摘要
猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染可引起肠道功能障碍，从而导致严重的腹泻甚至死亡，但这些病毒作用的作用方式仍不清楚。这项研究通过生化测试和微阵列分析确定了PEDV感染对肠道吸收和营养转运蛋白基因表达的影响。将16只7天大的健康仔猪喂食代乳品，随机分为两组。适应5天后，将小猪（n = 8 /组）以10 4.5 TCID 50口服无菌生理盐水或PEDV（来自云南省的毒株）。（每头猪的组织培养感染剂量为50％）。PEDV或盐水注射后第5天，所有猪均口服D-木糖（0.1 g / kg BW）。一小时后，收集颈静脉血样本和肠样本进行进一步分析。与对照组相比，PEDV感染增加了腹泻的发生率，血液二胺氧化酶活性和iFABP水平，同时降低了仔猪的生长和血浆D-木糖浓度。此外，PEDV感染改变了血浆和空肠氨基酸谱，并降低了水通道蛋白和氨基酸转运蛋白的表达（L型氨基酸转运蛋白1，钠非依赖性氨基酸转运蛋白，B（° ，+）型氨基酸转运蛋白，钠依赖性中性氨基酸转运蛋白1，钠依赖性谷氨酸/天冬氨酸转运蛋白3和肽转运蛋白（1），脂质转运和代谢相关基因（脂蛋白脂肪酶，载脂蛋白A1，载脂蛋白A4，载脂蛋白C2，溶质载体家族27成员2，溶质载体家族27成员4，脂肪酸合酶和长链酰基辅酶A合成酶（3）以及空肠中的葡萄糖转运基因（葡萄糖转运蛋白2和胰岛素受体）。但是，PEDV给药会增加空肠中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1，精氨琥珀酸合酶1，钠/葡萄糖共转运蛋白1和囊性纤维化跨膜电导调节剂的mRNA水平。这些综合结果表明，PEDV感染会引起肠道损伤，并抑制编码营养转运蛋白的基因的表达。
猪流行性腹泻（PED）病毒（PEDV），被称为PED的病原体，对全球养猪业产生灾难性影响，并给世界造成巨大的经济损失1。PEDV，这是一种有包膜的，单链的，正链RNA病毒1，2，可以主要分布通过在特定条件下的粪-口途径以及空气传播3。由于PED是在英国首先确定在20世纪70年代，它已经从欧洲迅速蔓延到美国，加拿大和墨西哥，然后在亚洲国家，如日本和韩国复发2，4，5。猪流行性腹泻病毒感染可发生在猪的青睐，但新生仔猪最易感和病毒敏感，特征的急性水样腹泻，呕吐，并伴有厌食，抑郁，脱水，甚至死亡6，7，8，9。2013年5月，在疫情的10、11、12年，美国的PEDV暴发造成了800万新生仔猪死亡。从2010年代后期开始，越来越多的养猪场遭受PED造成的巨大损失13。考虑到PED的严重性和缺乏有效的保护措施，应该对PED进行广泛而深入的研究以更好地了解其病理。
胃肠道是营养物质吸收和吸收的门户，在人体的免疫功能中也起着至关重要的作用。肠上皮的屏障完整性可以保护肠免受异物侵害，并允许营养物质穿过上皮14。断奶后的仔猪容易受到环境，生理甚至营养方面的压力。由于其消化系统和免疫系统的不完全发育，它们更容易受到病原细菌和病毒的侵害，导致肠道功能受损和严重腹泻。PEDV毒株具有高致病性，可以损害猪的肠道屏障完整性和隐窝干细胞增殖15，减少紧密连接蛋白的表达16，17，因此抑制了猪的生长性能。以前的研究确定猪流行性腹泻病毒的分子特征 18，19和主机病理反应病毒 20，21。但是，在保育猪中，PEDV诱导胃肠道特定功能（例如营养吸收）改变的机制尚不清楚。我们假设由PEDV感染引起的肠道功能障碍与营养物质运输受损有关。为了验证这一假设，本研究旨在调查受PEDV感染的猪小肠中营养转运蛋白的基因表达谱。我们的发现有望为PED的预防和治疗提供理论依据。
仔猪体重的数据示于表 1。与对照组相比，PEDV感染降低了仔猪的最终体重（P <0.05），但增加了 腹泻的发生率（P <0.001）。值得注意的是，对照组中没有仔猪出现腹泻，但PEDV组中约有50％的仔猪患有这种肠道疾病。
生化指标数据见表 2。与对照组相比，PEDV感染增加了血尿素氮（BUN），氯化物和肠道脂肪酸结合蛋白（iFABP）的浓度以及二胺氧化酶（DAO）的活性（P <0.05），但降低了（P < 0.05 0.05）仔猪血浆中高密度脂蛋白（HDL）和D-木糖的浓度。相反，与对照组相比，PEDV感染并不影响血浆中总胆固醇，葡萄糖和总钙的浓度。
PEDV感染改变了血浆中氨基酸的分布，如图1a所示 。与对照组相比，PEDV感染降低 了丙氨酸（44％），瓜氨酸（27％），胱氨酸（34％），甘氨酸（38％），羟脯氨酸（36％），赖氨酸（36）的浓度（P <0.05）。 ％），鸟氨酸（22％），脯氨酸（22％），丝氨酸（27％），牛磺酸（30％），苏氨酸（54％），β-丙氨酸（64％）和β-氨基异丁酸（57％） ，同时增加（P <0.05）谷氨酸（29％），组氨酸（40％），亮氨酸（23％），蛋氨酸（24％），苯丙氨酸（27％），酪氨酸（42％），α-氨基丁酸的浓度仔猪血浆中的氨基酸（30％），γ-氨基丁酸（32％），3-甲基组氨酸（39％）和尿素（752％）。
PEDV感染会改变仔猪血浆（a）和空肠黏膜（b）氨基酸的分布。数据为平均值±SD，n =8。* P <0.05，** P <0.01。
PEDV感染对仔猪空肠黏膜中游离氨基酸浓度的影响如图1b所示 。与对照组相比，PEDV感染会升高（P <0.05）天冬酰胺（38％），天冬氨酸（45％），苯丙氨酸（133％），酪氨酸（48％），色氨酸（62％）和尿素的浓度（P <0.05） （194％），同时降低（P <0.05）丙氨酸（35％），精氨酸（26％），胱氨酸（77％），谷氨酰胺（74％），甘氨酸（16％），脯氨酸（38％）的浓度，牛磺酸（22％），苏氨酸（30％），β-丙氨酸（18％）和β-氨基异丁酸（24％）。PEDV感染有趋势（0.1> P > 0.05）可降低瓜氨酸（14％），羟脯氨酸（22％），赖氨酸（18％）和组氨酸（17％）的浓度，但可提高谷氨酸（15％），蛋氨酸（20％）的浓度，空肠黏膜中有缬氨酸和缬氨酸（占18％）。
猪基因1.1 ST阵列（Affymetrix，美国加利福尼亚州圣克拉拉）用于鉴定对PEDV感染的基因表达变化。我们鉴定了120个带注释的转录本（具有完整的基因符号，描述，倍数变化和P值），这些倍数在倍数变化> 1.5和P <0.05 的临界标准下在对照组和PEDV组之间差异表达。在这些基因中，有28个基因被上调，而92个基因被下调（补充文件S2中的详细信息 ）。IPA（Ingenuity Pathway Analysis）显示，大量基因与营养物质转运和代谢调节剂有关，包括水和离子的转运以及其他营养素的吸收，代谢和转运。
IPA分析的结果表明，差异表达的基因根据功能和相关疾病进行分类（补充文件S3中的详细信息 ）。根据功能分类，将显着改变的基因分为四个独特的功能类别（请参见表 3）：( 1）分子转运，（2）氨基酸代谢和相关代谢产物，（3）传染病和（4）合成脂质（P <0.05，参见表 3）。
为了确定PEDV感染是否通过调节潜在的信号通路对肠道功能产生有害影响，使用IPA核心分析进一步分析了微阵列数据。差异表达基因（DEGs）被分类为相关的规范途径。在图2中示出了前20个信号通路 。通过分析差异表达基因的富集，我们发现PEDV感染可调控多种途径，如瓜氨酸和精氨酸的生物合成，干扰素信号传导，GDP-葡萄糖的生物合成，脂肪酸活化，脯氨酸的生物合成（精氨酸），尿素循环，葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸降解。在这些途径中，PEDV感染极大地影响了仔猪的脂质代谢和氨基酸生物合成。
通过IPA分析，PEDV感染的仔猪中的前20条信号通路。直方图越高，路径的重要性就越大。橙色折线表示差异表达的分子占路径中分子总数的比例。
根据对PEDV攻击仔猪空肠中差异表达基因的分析，利用IPA工具建立了基因网络，以将关键基因与丰富的疾病和功能类别联系起来。补充文件S4中提出了基因网络及其在PEDV感染的仔猪中的相关疾病和功能 。三个重要的网络（图 3得分> 20的关注对象对应于（1）消化系统的发育和功能，胃肠道疾病，皮肤病和状况；（2）心血管疾病，器官损伤和异常以及脂质代谢；（3）细胞的死亡和生存，脂质代谢和分子运输。值得注意的是，营养物质的运输以及脂质和氨基酸的代谢可能在PEDV引起的肠道功能障碍中起重要作用。另外，通过qRT-PCR进一步分析了涉及这些网络的几个基因。
拟议的在猪空肠中由PEDV调控的前3个基因网络（使用IPA工具构建）。
为了验证微阵列结果并确认PEDV感染对仔猪肠道营养运输和代谢相关基因表达的影响，通过qRT-PCR进一步确定了空肠和回肠黏膜中几个显着变化的基因（图 4） 。PEDV感染降低 了与水和离子迁移相关的基因的mRNA水平（P <0.05），包括水通道蛋白（AQP）3，AQP4，AQP8，AQP10，钾内向整流通道亚家族J成员13（KCNJ13），葡萄糖转运蛋白2 （GLUT2），瞬时受体电位阳离子通道亚家族v成员6（TRPV6），钠/氢交换剂（NHE）2和NHE3，同时增加（P <0.05）钠/葡萄糖共转运蛋白1（SGLT1）的mRNA水平。PEDV感染还下调（P <0.05）与脂质运输和代谢相关的基因的表达，包括脂肪酸结合蛋白（FABP）1，脂蛋白脂肪酶（LPL），载脂蛋白（APO）A1，APOA4，APOC2，溶质载体家族27成员4（SLC27A4），溶质载体家族27成员2（SLC27A2），脂肪酸合酶（FASN）和长链酰基辅酶A合成酶3（ACSL3），同时增加（P <0.05）FABP2 mRNA水平空肠。此外，PEDV感染降低（P <0.05）的mRNA水平对L型氨基酸转运体1（Y + LAT1），钠-依赖性谷氨酸/天冬氨酸转运3（SLC1A1），钠依赖性氨基酸转运（B 0，+AT），肽转运蛋白1（PepT1）和B（0，+）型氨基酸转运蛋白（rBAT），但 与系统B（0）中性氨基酸转运蛋白1（B 0 AT1 ）相比升高（P <0.05））和钠依赖性中性氨基酸转运蛋白2（ASCT2）。此外，PEDV感染增加 了磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1（PCK1），精氨琥珀酸合酶1（ASS1）和精氨酸酶1（ARG1）的mRNA水平（P <0.05），但 胰岛素受体（INSR）和膜金属内肽酶的mRNA水平降低了（P <0.05）。 （MME）在仔猪的空肠黏膜中。
对照组和PEDV感染组仔猪空肠和回肠中的基因表达。将对照组中的所有mRNA水平标准化为1.00。数据为平均值±SD，n =8。* P <0.05，** P <0.01。
同样，PEDV感染降低了 仔猪回肠AQP3，AQP8，AQP10，KCNJ13，GLUT2，TRPV6和NHE3的mRNA水平（P <0.05），但增加 了SGLT1和CFTR的mRNA水平（P <0.05）。回肠中与脂质运输和代谢相关的基因，包括FABP1，FABP2，APOA1，APOA4，APOC2和ACSL3的mRNA水平降低（P <0.05），而FABP6，LPL和FASN的mRNA水平升高（P <0.05）。与对照仔猪相比，感染PEDV的仔猪的数量。而且，PEDV可以降低编码氨基酸转运蛋白的基因的表达，例如y + LAT1，SLC1A1，b 0，+ AT，PepT1，ASCT1和rBAT。相反，PEDV感染上调（P <0.05）B 0 AT1在猪回肠中的表达。另外， 仔猪回肠中PEDV感染降低 了INSR，ARG1和MME的mRNA水平（P <0.05），但增加了PCK1和ASS1的mRNA水平（P <0.05）。
在本研究中，微阵列分析被用于阐明由PEDV感染引起的肠道功能障碍的机制。PEDV和对照组之间有120个差异表达的基因。这些基因分为三类：分子运输，氨基酸代谢和传染病。IPA分析表明，这些差异表达的基因主要参与以下途径：干扰素信号传导，水和离子转运，营养物质（葡萄糖，脂质和氨基酸）吸收，代谢和转运。因此，响应PEDV感染，肠道营养转运蛋白的表达及随后的吸收功能可能会发生巨大变化。据我们所知，
有对仔猪小肠转运的调控可用的信息非常少由猪流行性腹泻病毒感染22，23，24，25。Schweer 26发现，PEDV感染降低了空肠仔猪的GLUT2 mRNA水平，但增加了SLC6A14水平。另外，Wang 等。9报道了PDEV感染仔猪空肠中FABP2 mRNA水平的降低。尽管在本研究中尚未确定SLC6A14的表达，但我们的结果与这两项研究的结果一致。关于用PEDV感染的猪的眼科研究，Sun 等。22发现PEDV感染增强了7044个基因的表达，其中大多数与对传染病途径的免疫反应有关。值得注意的是，基于KEGG分析，有374个差异表达基因（DEGs）与营养物转运和分解代谢有关，这一结果与我们目前的研究结果非常吻合。同样，一项涉及Vero E6细胞RNA-seq分析的体外研究表明，DEGs主要与免疫反应和mTOR信号通路有关，在PEDV抗病毒调节中起着至关重要的作用23。同样，蛋白质组学分析结果表明，猪的PEDV感染改变了参与细胞功能和免疫反应的几种空肠蛋白的丰度24。
肠道完整性起到防止细菌鲁米和维持肠道屏障功能中起关键作用25，27。据报道，PEDV会迅速侵入猪肠上皮细胞6并引起小肠功能障碍，从而导致仔猪严重腹泻，生长迟缓甚至死亡11。本研究发现，猪流行性腹泻病毒引起的平均日增重下降，反而增加了腹泻发病率，这与以前的研究相一致9，14，28。此外，血浆中D-木糖和i-FABP的浓度降低，而DAO活性增加。因为等离子体d木糖，DAO，和i-FABP已被确认作为生物标志物用于评估肠屏障功能和完整性9，25，29，与升高的DAO沿下降d木糖和i-FABP血浆表明PEDV施用能诱导仔猪肠道损伤和肠功能受损。这个概念由血浆瓜氨酸浓度的降低，其作为肠吸收功能的一个指标证实6，9，30。
对照组和PEDV组之间有120个DGE，通过IPA分析将它们大多数分类为分子转运，氨基酸代谢，传染病，脂质代谢和病毒感染。根据使用IPA工具构建的规范途径和网络，我们非常重视PEDV感染对营养物运输和代谢相关基因的调控。
首先，PEDV感染可能会影响小肠中的水和离子运输。PEDV感染后，空肠和回肠粘膜中编码水通道的基因（如AQP3，AQP8和AQP10）的表达均降低。同时，PEDV还调节编码离子转运的基因的表达。具体而言，KCNJ13（其编码允许钾离子进入细胞31的钾通道家族蛋白）和TRPV6（其作为膜钙通道32）被下调；但是CFTR（氯化物通道33）在受PEDV感染的仔猪中被上调。张等。34报道CFTR表达升高通常与临床分泌性腹泻有关。近来，据报道PEDV感染还显着降低肠细胞中Na + -K + -ATPase和Ca 2+ -Mg 2+ -ATPase的活性，从而诱导异常的Na +，K +，Ca 2+和Mg 2。 +发行35。此外，PEDV感染下调了NHE3基因的表达，该基因在NaCl重吸收中起着重要的作用36。在炎症性肠病和霍乱毒素引起的腹泻中，NHE3的表达和活性通常被显着抑制37，38。有趣的是，氯化物在维持电解质平衡和血液渗透压中起着重要作用。因此，血浆中氯化物的升高可能归因于肠中氯化物运输的损害和受PEDV感染的仔猪的严重脱水。总体而言，PEDV可能会引起水分和离子失衡，从而导致仔猪严重腹泻和脱水。
其次，PEDV感染影响小肠中的葡萄糖转运和代谢。葡萄糖可以通过的SGLT1被运送到小肠细胞39，40。然后，细胞内葡萄糖通过GLUT2转运穿过肠细胞基底膜进入血液循环，以维持血糖水平的平衡41。关于病毒对葡萄糖转运蛋白表达的影响有广泛的研究。两个丙型肝炎病毒（HCV）和马雅罗病毒（MAYV）感染可下调GLUT1 / 2基因的表达，引起葡萄糖吸收的抑制42，43。然而，感染人巨细胞病毒（HCMV）和卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的可上调GLUT 1/3/4表达并增加病毒感染的细胞的运输葡萄糖的能力44，45。肠道葡萄糖转运蛋白表达的差异可能归因于病毒类型和实验动物的差异。在本研究中，PEDV在仔猪小肠中增加了SGLT1的表达，但降低了GLUT2的表达，表明PEDV诱导了肠道中葡萄糖转运的紊乱。乔治等。46据报道，活化的INSR可以刺激PI3-K信号通路，不仅可以促进GLUTs转运葡萄糖，还可以通过减少编码糖原异生性关键酶PEPCK-C 47的 PCK1来抑制糖原异生。类似地，PEDV感染后在小肠中观察到INSR基因的表达下调，但PCK1基因的表达上调。因此，我们推测PEDV可能通过调节猪的GLUT，SGLT1，INSR和PCK1表达来改变肠道葡萄糖的吸收和代谢。
第三，PEDV感染可能会影响肠道氨基酸的运输和代谢。氨基酸是优惠营养素肠道合成肠蛋白质，聚胺，一氧化氮，ATP，和其它产品具有巨大的生物功能48，49，50。在本研究中，血浆和空肠的氨基酸谱都被PEDV感染显着改变。具体而言，PEDV感染仔猪空肠黏膜中碱性氨基酸（组氨酸，赖氨酸和精氨酸）的浓度降低。精氨酸被认为是一氧化氮的合成和作为调节，以防止细胞死亡和促进蛋白质合成的前体的含氮51，52，53。它可以由ASS1 30催化血浆中瓜氨酸和肠粘膜线粒体中的鸟氨酸合成。精氨酸以两种方式代谢：一种是精氨酸被精氨酸酶1（ARG1）催化分解为鸟氨酸和尿素，另一种是精氨酸被NO合酶（NOS）54催化代谢为瓜氨酸和NO 。在本研究中，PEDV感染上调了空肠黏膜中的ASS1和ARG1基因表达，表明精氨酸代谢异常。此外，感染PEDV的仔猪中碱性氨基酸转运蛋白b 0，+ AT和y + LAT1的表达下调，这可以解释碱性氨基酸减少的原因。b 0，+AT1和RBAT位于上皮细胞的顶膜，并负责输送碱性氨基酸和胱氨酸成从肠腔细胞，而交换的中性氨基酸55，56。y + LAT1位于上皮细胞的基底外侧膜中，负责在交换中性氨基酸的同时将碱性氨基酸从肠细胞转运到血液中57。有趣的是，PEDV感染仔猪空肠中酸性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）的浓度增加，而酸性氨基酸转运蛋白SLC1A1却被下调。吴58报道说谷氨酸和天冬氨酸以及谷氨酰胺是肠细胞的主要能量底物。这些氨基酸在猪的生长性能，基因表达调控，细胞信号传导途径，紧密连接的完整性，激素分泌，抗氧化能力，和神经调节中发挥重要作用59，60，61，62，63。空肠中酸性氨基酸的含量较高可能是由于在病理条件下对这些氨基酸的需求较高。空肠黏膜和血浆中PEDV组的其他氨基酸（包括天冬酰胺，酪氨酸和苯丙氨酸）均增加，这可能与中性氨基酸转运蛋白（如B）的表达上调有关0 AT1和ASCT2 64。然而，PEDV感染后空肠黏膜和血浆中的甘氨酸和半胱氨酸（GSH合成的三种底物中的两种）以及脯氨酸，苏氨酸，羟脯氨酸，牛磺酸和丙氨酸均降低，表明蛋白质代谢和氨基酸吸收异常。PEPT1是二肽和三肽的转运，在肠的刷状缘定位65，66。Osmanyan 等。56报告指出，蛋白质消化的最终产物，即小肽和氨基酸，可能会影响PepT1的表达。在本研究中，PEDV组中PepT1表达的减少进一步证明了感染PEDV的仔猪中蛋白质和氨基酸的代谢异常。此外，血浆尿素浓度是机体氨基酸代谢的指标，可能与仔猪的生长性能负相关67。因此，PEDV感染可能会抑制蛋白质合成，同时刺激整个体内的蛋白质降解和氨基酸分解代谢。两者合计，PEDV感染可通过改变氨基酸转运蛋白的表达来促进人体蛋白质的降解并损害肠道氨基酸的吸收，转运和代谢。
此外，仔猪中的PEDV感染也可能调节脂质的运输和代谢。PEDV可能通过下调空肠和回肠黏膜中FABP1，FABP2和SLC27A4的表达来干扰脂肪酸的运输。FABP1和FABP2主要在小肠的近端和远端表达68。它们都在脂肪酸的摄取，运输和代谢中起重要作用。SLC27A4主要用作其输送穿过质膜的长链脂肪酸和似乎是在肠上皮细胞的主要脂肪酸转运蛋白的转运69，70。FABP1，FABP2和SLC27A4表达的减少可能会导致肠细胞脂肪酸吸收和转运受到抑制。然而，仔猪回肠中的PEDV感染增加了FABP6的表达。古桥等。68结果表明，FABP6可以结合胆汁酸（胆固醇的代谢产物），对于脂质和维生素的吸收和运输至关重要。因此，PEDV可以差异调节肠道脂质转运蛋白的表达。此外，PEDV可能通过下调小肠中SLC27A2，ACSL3和FASN的表达来减少脂肪酸的合成。SLC27A2和ACSL3是长链脂肪酸辅酶A连接酶家族的同功酶，可将游离的长链脂肪酸转化为脂肪酰基辅酶A酯，因此在脂质生物合成和脂肪酸降解中起着至关重要的作用71。FASN催化长链饱和脂肪酸的合成，长链饱和脂肪酸是动物（包括猪）中营养和生理上重要的单不饱和脂肪酸的前体67。
有趣的是，本研究结果表明，PEDV感染可调节脂蛋白的分泌，因为仔猪空肠和回肠中APOA1，APOA4和APOC2的表达下调。APOA1是血浆HDL的主要蛋白成分，并且因此，是用于从组织促进胆固醇流出到肝脏排泄重要72，73。APOA1基因的下调与HDL缺陷有关。APOC2是极低密度脂蛋白的成分。刘等。74据报道，APOC2可以激活LPL（内皮细胞外表面的一种酶，负责血浆甘油三酸酯的水解），从而在将甘油三酸酯转化为细胞的游离脂肪酸方面发挥重要作用。APOA4参与HDL的成熟并协助APOC2激活LPL，并且在胆固醇的逆向转运中起着至关重要的作用。因此，很明显，PEDV感染通过肠内APOA1和APOA4表达的降低而降低了血浆HDL的浓度（图 4）。同时，APOC2的下调可能与胆固醇代谢紊乱有关，从而导致胆固醇蓄积并损害肠上皮细胞。
IPA衍生的基因网络表明，PEDV感染可通过调节IFN-α，PI3K-Akt，NF-κB和MAPK-ERK信号通路来诱导免疫应激和肠道功能障碍。此外，这些途径的刺激可以诱导下游分子如Jnk，TCR / CD3复合物的活化，并最终影响仔猪小肠中的营养运输和代谢（主要是脂质）。
PEDV感染引起严重的腹泻和肠道功能障碍，如血浆DAO活性和i-FABP水平升高以及血浆D-木糖浓度降低所表明的。PEDV感染会降低AQP ，氨基酸转运蛋白（y + LAT1，SLC1A1，b 0，+ AT，rBAT和PepT1）的表达，改变血浆和空肠的氨基酸谱，影响空肠和空肠脂质和葡萄糖的吸收和代谢回肠粘膜。这些结果可以为研究人员提供更多的见解，以了解造成PEDV感染引起的肠道功能障碍的分子机制。
本研究的实验方案和动物用途已获得武汉工业大学动物护理和使用委员会的批准（2016-0323）。本研究中使用的所有仔猪均购自无PEDV的农场，足月出生（妊娠114天）。在本实验中使用了16头健康的杂种健康雌猪（Duroc×Landrace×Yorkshire，7天大，具有相同的性别），最初体重为2.86±0.30 kg。在温度控制的苗圃房（25–27°C）中的两个房间中，分别对猪进行圈养（2.0×3.0-m圈）。给所有仔猪饲喂具有足够营养的液态代乳品（武汉安友饲料有限公司，武汉，中国）。根据饮食/水的比例（1：4）配制液体饮食。即 将20克代乳粉（粉末）溶解在80毫升温水（50±5℃）中以制备液体饲料。每头猪每天饲喂四次（每头猪每天100克干物质）。采取这种喂养策略（每次喂养更频繁地提供少量食物）可防止肠道损伤并提高喂养效率。猪可以自由饮水。在整个实验中，每天观察并记录腹泻的发生率，每天3次。猪的粪便分为四个等级：0，正常； 0，正常。1，糊状；2，半液体；3，液体 在整个实验中，每天观察并记录腹泻的发生率，每天3次。猪的粪便分为四个等级：0，正常； 0，正常。1，糊状；2，半液体；3，液体 在整个实验中，每天观察并记录腹泻的发生率，每天3次。猪的粪便分为四个等级：0，正常； 0，正常。1，糊状；2，半液体；3，液体75，76。腹泻的发生被定义为连续2天将粪便维持在2级或3级水平。然后根据以下公式计算腹泻发生率：腹泻发生率=腹泻猪总数/（猪总数×实验天数）×100％。公式中的“腹泻猪总数”定义为每天观察到的腹泻猪总数。
经过5天的适应期后，将仔猪随机分为两组：对照组和PEDV（每组8头猪）。试验第0天的下午8：00，PEDV组的仔猪口服PEDV（来自云南省的品系；由华中农业大学兽医学院何博士提供），剂量为10 每头猪4.5 TCID50（50％组织培养物感染剂量），而对照组则给予相同体积的无菌盐水。根据我们先前的研究选择了PEDV的剂量（10 4.5 TCID50）9。为了排除PEDV引起的食物摄入减少对仔猪肠指数的可能影响，给对照组仔猪饲喂与PEDV组仔猪相同数量的流质饲料。在服用PEDV或生理盐水后的第5天，所有禁食的通宵仔猪均口服10％D-木糖（1 mL / kg BW），通过测量血液D-木糖浓度77来确定肠道吸收能力和粘膜完整性。一小时后，颈静脉血液样品收集，然后所有猪下钠戊巴比妥麻醉处死（50 mg / kg体重，静脉内），得到肠样品9，78，79，80，81。
如前所述，在试验第5天施用D-木糖后1小时，从仔猪的前腔静脉收集所有血液样品。血液样品在3,500rpm下进行15分钟再离心在4℃下，以获得上清液，即血浆9，78，然后将其储存在-20℃直至分析。
打开腹部，解剖暴露的小肠，然后将其置于冷冻的玻璃板上。10厘米的段均在空肠和回肠的中间切开9，78，82。肠段（10厘米长）。然后纵向打开和食糜冲入预冷PBS 9，78，83。在滤纸上吸干后，肠粘膜通过使用在4℃下无菌玻璃显微镜载片刮入1.5毫升无菌试管9，49，78，然后在液氮中快速冷冻并储存在-80℃直至进一步分析。杀死后15分钟内收集所有粘膜样品。
血浆生化参数的浓度分别为血尿素氮（BUN），总血清胆固醇，葡萄糖，高密度脂蛋白（HDL），低密度脂蛋白（LDL），肌酸激酶（CK），血钙和血氯使用日立7060自动生化分析仪（日本日立）使用商业试剂盒测定84。二胺氧化酶（DAO）的活性和D-木糖的浓度也通过使用可商购的试剂盒（南京建城生物工程研究所，南京，南京）进行了测量。另外，通过使用商业ELISA试剂盒（目录号HK 406，Hycult Biotech Inc.，Wayne，PA，USA）根据制造商的说明书测定血浆中的肠脂肪酸结合蛋白（i-FABP）。
使用自动氨基酸分析仪（S433D，Sykam GmbH，Eresing，德国）对血浆中的氨基酸谱进行了较小的修改。简短地，将0.45 mL血浆和0.45 mL水杨基磺酸（5％）充分混合，并在4°C下放置20分钟。然后，将混合物离心（10,000 rpm）15分钟，然后用0.5 mL锂盐样品稀释液稀释0.5 mL上清液。通过加入氢氧化锂溶液调节最终样品的pH值，然后充分混合。为了排除可能的固体物质，将混合物进一步通过0.22-μm膜过滤至1.5-mL样品瓶中，然后分析游离氨基酸。
为了确定空肠中游离氨基酸的浓度，使用研钵和研杵在液氮下将每种冷冻的粘膜样品（〜200 mg）粉化。将粉末状样品在1 mL水杨基磺酸（3％）中匀浆，然后将混合物离心（10,000 rpm）15分钟。之后，将0.45mL的上清液用0.45mL的锂盐样品稀释剂稀释，然后混合。在25°C下静置10分钟后，还将液体混合物通过0.22-μm膜过滤到1.5 mL样品瓶中，然后分析游离氨基酸。
使用研钵和研杵在液氮下将每个冷冻的粘膜样品（〜100 mg）粉化。匀浆后，按照TRIzol试剂的使用说明（Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）提取总粘膜RNA，并使用NanoDrop ND-2000 UV-VIS分光光度计（Thermo Fisher Scientific Inc.，威尔明顿，在260 nm的OD下 通过确定OD 260 / OD 280比来评估RNA的纯度。此外，进行1％变性的琼脂糖凝胶电泳以确定RNA完整性。当28S / 18S rRNA比率> 1.8 85时，RNA可用于RT-PCR分析和微阵列分析。仅那些具有OD 260 / OD 280的样品大约2.0的比率并没有降解（RNA完整性数> 7.0）被用来产生标记的靶86。使用Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies，Inc.，美国加利福尼亚州圣克拉拉）确定RNA完整性数。在我们的实验中，所有样品的OD 260 / OD 280之比均> 2.0。
按照Affymetrix WT PLUS标记检测方法，使用纯化的总RNA（100–500 ng）作为模板合成标记的片段单链cDNA（ss-cDNA）。猪基因1.1 ST阵列（Affymetrix，美国加利福尼亚州圣克拉拉）与生物素化的ss-cDNA靶标杂交。在48°C杂交20小时后，将阵列通过流控工作站进行清洗，然后通过GeneAtlas系统（Affymetrix，美国加利福尼亚州圣克拉拉）的成像工作站进行扫描。
扫描后，通过Affymetrix Command Console软件1.4版从图像数据（DAT文件）中提取猪基因1.1 ST阵列（Affymetrix）的强度数据（CEL文件），然后通过Affymetrix Transcriptome Analysis Console（ TAC）软件4.0，用于基因表达谱和DEG。所述DEGS通过在倍数变化> 1.5的截止选择P ≤0.05。
最后，基于网络的路径分析工具Ingenuity Pathway Analysis（IPA）5.5（Ingenuity Systems Inc.，Redwood City，CA，USA）是一种基于网络的路径分析工具，用于识别DEG的基因-基因相互作用网络，生物学功能和经典路径。将DEG数据集上载到IPA软件（http://www.ingenuity.com）中以进行“核心分析”，然后生成生物功能，网络和规范途径的结果。
实时定量PCR（qRT-PCR）用于验证与营养物转运相关的差异表达基因，并排除微阵列结果中的任何假阳性。根据网络分析的结果，选择了几个基因进行验证。如上所述制备总RNA，并按照制造商的说明使用带有gDNA橡皮擦的PrimeScript RT试剂盒（Takara，大连，中国）进行逆转录。合成了cDNA，并保存在-80°C直至使用。引物对用于qPCR扩增cDNA片段。引物设计为跨越内含子和内含子-外显子边界，以最大程度地减少潜在污染基因组DNA的扩增。所使用的引物对显示在补充文件 S1中。qPCR的是在Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统（福斯特市，CA，USA）使用SYBR预混料防爆TaqTM（宝，大连，中国）执行86。PCR反应系统的总体积为50 µL，其中包含0.2 µM的每种引物，25 µL的SYBR Premix Ex TaqTM（2x）和4 µL的cDNA。在以下条件下（两步扩增），在96孔实时PCR板（Applied Biosystems）上一式三份进行所有PCR：95°C持续30秒钟，然后在95°C的40个循环中持续5秒钟， 60°C持续31秒。此外，随后为每个PCR产物构建了具有连续荧光测量的解链曲线（95°C 15秒，60°C 1分钟和95°C 15秒），然后设置为25°C。通过分析PCR产物的解链曲线，评估了qRT-PCR反应的特异性87。根据直线的斜率计算放大效率：E = 10 （–1 /斜率） − 1，考虑理想值范围（0.95≤E≤1.05）88。为了确保通过qRT-PCR获得的结果的准确性和敏感性，同时使用甘油三磷酸三磷酸脱氢酶（GAPDH）和核糖体蛋白L4（RPL4）的平均循环阈值（Ct）对样品结果进行内部标准化基因88，89，90。使用2- ΔΔCt方法分析结果90。每个生物样品重复三次。
所有实验数据均以SD的平均值报告。使用SPSS 17.0软件（美国伊利诺伊州芝加哥市SPSS公司），通过独立的两样本t检验分析两组之间的差异。腹泻的发病率通过分析χ 2分析。遵循2- ΔΔCt法，将对照组中仔猪的空肠和回肠基因表达的平均值设为1.00。另外，Levene检验用于检验所有数据91的正态性和恒定方差。可能性值≤0.05被认为具有统计学意义92。
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