生之间存在很强的联系28。迄今为止，抗生素一直被用于治疗此类感染，但随着全球抗生素耐药性的出现，这些方案也已失去了针对这种产毒菌株的功效。已证明对克林霉素，头孢西丁，四环素，哌拉西林-他唑巴坦，亚胺培南甚至美罗培南的耐药性增强29。尽管可以使用化学治疗剂来治疗各种感染，但是由于耐药性，管理不善和复杂感染的风险，总是存在临床复杂性的机会。因此，需要时间为脆弱的B.gilgilis的产毒菌株开发有效的治疗疫苗。目前，尚无针对该特定菌株的预防或治疗疫苗，因此，本研究的重点是设计一种合适的亚单位疫苗，因为此类疫苗已报告了安全性和可行性30。基于多种表位的疫苗是独特的，因为它们通过消除针对抗原中不利表位的反应来刺激特异性免疫反应31。此外，表位疫苗具有相对更安全的特性和增强的效力，同时将免疫应答特别集中在选定的表位上32。
这项研究的主要重点是利用计算机内方法开发一种抗表皮致病性脆弱双歧杆菌的多表位亚单位疫苗蛋白。总共使用两种蛋白质来产生蛋白质序列。这些蛋白质是细胞外蛋白质，在脆弱的B. gil。肠毒素菌株中表达。这些选择的蛋白质具有成为有效疫苗候选者的潜力，因为它们在目标微生物33的毒性中起着重要作用。
据报道，对产肠毒素的脆弱类杆菌的免疫依赖于B细胞和T细胞，因为该菌株产生的多糖负责正常免疫反应的介导34。TLR特别是TLR2和TLR4参与了针对脆弱脆弱芽孢杆菌的免疫反应已有报道35。有研究报道了TLR2与细菌多糖结合的特异性36。在另一项研究中，揭示了TLR2受体与TLR1一起是识别脆弱类芽孢杆菌的主要模式识别受体37。由于在与脆弱脆弱芽孢杆菌感染相关的病例中TLR2被认为参与了免疫调节和细胞因子的诱导，因此，我们最初从两种选择的蛋白中鉴定出B和T细胞表位，然后通过合适的接头将它们融合在一起，从而产生a多表位候选疫苗。间隔序列因其最佳效果而在开发疫苗中很重要38。在以往的研究中使用GPGPG和AAY接头23，39将其整合在预测的表位之间，以产生具有最佳抗原性的蛋白质序列，从而产生合理的疫苗构建体。在设计中还结合了EAAAK接头，用于将佐剂与第一个预测的B细胞表位连接。据报道，该接头的参与设计了增强融合蛋白40的双功能蛋白。
生物信息学分析与免疫学分析相结合，表明疫苗构建体充满了I类MHC，II类MHC具有增强的结合线性和不连续B细胞表位。最终疫苗中没有变应原特性，进一步证实了其作为候选疫苗的潜力。很少有研究证明多表位疫苗构建体的抗原性差，并建议与有效的佐剂偶联41。然而，尽管不存在和存在佐剂，这种发达的嵌合体仍具有令人满意的抗原性评分。与鼠李糖乳杆菌的益生菌L2核糖体蛋白偶联GG预测抗原性评分更高。我们设计的蛋白质的分子量为54 kDa，经分析可溶，这与其刺激的抗原性相符。发现该蛋白的理论pI为9.75，证实了该蛋白的基本性质。该蛋白的不稳定性指数预计为35.64，这证实了该蛋白在表达时将保持稳定，从而增强了其作为疫苗模型的推定用途。嵌合疫苗的脂族指数也证明它是热稳定的。所有这些参数证实了我们设计的蛋白质的热稳定性。二级和三级结构对于设计候选疫苗是必不可少的。我们的嵌合蛋白的二级结构预计主要由卷曲组成（66％），残基只有11％。随着蛋白质3D结构的细化和改善，在Ramachandran图上观察到了较好的特性。这表明大多数残基存在于偏爱区域中，而异常区域中的残基很少，因此表明设计模型的质量令人满意。
为了分析TLR2与设计的蛋白质的相互作用，由于在疫苗构建物中使用了益生菌佐剂，因此进行了蛋白质对接。从佐剂和嵌合体-佐剂与免疫受体的连接计算出的结合能证实了我们开发的蛋白质可能引发保护性免疫反应。
设计疫苗蛋白的免疫模拟显示与免疫反应相协调的结果。当抗原反复暴露于抗原时，通常会增强免疫反应。在这种情况下，B和T细胞的发育是指示性的，并且据报道也刺激了辅助T细胞。预计随着T H产量的增加会产生体液反应。
验证设计的疫苗蛋白的主要方法之一是针对需要在适当宿主中表达的免疫反应性对其进行过滤42。对于重组蛋白的生产，大肠杆菌表达系统是最优选的选择43。为了在大肠杆菌中表达我们设计的疫苗构建体（菌株K12），进行了密码子的优化。对于蛋白质在微生物中的最大表达，密码子适应性指数（0.988）和GC含量（51.36％）是理想的。
为了有效消除脆弱的产肠毒素的B.杆菌，新型疫苗必不可少，因为对病原体的抗生素耐药性正在日益提高。在这项研究中，计算机内工具被用于构建编码多个B细胞和T细胞表位的潜在疫苗。因此，为这项研究选择的蛋白质仅在脆弱的产芽孢杆菌中表达，因此被证明是消除病原体的公认候选者。
总共选择了两种蛋白质来制备疫苗。这些蛋白在产肠毒素的脆弱布鲁氏菌菌株中表达。致病岛产生了肠毒素Fragilysin和第二种金属蛋白酶（MP II）蛋白，它们的共同作用导致了本病原体的毒性。从NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）以FASTA格式检索到蛋白质WP_005797262.1和WP_005797263.1的完整氨基酸序列。此外，SignalP 4.1服务器用于分析信号肽（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），以区分分泌和非分泌蛋白。它还通过利用各种人工神经网络来指示蛋白质中切割位点的定位44。在Vaxign（http://www.violinet.org/vaxign/）上检查了蛋白质的亚细胞定位，这是一种基于疫苗的反向流水线，可以利用PSORTb 2.0预测各种亚细胞的位置，据报道PSORTb 2.0对96％45。为了达到预测定位的准确性，还对蛋白质进行了DeepLoc 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/ ）的处理，该工具在深度神经网络的辅助下提供了真核蛋白质的亚细胞定位。46.
线性B细胞表位在疫苗设计和生产过程中起着不可或缺的作用。这些表位被表征为由免疫系统鉴定的抗原决定簇。此外，B淋巴细胞与抗原的这些特定片段结合并引发免疫应答47。对于本研究，线性B细胞表位主要由BepiPred-2.0网络服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/）。它基于基于森林的算法的原理，该算法基于蛋白质的抗原抗体结构的带注释表位。与其他可用服务器相比，该服务器可生成可靠的表位预测，因为它考虑了蛋白质的3D结构和从IEDB数据库48收集的线性表位的数据库。使用了多种预测B细胞表位的工具，因为该策略有助于获得准确的结果。接下来，对蛋白质序列进行BCPred（http://ailab.ist.psu.edu/bcpred/），可用于线性表位预测。该服务器在字符串内核上起作用，以通过融合三肽相似性和倾向性得分来预测抗原表位。服务器的AUC值在可接受范围内49。
使用NetCTL 1.2服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/）预测所选蛋白质的细胞毒性T淋巴细胞。NetCTL服务器通过集成三个重要过程（例如MHC I类结合肽，蛋白酶体C末端裂解和与抗原加工（TAP）转运蛋白效率相关的转运蛋白）的评估来预测CTL。借助该门户网站，可以预测12种MHC I类超型的CTL表位，但在本研究中，仅使用了A1超型。NetCTL服务器根据人工神经网络预测结果，并生成权重矩阵，该矩阵预测TAP转运蛋白的效率。使用默认设置（阈值0.75）估算CTL表位50。
通过使用NetMHCII 2.2服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/）预测了选定的两个蛋白质序列的辅助T细胞15-mer表位。NetMHCII服务器利用人工神经元网络来预测肽与人类等位基因HLA-DR，HLA-DQ和HLA-DP的连接。此外，服务器根据通常从IC 50值推断出的受体亲和力来预测MHC II表位。根据标准，高亲和力肽落在<50 nM IC 50值51的范围内。
为了确保选择用于疫苗构建物设计的所选蛋白质仅在脆弱的B. gilgilis的产毒菌株中表达，在UniProt数据库上进行了BLAST搜索，以获取所选蛋白质相关亲戚之间的身份等级。此外，在相关的拟杆菌属中同源蛋白的多序列比对之后，还估计了所选表位的保守程度。选择进行比较的物种包括无毒的脆弱类芽孢杆菌，即脆弱类芽孢杆菌YCH46，脆弱类芽孢杆菌638 R，脆弱类芽孢杆菌NCTC 9343确保所设计的疫苗仅针对产毒菌株，不会对同一物种的普通菌株造成任何伤害。选择了拟杆菌（Bacteroides distasonis），卵形杆菌（Bacteroides ovatus），拟杆菌（theactotamicron），寻常杆菌（Bacteroides vulgatus）和统一杆菌（Bacteroides uniformis）候选菌是基于它们在厌氧感染中的高贡献52。
通过结合B细胞的高得分表位，CTL和高亲和力结合HTL表位，设计了推定的疫苗候选序列。BepiPred和BCPred服务器同时预测了B细胞表位。为了增强蛋白疫苗的免疫原性，优选使用益生菌鼠李糖乳杆菌 GG（登录号AXI95322.1）的50 s核糖体蛋白L2 作为佐剂，其序列来源于UniProt数据库（http：//www.uniprot .org /）。佐剂通过EAAAK接头在序列的N末端与第一个B细胞表位连接，而其余的B细胞和HTL表位通过GPGPG接头相互连接。使用AAY接头连接CTL抗原决定簇，并在C末端添加6x His标签用于蛋白质鉴定和纯化。
为了预测嵌合构建体的抗原性，使用了VaxiJen v2.0和ANTIGENPro服务器。VaxiJen v2.0是一种易于访问的服务器（http://www.ddgpharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html），可对蛋白质进行自动和交叉变异（ACC）转换并将其转换为统一的主体向量氨基酸特性。它在不涉及任何比对的情况下产生蛋白质的抗原性，并专注于所选候选物53的理化特性。使用另一台服务器猜测所设计肽的抗原性质。ANTIGENPro（http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/）是一款免费服务器，它使用特定的微阵列数据来计算蛋白质抗原性指数。根据交叉验证实验，报告的服务器准确性为76％54。
通过AllerTOP v2.0和AllergenFP可以预测多表位疫苗的致敏性。AllerTOP v2.0（http://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP）是一种可免费访问的服务器，它利用了机器学习方法，例如氨基酸E描述符，自动和交叉方差转换以及k个最近邻居，用于对过敏原进行分类。经过五次交叉验证，此服务器的准确性为85.3％55。AllergenFP是另一种在线服务器，它利用基于描述符的指纹方法来区分抗原和过敏原。这种方法是无对齐的，包括四个主要步骤。结果，以0.759 56的马修斯相关系数实现了88％的精度。
为了评估设计疫苗序列的溶解度，使用了PROSO II在线服务器（http://mbiljj45.bio.med.uni-muenchen.de:8888/prosoII/prosoII.seam）。该服务器使用分类器，该分类器能够识别存储在TargetDB和PDB中的可溶性和非可溶性蛋白之间的微小差异。在10倍交叉验证中进行评估得出的准确度为71％，ROC曲线57下的面积为0.785 。此外，通过使用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）服务器58评估了设计的蛋白质序列的许多物理化学性质。
PSIPRED和RaptorX用于生成疫苗蛋白的二级结构。PSIPRED（（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）是可免费访问的在线服务器。它利用位置特定的迭代BLAST来识别和选择与设计疫苗显示出显着相似性的那些序列总体而言，PSIPRED 3.2的Q3得分为81.6％59 .接下来，为了预测二级结构，使用了另一个Web服务器RaptorX（http://raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/predict/）。结合了创新的机器学习方法DeepCNF，可提供令人满意的精度一次提供二级结构，溶剂可及性和无序区域60.
然后将最终的多表位疫苗序列置于I-TASSER服务器进行同源性建模（https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）。I-TASSER（迭代线程优化）是排名最高的服务器，可用于自动蛋白质结构的生成和预测。在提交氨基酸序列后，I-TASSER通过利用多线程比对和迭代结构装配模拟61来设计3D原子模型。另一个在线服务器Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）也用于所设计肽段的同源性建模。该服务器使用最新的检测方法来构建三维结构，并预测配体结合位点62.
通过I-TASSER服务器获得的三维蛋白质模型，通过使用ModeRefiner（https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ModRefiner/）和GalaxyRefine（https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ModRefiner/）进一步经历了两步优化程序。http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type=REFINE）在线服务器。ModeRefiner致力于两步原子能级最小化过程，该过程可从Cα痕迹构建和精制给定的蛋白质结构。该程序有助于增强局部和全局结构，并提供准确可靠的结果63。接下来，实施了GalaxyRefine以改善蛋白质结构。该服务器利用建立侧链并重新包装侧链的优化方法，从而通过集成动态仿真最终实现了结构的整体松弛。各种实验已经将该服务器视为改善本地和全局结构64的质量的最佳优化服务器之一。
为了评估设计模型的稳定性，它的验证是不可或缺的，因为它可以检测到预测的3D蛋白质模型中可能存在的潜在错误。为此，最初使用ProSA网络服务器（https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php），该服务器通常用于验证蛋白质的三级结构。它根据所有已知蛋白质结构的上下文来计算总体质量得分。然后，将结构的错误部分显示在服务器的分子查看器65中。威拉特（ERAL），Withal（http://services.mbi.ucla.edu/ERRAT/）用于分析非键合原子与原子之间的相互作用，同时将其与高分辨率晶体学结构进行比较。为了生成Ramachandran图，使用了MolProbity和RAMAPGAE服务器。Ramachandran图是一种用于可视化构成氨基酸的psi（ψ）和phi（φ）的能量允许和不允许的二面角的方法。该计算主要基于侧链的范德华半径进行。MolProbity（http://molprobity.biochem.duke.edu/）是一种全原子结构验证在线服务器，可提供Ramachandran分析66。RAMPAGE（http://mordred.bioc.cam.ac.uk/~rapper/rampage.php）是另一种可免费访问的服务器，该服务器集成了PROCHECK原理，可通过应用Ramachandran图来验证蛋白质模型并划分甘氨酸和脯氨酸残基67。
为了预测验证的蛋白质模型中B细胞的不连续表位，使用了ElliPro（http://tools.iedb.org/ellipro/）。根据一些报道，估计B细胞中90％以上的表位是不连续的。可免费访问的在线服务器主要集成了三种算法来稳定蛋白质形状，然后计算残基突出指数。作为回报，这导致了基于它们的PI值的相邻残基的聚类。ElliPro是同类服务器中最好的服务器之一，其AUC估计得分为0.732，对于预测68而言是重要得分。
只有当抗原分子与宿主中的特定免疫受体相互作用时，才可以产生适当的免疫反应。对于这种疫苗构建体，发现TLR2受体是一种合适的免疫受体，其结合口袋和空腔可通过使用CASTp服务器（http://sts.bioe.uic.edu/castp/）进行鉴定。CASTp是一种高效的在线服务器，可识别和测量表面可访问的结合袋，并提供与给定蛋白质69内部不可接近的腔有关的信息。
接下来，该过程中，将HADDOCK 2.2 Web服务器用于与TLR2受体的多表位嵌合疫苗构建体的分子对接，该结构的结构来自PDB（https://www.rcsb.org）。将肽与特异性免疫受体对接有助于分析配体与受体之间的相互作用，从而引导免疫应答的形成。TLR2已经发现在肠道疾病在炎性肠病和结肠直肠癌特异性保护性免疫70，71，72。对于分子对接，进行了数据驱动的设计蛋白质与TLR2的对接以及佐剂与TLR2的对接。选择的佐剂是50 s核糖体蛋白L2（登录号AXI95322.1），其结构是通过使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）预测的。该蛋白具有促进TLR2受体的能力，因此可作为TLR2激动剂73。
准确预测哪些残基将在对接相互作用参与，CPORT（https://milou.science.uu.nl/services/CPORT/）中的溶液采用74。它预测了疫苗蛋白界面上的活性残基，包括佐剂，佐剂和TLR2。在收集了涉及结构的主动和被动残基后，使用HADDOCK 2.2（http://haddock.science.uu.nl/services/HADDOCK2.2）对疫苗蛋白-TLR2和佐剂-TLR2 进行对接模拟。复合材料75。高模糊度驱动坞站（HADDOCK）是基于python的服务器，它使用晶体学系统进行结构收集。服务器以顺序方式工作，首先，结构正确定向，然后执行其后续对接计算。然后，服务器确认最终结构并调用分子动力学模拟阶段。通过利用范德华力和静电能项76来预测所提供结构的分子间和分子内能。复合物的结合亲和力通过采用PRODIGY服务器（预测https://nestor.science.uu.nl/prodigy/）77。
为了在选择的表达载体中掺入并表达设计的多表位构建体，必须对蛋白质序列进行反向翻译和密码子优化。为此，使用了在线Web服务器Java Codon Adaptation Tool（JCAT）。最终构建体在大肠杆菌（K12菌株）中表达，因为天然寄主脆弱型芽孢杆菌与该菌株不同。使用JCAT（http://www.prodoric.de/JCat），提供了三个附加选项，以避免终止不依赖rho的转录，原核核糖体的结合位点和限制酶的切割位点。从该工具收到的输出包括一个密码子适应指数（CAI）和GC含量的百分比，该百分比指示该蛋白的表达水平。密码子使用偏倚由CAI表示，其中1的分数被认为是理想的，而大于0.8的分数属于良好和可接受的类别。蛋白质序列的GC含量应在30-70％的范围内，因为该范围以外的分数表明对转录和翻译性能有不利影响78。通过使用SnapGene软件，将设计的疫苗序列转化为合适的宿主载体pET-28a（+）。
为了分析最终候选疫苗的免疫反应，通过C-ImmSim服务器（http://150.146.2.1/C-IMMSIM/index.php）执行了免疫模拟。该在线服务器基于位置特定评分矩阵（PSSM）来预测免疫原性表位和免疫相互作用。对于候选疫苗，将所有默认模拟参数与指定的时间步长分别设置为1、42和84。因此，在时间79进行了3次注射。
研究期间生成或分析的所有数据均包含在提交的手稿中。可以使用登录号从UniProt数据库（uniport.org）中检索分析的蛋白质序列。
|
|
