摘要
H9N2是世界上家禽中最流行的低致病性禽流感病毒（LPAIV）。两种截然不同的H9N2家禽谱系通常与G1样（A /鹌鹑/ Hong Kong / G1 / 97）和Y280样（A / Duck / Hong Kong / Y280 / 1997）相似，并且对两个α2都具有结合亲和力3和α2,6唾液酸受体（禽和人受体），引起人们对这些病毒是否具有大流行潜力的关注。为了探索小鼠适应对Y280样病毒A / Chicken / Hubei / 214/2017（H9N2）（缩写为WT）的可传播性的影响，我们在小鼠中进行了WT病毒从肺向肺的连续传代。在小鼠中传代后，适应小鼠的变体（MA）表现出增强的致病性和有利的传播性。MA病毒完整基因组的序列分析揭示了总共16个氨基酸取代。这些突变分布在7个片段中，包括PB2，PB1，PA，NP，HA，NA和NS1基因。此外，我们使用反向遗传学技术生成了一组重组或突变H9N2病毒，并证实了PB2基因支配着增加的致病性和可传播性。PB2中的340 K和588 V的组合对于确定更改的功能很重要。我们的发现阐明了PB2中的特定突变会导致表型差异，并强调了监测已鉴定的氨基酸替代（由于其对人类健康的潜在威胁）的重要性。我们使用反向遗传技术生成了一组重组或突变H9N2病毒，并确认了PB2基因控制着更高的致病性和传播能力。PB2中的340 K和588 V的组合对于确定更改的功能很重要。我们的发现阐明了PB2中的特定突变会导致表型差异，并强调了监测已鉴定的氨基酸替代（由于其对人类健康的潜在威胁）的重要性。我们使用反向遗传技术生成了一组重组或突变H9N2病毒，并确认了PB2基因控制着更高的致病性和传播能力。PB2中的340 K和588 V的组合对于确定更改的功能很重要。我们的发现阐明了PB2中的特定突变会导致表型差异，并强调了监测已鉴定的氨基酸替代（由于其对人类健康的潜在威胁）的重要性。
H9N2禽流感病毒（AIV）首次从火鸡在美国的美国检测1966并传输到多种哺乳动物物种，包括猪，狗，黄鼠狼，貂，蝙蝠和人类的1，2，3，4，5，6。1998年，中国7报道了第一例人类感染H9N2的病例。血清流行病学研究表明，抗体对H9N2是人类的谁曾直接接触家禽，特别是在职业家禽工人高，这与H9N2感染即通常发生5，8，9。H9N2禽流感病毒也可以复制在没有事先适应哺乳动物，其正在进行的哺乳动物适应构成了显著的公共健康风险10，11，12。值得注意的是，H9N2 AIV被推定为几个普遍重配AIV的，如H5N1，H7N9和H5N6病毒的内部基因的供体13，14，15，16，17。空中传播有助于H9N2在世界范围内传播，并使H9N2在禽类之间有效传播，但尚未观察到人对人的H9N2传播。H9N2在哺乳动物中的空气传播能力仍然未知18。
已经使用了几种实验方法来探索AIV在哺乳动物中的传播性。通常，这些方法依赖于哺乳动物通过连续传代，AIV和人类流感病毒之间的重排，基因中的点突变或以上19的组合而适应。H7N1型禽流感病毒的高致病性菌株变成能够经过10次连续传代的哺乳动物空气传播的20。禽类H5N1病毒在从2009 / H1N1病毒中获得基因后，在豚鼠中通过空气传播传播21。HA和PB2基因对于AIV 22的跨物种传播很重要。通过定点诱变和随后在雪貂中的连续传代修饰的H5N1病毒可通过空气传播23。
AIV的对发射哺乳动物中的能力似乎需要多病毒特征，例如人类受体结合，增加的聚合酶活性和HA的高热稳定性20，21，23，24，25。人类受体结合特异性，特别是HA受体结合位点226上的亮氨酸（L），对于雪貂10中禽H9N2病毒的直接传播至关重要。病毒聚合酶活性的增加介导了禽流感病毒对哺乳动物宿主的适应性26。HA的高的热有助于经由在哺乳动物呼吸飞沫H5 AIV传输27。
AIV的的哺乳动物传输似乎获得人受体的结合偏好28，29，30。Y439（A /鸭/香港/ Y439 / 1997），G9（A /鸡/香港/ G9 / 1997），G1（A /鹌鹑/香港/ G1 / 97）和Y280（A /鸭/香港） / Y280 / 1997）是四种不同的H9N2家禽谱系。G1和Y280家禽谱系通常与禽类和人类受体结合亲和力有关，并且可能在哺乳动物之间传播8。小鼠已被广泛应用于研究哺乳动物对AIV的适应性。在哺乳动物AIV的连续传代可以导致适应性变化赋予增强的致病性和传递性在哺乳动物中31，32，33。虽然H9N2 AIV的致病性和传递性先前已经表征33，34，35，在哺乳动物中占H9N2空降传递分子的功能尚不清楚。在当前的研究中，小鼠适应后，一种Y280样H9N2病毒在豚鼠之间传播。为了探索哪些基因特异性突变会导致表型改变，我们使用反向遗传学技术生成了重组和突变病毒。
我们先前的工作36中描述了道德操守声明。简而言之，所有动物研究均严格按照世界动物卫生组织动物保护准则和湖北省动物保护和利用委员会批准的规程（批准号：SYXK 2016-0004）进行。
该研究中使用的野生型H9N2病毒于2017年从中国的鸡中分离出来，命名为A / chicken / Hubei / 214/2017（缩写为WT）。通过使用Quick Change XL定点诱变试剂盒（Stratagene，La Jolla，CA）在PB2中产生单个氨基酸取代。WT和MA是亲代病毒。我们以WT为骨架来产生重组重配病毒（WT-PB2 MA，WT-PB1 MA，WT-PA MA，WT-NP MA，WT-HA MA，WT-NA MA，WT-NS MA）和如先前所述37突变病毒（WT-PB2 340K和WT-PB2 588V）。重组重配病毒各自包含来自MA病毒的一个基因，而突变病毒各自是WT的PB2中的单个氨基酸取代。病毒在9天大的无特定病原体（SPF）的胚卵中繁殖，并储存在-80°C下。
小鼠适应的H9N2病毒源自WT病毒在小鼠中一系列连续的肺到肺传代，如先前所述32。简而言之，将三只五周大的雌性BALB / c小鼠组用乙醚麻醉，并鼻内接种50μLWT病毒的10 6 EID 50溶液。收获肺，并在3 dpi下在0.7 mL PBS中匀浆。随后将上清液用于接种三只幼稚小鼠。被感染的小鼠在第四代以3 dpi死亡。使用9天大的SPF胚卵从均质化的肺组织上清液中分离出小鼠适应病毒（MA），用于随后的致病性和传播性研究。
如我们先前的工作36中所述，获得了病毒基因序列。简而言之，使用TRIzol试剂（Invitrogen）从尿囊液中提取病毒RNA，并使用引物Uni12（5'-AGC RAA AGC AGG-3'）引物反转录成cDNA，使用RT试剂盒扩增RT试剂盒和病毒基因PCR试剂盒（日本Takara），按照制造商的规程。如Hoffmann 等人所述，使用特定的病毒引物通过PCR扩增病毒的8个片段的PCR产物。38。PCR产物由Sangon Biotech Company纯化和测序。鉴定了WT和MA病毒之间的氨基酸取代。用SeqMan程序（DNASTAR，麦迪逊，WI）分析所有序列数据。本研究中使用的所有参考序列均来自美国国家生物技术信息中心（NCBI）GenBank数据库。
WT和MA病毒的受体结合特异性通过1％鸡红细胞（cRBCs）的HA分析确定，如我们先前的工作36所述。对于HA分析，通过将细胞与50 mU 霍乱弧菌一起孵育，从cRBC中酶促去除唾液酸残基神经氨酸酶（VCNA，Roche，San Francisco，CA）在37°C下放置1小时，然后使用α2-，6-N-唾液酸转移酶或α2-，3-N-唾液酸转移酶（Sigma-Aldrich，St.Louis， MO）在37°C下放置4小时。然后将样品用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，每次1500 rpm离心5分钟，用PBS调节至最终工作浓度（1％），并保存在4°C。对于HA分析，将病毒用50μLPBS连续稀释2倍，并在96孔板上与50μL1％RBC悬浮液混合。在4°C下1 h后测定HA滴度。
如我们先前的工作39所述，进行了病毒生长曲线实验。Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞是从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获得的，并保存在补充了10％胎牛血清（FBS； Gibco，新西兰奥克兰）。WT和MA病毒的生长动力学通过以0.001 50％组织培养感染剂量（TCID 50）的复数感染（MOI）接种MDCK细胞来确定）每个单元格。接种后一小时（hpi），将细胞用PBS洗涤两次，并添加新鲜培养基，其中添加了1μg/ mL的甲苯磺酰基苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）和胰蛋白酶（Sigma，St。Louis，MO，美国）。在12、24、36和48 hpi采样上清液。通过计算MDCK细胞中的1g TCID 50 / mL 来测定病毒滴度。TCID 50值根据Reed和Muench的方法计算。
如我们先前的工作40所述，进行了小鼠实验。用乙醚麻醉五只六周大的雌性BALB / c小鼠组（Merial Vital实验动物技术公司，中国北京），并鼻内接种50μL10 6 EID 50测试病毒或PBS溶液。每天监测这些组中小鼠的体重减轻和死亡率，持续14天。体重减轻> 30％的小鼠被人道安乐死。
如我们先前的工作36所述进行豚鼠实验。在这些研究中，使用了重量在300至350克之间的Hartley雌性豚鼠（Merial Vital实验动物技术公司，北京，中国），证实对流感病毒具有血清阴性作用。在传播研究中，三只豚鼠组成的组用乙醚麻醉，鼻内接种300μL10 6.0 EID 50测试病毒的溶液，并置于隔离器中的笼子中。第二天，将三只幼稚天竺鼠分别配对并与被感染的豚鼠共笼以进行直接接触传播研究，另一只幼稚天竺鼠被置于与被感染的豚鼠相邻的线框笼中进行气雾传播研究。被感染和接触气溶胶的豚鼠的笼子之间的距离为5厘米。为了监测病毒的散发，以2、4、6和8 dpi从所有动物收集鼻洗液并滴定。
使用GraphPad Prism软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥），使用单向方差分析（ANOVA）确定统计上的显着差异。所有测定均一式三份进行，数据代表至少3个单独的实验。误差线表示标准偏差。
我们研究了MA病毒在小鼠中的致病性。接种MA病毒的小鼠在5 dpi时迅速失去了其原始重量的30％以上，并死于死亡（图 1），其MDL 50为10 4.5 EID 50 / mL。相比之下，接种WT的小鼠没有明显的体重减轻，并且具有非致命性感染（图 1A，B）。这些结果表明，H9N2病毒从肺到肺的一系列传代导致小鼠的毒力大大提高。
小鼠的致病性。每组五只小鼠经鼻内接种10 6.0 EID 50的PBS，WT或MA。（A）每天监测小鼠体重14天。这些值是相对于初始体重的整体体重减轻的平均分数，±标准差（SD）。（B）通过观察感染的小鼠来计算存活百分比。（C）以1，3、5、7 dpi（n = 3）从接种10 6.0 EID 50 WT或MA的小鼠中收集肺脏，在9天大的SPF胚卵中测定病毒滴度（EID 50/公克）。简而言之，称量肺组织的重量，并将每个组织的0.1克放入含100 U / ml青霉素的1 ml PBS中，制成10％重量/体积的肺匀浆（* P <0.05; ** P <0.01）。
此外，我们还测试了小鼠肺中WT和MA的病毒滴度。在感染MA的小鼠中，在1、3和5 dpi时的滴度分别为10 3.5 EID 50 /克，10 3.4 EID 50 /克和10 2.3 EID 50 /克，比WT高10倍（* 0.01 <P <0.05; ** P <0.01; n = 3）。在5和7 dpi时，在WT感染小鼠的肺中未检测到病毒脱落（图 1C）。这些结果表明，与WT相比，MA在感染小鼠的肺中显示出有利的生长特性。
总之，基于小鼠的研究结果，与野生型病毒相比，MA病毒显示出更高的毒力和有利的生长能力。
为了评估WT和MA病毒的复制能力，我们测试了MDCK细胞中WT和MA的生长曲线。WT和MA的病毒滴度在36 hpi分别达到10 6.7 TCID 50 / mL和10 5 TCID 50 / mL（图 2）。MA的病毒滴度比WT高10倍（** P <0.01，n = 3），表明MA比WT更有效地复制。
MDCK细胞中病毒生长动力学的表征。WT和MA病毒的生长动力学。以每细胞0.001 TCID 50的MOI用WT或MA病毒感染MDCK细胞，并用1 mg / mL TPCK处理。在指定的hpi，在MDCK细胞中测定上清液中的病毒滴度。报告的值是三个独立实验的平均值和标准偏差（** P <0.01）。
人受体结合特异性为AIV的跨物种传输的重要因素41，42。因此，我们测定的受体结合的如先前所描述的两种病毒的特异性36。简而言之，通过评估WT和MA凝集四种类型的cRBC的能力来确定受体结合亲和力。cRBC包含禽类和人受体，而VCNA处理的cRBC不包含受体（去唾液酸化cRBC），再唾液酸化的cRBC包含人（α2,6-cRBC）或禽类（α2,3-cRBC）受体。HA滴度代表3个独立的实验。结果表明WT和MA病毒与禽和人类受体都结合（图 3）。
WT和MA病毒在各种红细胞中的凝集活性。使用了四种类型的鸡红细胞（cRBC）：a，cRBC。b，α-2，3 cRBCs（用VCNA处理并用α-2，3聚糖再唾液酸化）。c，α-2，6 cRBC（用VCNA处理并用α-2，6聚糖再唾液酸化）。d，去唾液酸化的（Desial）cRBC（用VCNA处理）。HA滴度显示了四种cRBC中WT和MA的凝集活性。报告的值表示为三个独立实验的平均值和标准偏差。
探索小鼠适应对MA病毒的传递率的影响，我们测量下WT和MA的传递率豚鼠如我们先前报道按照相同的程序36，43。仅在感染组中检测到WT病毒，而在接触组或气雾剂接触组中未检测到病毒，这表明没有病毒传播发生（图 4A）。MA病毒传播给2只直接接触的豚鼠和1只气溶胶接触的豚鼠（图 4B）。这些发现表明，在小鼠适应后，MA病毒已经在豚鼠模型中获得了传播性。
病毒在豚鼠中的水平传播。用10 6.0 EID 50的测试病毒接种三支对流感病毒呈阴性的豚鼠。第二天，将三只接种的豚鼠与直接接触的豚鼠一起饲养。另外，将气雾接触的豚鼠饲养在与感染的豚鼠相邻的线框笼中。被感染和接触气溶胶的豚鼠笼之间的距离为5厘米。从初次感染后的第2天开始，每隔一天从所有动物收集洗鼻液用于病毒脱落检测。每个色条代表单个动物中的病毒滴度。虚线表示病毒检测的下限。
通过对WT和MA病毒的完整基因组进行测序，研究了提高毒力和传播能力的分子基础。如表1所示，鉴定出16个氨基酸取代 ，这些突变分布在流感基因组的7个片段中。这些包括PB1蛋白的3个变化，PA蛋白的4个变化，PB2，NP，HA和NS1蛋白每个2个变化以及NA蛋白的单个变化。
为了确认哪些基因特异性突变导致了MA病毒的致病性和传播性的提高，我们使用WT病毒作为骨架来生成一组重组病毒，每个重组病毒均包含来自MA病毒的一个基因。在小鼠中研究了重组病毒的致病性。含有来自MA的PB2基因的重组病毒（WT-PB2 MA）显示出增加的毒力，并且感染的小鼠的体重减轻和死亡率与MA感染的小鼠相当。而其他重组病毒WT-PB1 MA，WT-PA MA，WT-NP MA，WT-HA MA，WT-NA MA，WT-NS MA不会造成实质性体重减轻和非致命性感染（图 5）。此外，我们还评估了重组病毒的传播能力。WT-PB2 MA传播给2只直接接触的豚鼠和1只气溶胶接触的豚鼠（图 6A），但是其他重组病毒既不传播给直接接触基团也不传播给气溶胶接触基团（数据未显示）。
所拯救病毒的致病性。每组五只小鼠经鼻内接种10 6.0 EID 50的拯救病毒。（A）每天监测小鼠体重14天。这些值是相对于初始体重的整体体重减轻的平均分数，±标准差（SD）。（B）通过观察感染的小鼠来计算存活百分比。
在豚鼠中传播时评估PB2中的氨基酸取代。（A – C）WT-PB2 MA，WT-PB2 340K的可传输性。和WT-PB2 588V。从初次感染后的第2天开始，每隔一天从所有动物收集洗鼻液用于病毒脱落检测。每个色条代表单个动物中的病毒滴度。虚线表示病毒检测的下限。
在MA病毒的PB2基因中鉴定出两个氨基酸取代，分别为340 K和588V。因此，我们生成的变体病毒在WT骨干中的PB2（WT-PB2 340K和WT-PB2 588V）中包含单个氨基酸取代。除WT-PB2 MA病毒外，这两个变异体还显示出比重组病毒更高的致病性（图 5）。在豚鼠研究中，WT-PB2 340K和WT-PB2 588V均传播给直接接触的豚鼠，但在气溶胶接触的豚鼠中未检测到病毒（图 6B，C）。这些结果表明，PB2中340K和588V的结合有助于MA病毒的气溶胶传播。
H9N2禽流感对公众健康构成潜在威胁。在这项研究中，Y280样H9N2病毒在小鼠体内连续传代后显示出更高的致病性和传播能力。我们发现PB2-340K与PB2-588V的组合有助于功能的改变。
甲型流感病毒可以感染多种动物。AIV的受体结合特异性在种间传播认为是重要的因素22，24。甲型流感病毒的HA基因包含受体结合位点，并确定受体结合特异性。AIV的在HA 226-LEU（L）和228 -甘氨酸（G）（H3编号）分离物已被报道喜欢禽流感病毒和人类受体41，44，45。HA中158位残基的糖基化损失也被证明是H5N1 AIV与人类受体46结合的原因。在这项研究中，WT和MA病毒与体内的受体结合特异性没有差异WT-HA MA病毒的结果与WT 并无差异，表明HA不参与表型的改变。
H5N1，H7N9，H9N2和H5N6 AIV的已报告偶尔突破物种屏障感染人类，但他们一直没能在人与人之间传播23，46，47，48。主要原因是它们在人类之间的空中传播能力有限。以前的研究发现，雪貂和豚鼠适应启用AIV的哺乳动物发送20，33。在我们之前的研究中，小鼠的适应不能使H5N6在豚鼠模型中传播32，但在这项研究中，它实现了H9N2的空中传播。我们认为，小鼠适应后其空中传播的原因可能与其禽和人类受体的结合亲和力有关。
先前的一些研究已经研究了H9N2对鸡或哺乳动物的适应性。将HA-363K和PA-672L启用鸡中H9N2空气传播49，50。H9N2在猪中的传代增加了它的复制和传播能力51。PB1-577E增加了小鼠H9N2的致病性52。HA1-227P，HA2-46E和NP-434K在豚鼠中实现了H9N2接触传播33。HA和PB2-627K中166位糖基化的丧失也显示会增加小鼠53中H9N2的毒力。先前的研究发现，H9N2的PB2基因在哺乳动物中起重要作用54，他们已确定PB2-404L，PB2-235N PB2-147L和PB2-627K增强H9N2的致病性在小鼠中34，55，56。该PB2-E627K置换，不断发现调解哺乳动物适应和AIV的致病性和宿主特异性的已知决定26，57，58。但是，在这项研究中未观察到以前鉴定的H9N2中的氨基酸变化。的PB2-R340K，PB2-A588V，PA-K356R，PA-S343A，NP-V239M和NS1-T216P在本研究中鉴定已经在AIV的其他亚型的毒力增加了先前牵连59，60，61，62，63。PA-R356K被认为是H7N9病毒与鸟类对人传递一个独特的签名，还发现，以增强在哺乳动物病毒聚合酶的活性，复制和致病性60，61。发现PA-S343A突变增加了低致病性H5N1流感病毒的聚合酶活性和毒力62。NP-V239M和NS1-T216P突变定义为从中国深圳63确诊的人类病例中分离出的H7N9病毒的标志氨基酸。先前发现PB2-R340K和PB2-A588V会增加H10N8和H7N9的病毒聚合酶活性，复制和致病性59。在本研究中，我们还发现，结合使用PB2-R340K和PB2-A588V可以在豚鼠之间实现H9N2空中传播。这些发现进一步凸显了需要进行持续的监视工作以检测在PB2中已鉴定出氨基酸取代的H9N2分离株的出现。
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