摘要
环状RNA（circRNA）是在许多细胞过程和肿瘤中新近鉴定出的非编码RNA。这项研究旨在研究hsa_circ_0037251（一种由称为METRN的基因的几个外显子产生的circRNA）在神经胶质瘤进展中的作用。通过体外实验，我们发现hsa_circ_0037251的高表达与microRNA miR-1229-3p的低表达有关和高表达的mTOR。过度表达的hsa_circ_0037251促进神经胶质瘤细胞增殖，侵袭和迁移，而敲低hsa_circ_00037251则促进细胞凋亡并诱导G1期阻滞。然后，观察到hsa_circ_0037251直接使miR-1229-3p海绵化，并且将mTOR鉴定为miR-1229-3p的直接靶标。此外，敲低hsa_circ_0037251可以上调miR-1229-3p的表达并抑制mTOR的表达。而miR-1229-3p的过表达或低表达的mTOR会抑制神经胶质瘤细胞的进程。此外，即使使用siRNA敲除hsa_circ_00037251，用mTOR过表达载体转染也可以恢复神经胶质瘤细胞发展的能力。体内实验表明，hsa_circ_00037251促进了异种移植肿瘤的生长并缩短了生存期。这些结果表明hsa_circ_0037251可以通过hsa_circ_0037251 / miR-1229-3p / mTOR轴充当肿瘤启动子，并且这些潜在的生物标记物可能是神经胶质瘤的治疗靶标。
作为最常见的原发性恶性肿瘤在中枢神经系统，神经胶质瘤占所有脑肿瘤的27％和所有恶性脑肿瘤的80％的1，2，3。胶质母细胞瘤占所有恶性神经胶质瘤的50.0％以上，发病率增加，死亡率高3。尽管在阐明这些肿瘤的生物学机制，甚至进行根治性手术切除，然后进行辅助放疗和/或化学疗法方面取得了重大进展，但患者的临床预后较差，诊断和积极治疗后中位生存时间少于15个月2。此外，神经胶质瘤的确切原因尚不清楚1，4。鉴于这些发现，必须确定具有新靶标的治疗方法，以预防这些恶性肿瘤并提高患者生存率。
Hsu和Coca-Prados首先使用电子显微镜5在真核细胞中观察到环状RNA（circRNA），随后在酵母线粒体6中发现环状RNA 。由于它们的保守序列，circRNAs可以具有在发病的调节潜在作用7，包括发生和肿瘤发展8，9，10，11，12，13，14，15。具体而言，circRNA参与许多癌症的发生，例如肝细胞癌，胃癌，大肠癌等16。此外，circRNAs已被验证为“微小RNA（miRNA）海绵” 11，12，13，窝藏多个miRNA和充当miRNA的抑制剂14，15。这些circRNA-miRNA调控网络影响靶基因，最终调控癌症的发展和转移。目前的研究还发现，一些circRNAs通过降低miRNA的表达促进神经胶质瘤癌变11，12。然而，在神经胶质瘤中，circRNA-miRNA网络对涉及细胞增殖，凋亡，细胞周期调控，侵袭和迁移的靶基因的确切机制尚不清楚。关于神经胶质瘤进展的更深入研究是必要的。
Hsa_circ_0037251是由编码陨石蛋白（METRN）的基因的几个外显子产生的circRNA，据报道它在增殖17和分化18中均起作用胶质母细胞。在初步实验中，我们从神经胶质瘤样品及其配对的正常组织中产生了深RNA测序数据，并鉴定了miRNA和候选基因，我们发现hsa_circ_0037251在神经胶质瘤组织中过表达。相反，miR-1229-3p在神经胶质瘤组织中低水平表达。hsa_circ_0037251和miR-1229-3p在神经胶质瘤进展中的关系需要进一步研究。我们还关注了最丰富和差异表达的基因。例如，雷帕霉素（mTOR）蛋白的哺乳动物靶标是高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，属于PI3K相关激酶家族19。研究表明，mTOR通路在脑肿瘤细胞增殖中被上调20。miRNA的下调通过mTOR信号通路21与胶质母细胞瘤细胞恶性肿瘤相关。巧合的是，通过生物信息学分析，我们发现hsa_circ_0037251和mTOR的3'-非翻译区（UTR）共享miR-1229-3p的miRNA反应元件（MRE），这提示神经胶质瘤中hsa_circ_0037251和mTOR之间存在关联。
因此，我们假设hsa_circ_0037251可能通过以miRNA介导的方式影响mTOR的表达而参与神经胶质瘤的发展。为了解决这一推测，进行了体外或体内生物学和分子实验。
在这项研究中，与正常细胞系NHA细胞相比，U373和U251细胞中的hsa_circ_00037251表达显着增加（图 1a）。相反，与NHA相比，U373和U251细胞中的miR-1229-3p表达显着降低（图 1a）。然后，我们通过敲除hsa_circ_00037251在U373和U251细胞系中的作用进一步研究了其潜在功能（图 1c和2）。在未进行基因敲除治疗的NC组中，神经胶质瘤细胞比具有hsa_circ_00037251沉默的其他组表现出显着强的增殖，侵袭和迁移能力（图 1c和2）。如图1c所示 MTT分析显示，si-circ_00037251转染后，与NC组相比，U373和U251细胞的增殖减少（P <0.01）。从功能上讲，流式细胞仪检测显示，与NC组相比，神经胶质瘤细胞凋亡和G1期阻滞得以促进（图 2）（P <0.01）。
Hsa_circ_0037251在神经胶质瘤细胞系中过表达，而过表达的hsa_circ_0037251与促进的细胞增殖有关，而敲低hsa_circ_00037251则抑制细胞增殖。（a）与正常人星形胶质细胞（NHA）细胞系相比，在神经胶质瘤细胞系中hsa_circ_0037251的表达显着上调。Line0代表刚刚取得，但尚未在我们的实验室中传代细胞系，和LINE-表示已传代培养稳定的细胞系。有生物学上的每个复制组中的6个技术重复（line0或LINE1），分别。（b敲低hsa_circ_00037251促进miR-1229-3p的表达并抑制mTOR的表达。蛋白质印迹中不同蛋白质表达的全长凝胶在补充信息中显示 。（c）在胶质瘤细胞系中用si-circ_0037251转染后，细胞增殖受到抑制。** P <0.05 [显示的所有数字均具有代表性。每个实验的技术重复次数（n值）为6。基于标准偏差获得误差棒。
过表达的hsa_circ_0037251与胶质瘤中细胞的侵袭和迁移有关，而敲低hsa_circ_00037251则促进胶质瘤细胞凋亡，诱导G1期停滞。（a）Transwell测定（放大倍数：×200；比例尺：100μm）显示，在神经胶质瘤细胞系中用si-circ_0037251转染后，细胞侵袭能力受到抑制。（b）伤口愈合试验（放大倍数：×100；比例尺：50μm）显示，在神经胶质瘤细胞系中用hsa_circ_00037251 siRNA（si-circ_0037251）转染后，细胞迁移能力受到抑制。（c）用si-circ_0037251转染后，在神经胶质瘤细胞系中促进了细胞凋亡。（d）在胶质瘤细胞系中用si-circ_0037251转染后诱导了G1期阻滞。** P <0.05 [显示的所有数字均具有代表性。每个实验的技术重复次数（n值）为6。基于标准偏差获得误差棒。
同时，用si-circ_00037251转染后，在神经胶质瘤细胞系中观察到miR-1229-3p水平显着升高（图 1a）（P <0.01）。此外，用si-circ_00037251转染还导致mRNA和蛋白质表达水平的mTOR表达显着降低（图 1b）（P <0.01）。
萤光素酶报告基因测定用于确定hsa_circ_0037251和mTOR的3'-非翻译区（UTR）是否共享miR-1229-3p的MRE（图 3a）。将含有野生型3'UTR序列和miR-1229-3p模拟物（miR-1229-3 pm）的萤光素酶报道分子共转染到293T细胞中可使萤光素酶强度降低约40％（图 3b）。我们发现，miR-1229-3 pm和突变的萤光素酶报告基因的共转染对萤光素酶活性没有显着影响（图 3b）。此外，我们测量hsa_circ_0037251和在使用293T细胞系的miR-1229-3p的相对表达水平ΔΔ Ct法（图 3C）。
Hsa_circ_00037251充当miR-1229-3p的分子海绵，而miR直接由miR-1229-3p靶向。（a）显示hsa_circ_0037251和miRNA的结合位点的示意图：在野生型hsa_circ_0037251序列（Circ-Wt）和突变序列（Circ-Mut）中预测的miR-1229-3p（miR）结合位点；预测的mTOR中的miR-1229-3p结合位点（mTOR-Wt）和突变序列（mTOR-Mut）。（b）萤光素酶报告基因测定表明，Circ-Wt + miR组的萤光素酶强度明显降低。（c）293T细胞中hsa_circ_0037251和miR-1229-3p的表达水平表明，Circ-Wt + miR组中检测到的miR-1229-3p表达水平与Circ-Mut + miR组相比有很大差异。（d）萤光素酶报告基因检测表明，mTOR-Wt + miR组的萤光素酶强度明显降低。（e）293T细胞中miR-1229-3p和mTOR的表达水平表明，与mTOR-Mut + miR组相比，在mTOR-Wt + miR组中检测到的mTOR mRNA表达水平存在很大差异。** P <0.05 [显示的所有数字均具有代表性。每个实验的技术重复次数（n值）为6。基于标准偏差获得误差棒。
预测mTOR是miR-1229-3p的直接靶标（图 3a）。进行了与mTOR（野生型或突变的3'UTR）和miR-1229-3p模拟物共转染的293T细胞的荧光素酶报告基因检测（图 3d）。野生型3'UTR和miR-1229-3p的组中的荧光素酶活性显着减弱，而3'UTR和miR-1229-3p突变的组中的荧光素酶活性未受影响（图。 3D）。此外，RT-PCR被用于确定mTOR和miR-1229-3p在293T细胞系中的表达（图 3e）。
基于hsa_circ_00037251，miR-1229-3p和mTOR的相互作用，我们接下来通过转染miR-1229-3p模拟物和mTOR siRNA评估了miR-1229-3p / mTOR轴的潜在功能（图 4a）。如图 4b-d所示，miR-1229-3p的强制表达或mTOR的表达降低均显着促进神经胶质瘤细胞凋亡，诱导G1期阻滞和抑制细胞增殖。另外，与NC组相比，用miR-1229-3pm或mTOR siRNA处理的细胞的侵袭和迁移被显着抑制（图 5）。转染miR-1229-3p模拟物和mTOR siRNA不会显着影响上游分子的表达（图 4a））。在进一步的抢救实验中，即使使用siRNA敲除hsa_circ_00037251，用mTOR OV转染也可以恢复神经胶质瘤细胞的增殖，侵袭和迁移能力（图 4和5）。
miR-1229-3p / mTOR轴在影响神经胶质瘤细胞增殖，细胞凋亡和G1期阻滞中起关键作用，转染mTOR过表达载体（OV）后可以挽救神经胶质瘤细胞的增殖。（a）显示了治疗和分组方法以及不同组中的表达水平。具有救援实验的C组首先用hsa_circ_00037251 siRNA（si-circ_0037251）转染，然后用mTOR OV转染。（b）在神经胶质瘤细胞系中进行不同的转染测定后，细胞增殖能力显着不同。A组的结果表明，用miR-1229-3p模拟物治疗后，胶质瘤细胞的增殖受到抑制。在mTOR OV转染后，胶质瘤细胞增殖可以恢复。（c在不同的转染实验后，胶质瘤细胞系中的细胞凋亡水平显着不同。A组的结果表明，在用miR-1229-3p模拟物处理后，神经胶质瘤细胞凋亡得到了促进。在mTOR OV转染后，胶质瘤细胞凋亡可以被抑制。（d）在神经胶质瘤细胞系中进行不同的转染测定后，G1期停滞水平显着不同。用miR-1229-3p模拟物处理可促进神经胶质瘤细胞系的G1期阻滞。转染mTOR OV后，可以抑制G1期阻滞。** P <0.05，*** P <0.01 [显示的所有数字均为代表。每个实验的技术重复次数（n值）为6。基于标准偏差获得误差棒。
miR-1229-3p / mTOR轴在影响神经胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力中起关键作用，转染mTOR过表达载体（OV）后可以挽救神经胶质瘤细胞侵袭和迁移的促进作用。（a）显示了治疗和分组方法以及不同组中的表达水平。（b）在神经胶质瘤细胞系中进行不同的转染试验（放大倍数：×200；比例尺：100μm）后，细胞侵袭能力显着不同。miR-1229-3p模拟物的治疗抑制了胶质瘤细胞的侵袭。在mTOR OV转染后可以恢复胶质瘤细胞的侵袭。（c在神经胶质瘤细胞系中进行不同的转染试验后，细胞迁移能力显着不同。用miR-1229-3p模拟物进行的治疗可抑制神经胶质瘤细胞迁移（放大倍数：100；比例尺：50μm）。在mTOR OV转染后可以恢复胶质瘤细胞的迁移。** P <0.05 [显示的所有数字均具有代表性。每个实验的技术重复次数（n值）为6。基于标准偏差获得误差棒。
该被检体内实验显示hsa_circ_0037251or的敲低上调的miR-1229-3p的导致更小的肿瘤体积，降低了较少的肿瘤重量（图 6A，B）。生存分析表明，hsa_circ_0037251抑制或miR-1229-3p的重新引入导致更长的生存期（图 6c）。此外，营救实验促进了胶质瘤肿瘤的生长（图 6a–c）并缩短了裸鼠的生存期（图 6c）。在切除的肿瘤以及mTOR中也检测到hsa_circ_0037251和miR-1229-3p的表达水平（图 6d，e）。
Hsa_circ_00037251 在体内促进异种移植肿瘤的生长。（一）代表图片去除异种移植瘤。（b）分别总结了肿瘤的体积和小鼠的体重。C组的结果表明，mTOR OV转染后可恢复肿瘤生长。（c）C组的存活期明显短于A组和B组。在24只裸鼠中，只有4只裸鼠（A组2只，B组1只，C组1只）存活超过40天。（d）给出了在异种移植肿瘤中hsa_circ_0037251，miR-1229-3p和mTOR mRNA的相对表达水平。（e）还通过免疫组织化学（放大倍率：×200；比例尺：100μm）检测mTOR蛋白的表达，并计算积分光密度（IOD /面积）。在C组中，mTOR蛋白高表达。（f）显示了在胶质瘤细胞中经由miR-1229-3p的hsa_circ_0037251机制的示意图。** P <0.05，*** P <0.01 [显示的所有数字均为代表。每个实验的技术重复次数（n值）为6。基于标准偏差获得误差棒。
神经胶质瘤，具有高复发率，是脑肿瘤的最频繁出现的亚型之一1，2，3。为了揭示神经胶质瘤进展背后的机制和发现新的可靠的治疗目标，越来越多的基础研究都集中在circRNAs 22，23。
功能和分子实验表明，hsa_circ_0037251可能对神经胶质瘤细胞的进展有积极作用。在这项研究中，我们观察到神经胶质瘤细胞系中hsa_circ_0037251的过度表达。高表达hsa_circ_0037251的NC组比其他组具有更强的增殖，侵袭和迁移能力。敲低hsa_circ_0037251诱导细胞凋亡和G1期阻滞，表明其具有促肿瘤作用。类似的促癌也已在其他研究中观察到22，23。最近的研究还表明，其他circRNAs胶质瘤肿瘤形成作为监管机构22，23，这是有关hsa_circ_0037251在神经胶质瘤中调节功能的第一份报告。同时，体内实验也支持hsa_circ_0037251的促肿瘤功能。这些结果表明神经胶质瘤的进展受到多种circRNA的影响，hsa_circ_0037251可能是神经胶质瘤的重要启动子。
此外，hsa_circ_00037251充当miR-1229-3p的分子海绵。与其他肿瘤24中的表达分析结果不同，miR-1229-3p在神经胶质瘤组织和细胞系中明显下调。这种表述与Butkyte 等人的研究结果不一致。24。在他们的研究中，miR-1229-3p的表达在其他肿瘤中通常被上调24。为了进一步阐明miR-1229-3p的特定作用，对miRNA和基因进行了微阵列分析。渐渐地，通过荧光素酶报告基因测定证实了hsa_circ_0037251对miR-1229-3p的海绵作用。hsa_circ_0037251和miR-1229-3p的表达水平呈负相关，而敲低hsa_circ_00037251可以促进miR-1229-3p的表达。同样，在最近的研究中，有报道称一种名为circRNA_100290的circRNA对神经胶质瘤25中的其他miRNA具有海绵作用。据报道，另一种称为circ-ITCH的circRNA可以作为神经胶质瘤26中 miR-17 / miR-224的海绵。因此，海绵状作用在神经胶质瘤中很常见，并且可能是促进神经胶质瘤进展的重要机制之一。
此外，hsa_circ_0037251可以通过miR-1229-3p / mTOR轴发挥其调节功能。在这个调控轴上，通过调节miR-1229-3p和mTOR的表达来显着改变神经胶质瘤细胞的增殖，侵袭和迁移能力，而转染miR-1229-3p模仿物或mTOR siRNA则显着促进神经胶质瘤细胞的凋亡和G1期。逮捕。这些结果表明，miR-1229-3p / mTOR轴对神经胶质瘤的circRNA-miRNA调节具有不可或缺的抑制作用。类似的促肿瘤circRNA-miRNA基因调控轴也可以在其他肿瘤中检测到25。为了坚持，Chen 等。证明circRNA_100290可能通过刺激miR-29b家族成员在口腔癌中的作用，作为内源性促肿瘤RNA来调节CDK6表达25。然而，Yang 等。发现另一种circRNA-miRNA基因轴显示出对肿瘤进展的抑制作用26。他们指出，circ-ITCH通过circ-ITCH / miR-17，miR-224 / p 21，PTEN轴在膀胱癌中起抑癌作用26。因此，从上述方面来看，可能是特定的调控轴最终决定了hsa_circ_0037251的作用。
此外，本研究结果还表明，mTOR是circRNA-miRNA网络的下游靶标，用mTOR OV转染后可以挽救神经胶质瘤的肿瘤促进功能。如我们在有关调节网络的假设中所预期的，我们发现抑制hsa_circ_0037251可增加miR-1229-3p的表达，但会降低mTOR的表达。并且mTOR被确定为miR-1229-3p的靶标，因此miR-1229-3p的上调会降低mTOR的表达。此外，一些其他的研究已经报道了mTOR信号的上调可能促进肿瘤发生27，28和mTOR的抑制复合物块的细胞周期和细胞凋亡的诱导28，29，30。尽管表达不足的hsa_circ_0037251或表达过高的miR-1229-3p的神经胶质瘤细胞显示出下调的进展能力，但通过mTOR OV转染可显着恢复其增殖，侵袭和迁移能力。这些表明在救援实验中，mTOR OV逆转了si-circ_0037251的抑制作用。可以看出，无论hsa_circ_0037251和miR-1229-3p的表达水平如何，作为下游靶标，mTOR都是影响神经胶质瘤进展的直接因素之一。
但是，更有效，准确和特异的RNA干扰方法仍有待开发。并且需要进一步的具体研究来确定hsa_circ_0037251是否在某些其他病理过程中起作用。此外，需要更严格的实验条件来研究mTOR在细胞质和细胞核中的分布。尽管如此，我们的研究还是第一个研究包括hsa_circ_0037251在内的环状METRN RNA在神经胶质瘤中的作用和机制，并揭示circRNA的作用对于理解神经胶质瘤的发病机制至关重要，并为鉴定新的生物标志物或新的潜在治疗靶点提供了新颖的见解。脑胶质瘤。
总之，结果表明，hsa_circ_0037251可能通过使miR-1229-3p海绵化而在神经胶质瘤的发展中发挥其调节功能，并最终调节mTOR的表达。鉴定出的hsa_circ_0037251 / miR-1229-3p / mTOR轴可为神经胶质瘤提供潜在的生物标志物和治疗靶标。
人U373，U251胶质瘤细胞系和人胚肾（HEK）293T细胞购自上海生物科学研究所细胞资源中心。我们还从Sciencell研究实验室（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）购买了原代正常人星形胶质细胞（NHA）。胶质瘤细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养基（美国Gibco，美国）中于37°C培养，并置于含有5％CO 2的潮湿环境中。将同一批次的细胞稳定传代培养5代。在6个月内进一步分析稳定继代培养之前和之后保留的细胞系。
将细胞接种在6孔板中（4×10 5个细胞/孔）。24小时后当细胞融合度达到80％时，将细胞用丝裂霉素C（1 µg / ml； Sigma-Aldrich； Merck KGaA）在37°C处理1 h。然后，我们使用200 µl移液器吸头在细胞单层表面上形成伤口。将细胞在细胞培养箱中培养，并将倒置显微镜（Motic Instruments，里士满，不列颠哥伦比亚省，加拿大）用于图像采集，在24小时放大倍数为100。还计算了相对迁移率[相对迁移率＝（两个边缘之间的初始间隙-两个边缘之间的迁移的间隙）/两个边缘之间的初始间隙]。
Transwell插入物和Matrigel分别购自Corning Incorporated（美国纽约州Corning）和BD Biosciences（美国加利福尼亚州圣何塞）。我们将200 µl细胞培养基中的总共4×10 3个细胞添加到预先涂有Matrigel的Transwell插入物中，然后将800 µl补充有30％FBS的培养基添加到下腔室中。此后，将细胞转染并在细胞培养箱中培养，并使其侵袭24小时。冲洗后，我们去除了膜顶部的细胞。在室温下用4％多聚甲醛处理细胞（通过膜侵入）20分钟，并用0.5％结晶紫染色5分钟。倒置显微镜（Motic Instruments，列治文，不列颠哥伦比亚省，加拿大）用于放大倍数为200的图像。
将总共3×10 4 293T细胞一式三份接种在24孔板中。根据生产商的说明，与相应的质粒和miRNA模拟物或抑制剂共转染后48小时，使用双重荧光素酶报道基因分析系统（Promega，Madison，WI）进行荧光素酶报道基因分析。相对荧光素酶活性根据海肾荧光素酶的内部对照进行标准化。
使用ABI PRISM7900系统（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的Applied Biosystems系统）确定MiRNA的浓度，并使用ABI PRISM7500系统进行circRNA和mRNA的定量。在使用ΔΔCt方法进行计算之前，小核U6的水平用于标准化miRNA的表达水平，GAPDH的水平用于标准化circRNA和mRNA的相对表达水平。用于定量实时PCR的引物如下：hsa_circ_0037251、5'-CTGCTTTGGAGGTGATGGGAC-3'（正向）和5'-GGGAGTCGGGGCGCTCTCAC-3'（反向）；miR-1229-3p，5'-CCACTGCCCTCCCA-3'（正向）和5'-GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCTGT-3'（反向）；mTOR，5'-CTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTC-3'（正向）和5'-GAACAATAGGGTGAATGATCCGGG-3'（反向）。在U373，U251和U373中检测到hsa_circ_0037251和miR-1229-3p的表达，
在转染后的指定时间点，与5.0 mg / mL 3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）22，5-二苯基四唑溴化物（MTT）孵育后，通过离心收集细胞。向沉淀物中加入二甲基亚砜（200μL），然后通过分光光度法在490 nm下测量吸光度。
将转染的细胞用碘化丙啶和DNA试剂盒（BD Biosciences，美国）进行染色，以进行循环测试，然后通过流式细胞仪（Mindray，中国）进行测量。计数并比较了G1，S和G2相中的细胞比例。为了鉴定细胞凋亡，还使用膜联蛋白V凋亡试剂盒（eBiosciences，USA）对细胞染色，并使用流式细胞仪进行分析。
为了检测mTOR，磷脂酶Cγ1（PLCG1）和SHC衔接子蛋白1（SHC1）的蛋白表达，使用裂解缓冲液提取总蛋白，在12％SDS-PAGE凝胶上分离并印迹在纤维素膜上。与单克隆抗体在4°C杂交过夜后，在室温下用二抗将膜免疫印迹1小时。最后，使用增强的化学发光（ECL试剂盒，Santa Cruz Biotechnology）进行可视化，并使用Quantity One系统（Bio-Rad，Hercules，CA，美国）进行分析。一抗包括抗mTOR（稀释度1：200，Santa Cruz Biotechnology），抗PLCG1（稀释度1：1000，ThermoFisher Scientific），抗SHC1（稀释度1：2000，Abnova）和抗GAPDH（稀释度1：1000） ，圣克鲁斯生物技术）。
RiboBio（中国广州）设计并合成了靶向hsa_circ_0037251（si-circ_0037251）剪接后连接的小干扰RNA（siRNA）。对于si-circRNA，有义链的功能序列为5'-AUGCACCAGCGACUUCGUGUAAU-3'，反义链序列为5'-ATTACGAAGTCGCTGGTGCAT-3'。基于制造商的方案，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）转染细胞。
胶质瘤细胞稳定转染后，将大约1×10 7个细胞注入BALB / C裸鼠（4-6周龄，18-22 g，每组六只雌性小鼠）。每周通过用卡尺监测宽度（W）和长度（L）来检测肿瘤的生长，并使用公式V =（W 2 ×L）/ 2 计算肿瘤体积（V）。定期测量肿瘤，注射后10周可按计划对小鼠实施安乐死。所有动物的实验方案均经郑州大学伦理委员会批准。所有方法均按照相关指南和规定进行。尽一切努力使所用动物的数量及其痛苦最小化。
在用10％正常山羊血清（MXB，中国福州）封闭30分钟并在4°C下与抗mTOR的兔多克隆抗体（1：150，SAB，Chicago，IL）一起孵育过夜后，将玻片（4μm厚）将一定数量的异种移植样品脱蜡，再水化，然后在0.3％H 2 O 2中孵育10分钟以抑制内源性过氧化物酶活性。将载玻片用PBS洗涤3次，然后在室温下与生物素化的兔抗兔IgG孵育1小时。对于每个样品，还计算了积分光密度（IOD /面积）（Image-Pro Plus 6.0，Media Cybernetics，Rockville，MD，美国），并用作mTOR表达水平。
实验数据表示为平均值±标准偏差（SD）。基于标准偏差获得误差线。学生的两尾不成对t检验用于确定体外实验的统计学意义。所有统计检验均为双面检验，P值<0.05被认为具有统计学意义。
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