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胸腺肽的制备及检定

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发表时间:2019-07-12 15:58作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

胸腺肽的制备及检定


(一) 原理

胸腺肽是存在于人及多种动物胸腺内的一组具有免疫调节活性的热稳定性多肽。分子量多在8000~13 000之间,等电点在3.5~9.5之间。胸腺肽的主要功能为诱导T细胞分化增殖,放大并增强成熟T细胞对抗原或其它刺激物的反应及维持机体免疫平衡状态。由于它的分子量多是小于10 000的多肽,故基本无免疫原性,所以由一种动物胸腺中提取的小分子多肽,可用于其它各种动物及人类,而不会引起超敏反应。在实际工作中,主要从牛、猪、羊等动物的胸腺中提取胸腺肽。

(二) 材料和方法

1.材料主要包括高速组织捣碎机、低温冰柜、电热搅拌器、离心机、不锈钢滤膜滤器、超滤器、紫外分光光度计及检测E玫瑰花环试验所用仪器等。

2.方法

(1) 制备匀浆:将冻存的动物胸腺取出融化,摘除脂肪及结缔组织,洗净,用绞肉机绞碎,将绞碎的胸腺内加入适量注射用水(约为胸腺的2.5倍),用高速组织捣碎机高速匀浆2次,每次1min,将匀浆置-20℃冻结。

(2) 去除杂蛋白:冻结匀浆缓缓融化后,置电热搅拌器上加热至约80℃,并不断搅拌,共加热搅拌15min。以3000r/min离心20min,弃沉淀,取上清。

(3) 澄清及超滤:将上述上清液用1μm滤膜加压过滤,过滤后的液体其浊度不大于5度。将该澄清液体通过超滤器,用分子量10 000膜超滤,透过液即为胸腺肽溶液。

(4) 后处理:用Folin酚法测多肽含量,根据含量,分装安瓿并冻干,封口后待检定。

(三) 检定

1. pH值取本品用酸度计准确测定酸碱度,其pH值应为6~7.5。

2.热原取3只符合要求的家兔,按规定进行观察后,每只通过耳静脉注入7.5mg/kg胸腺肽药液,观察体温升高情况,如不符合规定,应取5只家兔复检。判定标准为:在初试3只家兔中,体温升高均在0.6℃以下,且3只家兔体温升高总数在1.4℃以下时;或在复试的5只家兔中,体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔不超过1只,并且初试和复试合并8只家兔的体温升高总数不超过3.5℃时,均认为供试品热原检查合格。

3.超敏反应取健康豚鼠6只,每只腹腔注射本品0.5ml,连续3次,于20天后即第4次自耳静脉注入本品2.0ml,应无超敏反应现象发生。

4.急性毒性试验取小鼠,自尾静脉注入本品0.45ml,同时腹腔注射2~3ml,48h内不应有死亡。

5.无菌检查将本品分别接种到用以检测需氧菌、厌氧菌及霉菌用培养基上,37℃培养1周,应无菌生长。

6.多肽含量测定用Folin酚法测定多肽含量,应符合规定。

7.活力测定采用E玫瑰花环试验,对照管中加入淋巴细胞及绵羊红细胞,试验管中加入淋巴细胞、绵羊红细胞及适量本品。试验管的E玫瑰花环率应较对照管高10%以上为合格。

(四) 注意事项

1.胸腺匀浆时应细,眼观应呈细腻状,否则可延长匀浆时间,增加匀浆次数。胸腺应采自幼龄动物,且新鲜无异味。

2.各步骤所用馏水应均为无热原注射用水。

3.过滤时,压力不可过高,否则滤膜破裂,药液则须重滤。


文章分类: 蛋白技术资料
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