摘要
脂肪组织细胞外基质（ECM）调节脂肪细胞的细胞代谢，并在肥胖症和2型糖尿病中发生改变，但对ECM-脂肪细胞代谢串扰的潜在机制尚不清楚。糖尿病患者晚期糖基化终产物（AGE）的形成增加。AGE通过直接作用于ECM并结合多种细胞类型上的清道夫受体并通过Rho GTPases进行信号传导来改变组织功能。我们的目标是确定AGE在调节人ECM-脂肪细胞代谢串扰中的作用和潜在机制。在2D和3D-ECM培养系统中研究了患有肥胖症的糖尿病人和非糖尿病人的内脏脂肪细胞。与非糖尿病患者相比，糖尿病患者的脂肪组织中AGE升高。DIAPH1基因，编码人的Diaphanous 1蛋白（hDia1）。值得注意的是，抑制hDia1而不抑制清道夫受体RAGE或CD36减弱了AGE-ECM对脂肪细胞葡萄糖摄取的抑制作用。这些数据表明，ECM的AGE修饰有助于人类糖尿病中的脂肪细胞胰岛素抵抗，并暗示hDia1是AGE-ECM-脂肪细胞代谢串扰的潜在介体。
脂肪组织代谢功能障碍underlies肥胖相关的代谢性疾病的发病机制，包括2型糖尿病（DM），和改变在脂肪组织的细胞外基质（ECM）有牵连1，2，3，4，5。使用新型的人类ECM-脂肪细胞共培养系统，我们最近证明了脂肪组织ECM以疾病特异性的方式调节脂肪细胞的细胞代谢，并通过非糖尿病（NDM）ECM 6拯救了DM脂肪细胞的细胞胰岛素抵抗。尽管如此，对ECM-脂肪细胞串扰的基本机制以及导致DM中脂肪细胞代谢功能障碍的事件级联的定义仍然不明确。
晚期糖基化终产物（AGE）是非酶糖基化以及蛋白质和脂质氧化的产物7，是对与DM相关的高血糖症作出反应的细胞功能障碍的推定贡献者。AGE破坏蛋白质的三级结构并改变广泛的蛋白质功能和结构相互作用。AGE也作为配体由许多细胞类型中表达清道夫受体，包括受体晚期糖化终产物（RAGE）和CD36，引发多种信号途径对细胞功能不同的影响8，9。AGE在在DM多种组织增加，并有助于终末器官疾病7，10，11，12，13，14，但它们在脂肪组织中的作用尚未得到很好的描述。AGE降低人间充质细胞15中的脂肪形成分化，并损害在高葡萄糖介质16中培养的3T3-L1脂肪细胞的胰岛素敏感性，表明它们参与了脂肪组织胰岛素抵抗。AGE代表了潜在的ECM-脂肪细胞相互作用的潜在机制，可能是通过Rho GTPases的信号传导，这是AGE 17激活的下游信号传导途径。Rho GTP酶调节肌肉和脂肪组织的胰岛素刺激的葡萄糖摄取18，和AGE激活Rho信号在内皮细胞和小胶质细胞19，20，21，22，23，但未发表有关脂肪组织功能障碍的数据链接AGE和Rho信号。
本研究评估了年龄调节人脂肪组织中ECM-脂肪细胞代谢串扰的机制。我们假设AGE修饰的ECM通过AGE受体和Rho信号传导损害脂肪细胞的葡萄糖代谢。通过重组胶原蛋白和ECM的高葡萄糖培养来完成对脂肪细胞微环境的操作。针对AGE-受体的拮抗剂抗体和Rho信号介导的小分子抑制剂被用来识别AGE介导的ECM-脂肪细胞串扰的信号通路。使用3D人类ECM-脂肪细胞共培养系统体外模拟脂肪组织环境。该系统相对于其他使用水凝胶或胶原蛋白的3D培养方法具有优势，因为它源自天然脂肪组织，因此为脂肪细胞培养提供了更多的生理环境。
要确定是否AGE在人类肥胖和DM脂肪组织增加，我们在皮下（SAT）和内脏（VAT）测定AGE水平从肥胖DM和使用荧光显微镜NDM患者的脂肪组织24，25。与NDM组织相比，DM中的AGE水平更高，而SAT和VAT之间的年龄相似（图 1A，B）。线性混合模型的分析表明，VAT和SAT AGE水平与糖化血红蛋白的百分比（HbA1c；图 1C，D）直接相关。肥胖的DM和NDM受试者之间血浆AGE水平没有差异（P = 0.818）。
糖尿病人脂肪组织中的AGE升高。（a）代表性的荧光显微镜图像和（b）量化的人DM和NDM VAT和SAT中AGE表达的平均相对荧光强度单位（RFU）。 在多重比较分析中，带有不同字母的条表示P <0.050。（c，d）整个队列的VAT或SAT AGE荧光强度与血清HbA1c百分比的关联。所示线性模型的b值（b），标准误差（SE）和P值未经调整，并已针对年龄和性别进行了调整。增值税：n = 21 NDM，19个DM科目；SAT：n = 13名NDM，12名DM科目。
接下来，我们探讨了糖基化胶原蛋白1（GC1）作为AGE替代物对2D培养中脂肪细胞葡萄糖代谢和基因表达的影响。鉴于其与代谢疾病的关联性更强，对于这些以及所有后续实验，我们研究了增值税中的脂肪细胞。相对于UCI，GC1对基础葡萄糖摄取没有影响，但在DM而非NDM脂肪细胞中降低了胰岛素刺激的葡萄糖摄取（图 2A）。这些结果表明糖化胶原蛋白1干扰脂肪细胞胰岛素信号传导和胰岛素刺激的葡萄糖摄取，后者的作用仅限于DM脂肪细胞。
糖化胶原蛋白1调节脂肪细胞胰岛素信号传导以及Rho和AGE清除剂受体的表达。来自人类增值税的前脂肪细胞在2D培养+/-未糖化或糖化的重组人类胶原蛋白1（UC1，GC1）中分化为成熟的脂肪细胞，然后通过葡萄糖摄取测定或RT-qPCR研究。（a）在非刺激（基础）或胰岛素刺激条件下的葡萄糖摄取。纵坐标：通过归一化至细胞裂解物蛋白浓度（mg / ml）的细胞裂解物中的3 H-2D- 葡萄糖测量的平均葡萄糖摄取；不同字母的条表示P <0.050；n = 15名NDM，15名DM受试者。（b）用RT-qPCR研究基因表达。纵坐标：GC1组相对于UC1组参照物的转录水平的平均倍数差= 1；* P <0.050，比较GC1组和UC1组的转录水平；n = 12名NDM，12名DM受试者。
使用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR），我们接下来评估了GC1对AGER（高级糖基化终产物特异性受体，RAGE的基因名称），CD36和Rho信号传导介质CDC42（细胞）的基因表达的影响。肥胖DM和NDM受试者的VAT脂肪细胞中有DIAPH1（第42分区），DIAPH1（rho依赖的透明相关形式1，hDia1的基因名称），RAC1（Rac家族小GTPase 1）和RHO A（Ras同源家族成员A）。在NDM患者中，GC1降低CD36，CDC42和RHOA的表达在NDM中，与UC1脂肪细胞相比，GC1降低了CDC42和RAC1的表达，并增加了DIAPH1的表达（图 2B）。在一起，这些数据表明糖化胶原蛋白1差异性调节肥胖的DM和NDM受试者的脂肪细胞中AGE受体和Rho信号传导介质的表达，并以DM特异性方式诱导DIAPH1表达。
接下来，我们在实验室6先前描述的3D-ECM-脂肪细胞培养系统中研究了AGE修饰的ECM对脂肪细胞代谢的影响，该方法是通过在ECM分离之前用高浓度的葡萄糖处理脂肪组织来将AGE修饰为ECM（图。 3A）。我们首先通过在分离ECM之前，用含有17 mM，50 mM或100 mM葡萄糖或100 mM甘露醇的培养基（阴性对照）处理脂肪组织72小时，使用高葡萄糖培养来优化ECM的AGE诱导。我们还研究了在72小时葡萄糖调节的最后24小时内从用去糖基化酶PNGase处理过的组织中分离出的ECM。荧光显微镜分析表明，100 mM葡萄糖处理可在ECM上诱发AGE，其水平接近于天然DM VAT中观察到的水平（图 3B，与图 1B相比）），而PNGase显着降低AGE水平（b = -0.45±0.12； p <0.001）。PNGase和糖基化作用之间存在显着的相互作用，因此与低葡萄糖条件下观察到的降低相比，高葡萄糖条件下脂肪细胞在添加PNGase时的AGE降低明显更高（b = -1.14±0.20 ; p <0.001）。根据这些结果，对于所有后续实验，我们使用高葡萄糖（100 mM）处理来指定AGE修饰的ECM和低葡萄糖（17 mM），甘露醇（100 mM）和高葡萄糖，然后以PNGase处理作为对照。
AGE修饰的脂肪组织ECM调节脂肪细胞的细胞代谢。（a）建立ECM-脂肪细胞培养物的策略，包括宏观照片和扫描电子显微照片。（b）用指示的葡萄糖或甘露醇浓度处理72小时，在有或无PNGase处理的最后24小时中处理的增值税的定量平均荧光。不同字母的条表示P <0.050。（c）DM和NDM肥胖受试者的内脏脂肪组织中基础脂肪和胰岛素刺激的葡萄糖摄取，并从疾病匹配的（DM或NDM）ECM中分化为成熟的脂肪细胞，该ECM由用17 mM（低）或100 mM（高）葡萄糖或100 mM甘露醇，+ /-PNGase。纵坐标：通过3测得的平均葡萄糖摄取将细胞裂解物中的H-2D葡萄糖（cpm）标准化为细胞裂解物蛋白浓度（mg / ml）。不同字母的条表示P <0.050；n = 29名NDM，25名DM受试者。
接下来，我们评估了AGE修饰的3D-ECM-脂肪细胞培养物中的葡萄糖摄取。从处理过的增值税中分离出的ECM接种有VAT前脂肪细胞，将NDM ECM与NDM前脂肪细胞结合，或DM ECM与DM前脂肪细胞结合，从而重现患病（DM）和未患病（NDM）组织。与NDM培养相比，用低或高葡萄糖处理的DM ECM脂肪培养物显示降低的基础和胰岛素刺激的葡萄糖摄取，证实了我们实验室使用该3D ECM脂肪细胞系统先前观察到的DM特异性葡萄糖摄取缺陷6。相比之下，从用100 mM甘露醇处理过的组织制备的ECM在NDM或DM ECM脂肪细胞培养物中对葡萄糖摄取没有影响。在NDM和DM ECM脂肪细胞培养物中，相对于低葡萄糖条件的ECM，高葡萄糖AGE修饰的ECM显着降低了胰岛素刺激的葡萄糖摄取，但即使控制了糖尿病的状况，年龄和性别，也未影响基础葡萄糖的摄取。最后，在控制了年龄和性别之后，高葡萄糖处理的ECM的PNGase处理取消了其对NDM和DM ECM脂肪细胞培养物中胰岛素刺激的葡萄糖摄取的抑制作用（图 3C）。这些数据共同证明，AGE修饰的ECM减弱了脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取，而这种作用在DM ECM脂肪细胞培养中更为明显。
接下来，我们通过评估经针对RAGE或CD36的抗体或小分子formin同源性2结构域抑制剂治疗的糖尿病状态匹配的ECM-脂肪细胞培养物中的葡萄糖摄取，来确定hDia1，RAGE和CD36在调节ECM-脂肪细胞串扰中的作用。 SMIFH2），可抑制hDia1功能（参考文献）。如通过增加葡萄糖摄取所观察到的，SMIFH2减弱了NDM和DM ECM脂肪细胞培养物中AGE-ECM介导的胰岛素敏感性损害（图 4A））。在DM中的基础葡萄糖摄取中也观察到了这些作用，而在NDM ECM-脂肪细胞培养物中则没有观察到。与低葡萄糖ECM脂肪细胞培养相比，在高葡萄糖中SMIFH2对葡萄糖摄取的改善程度有所增加，而在DM中，与NDM培养相比，在SMIGH2中对葡萄糖的吸收程度有所提高。相反，相对于用同型对照抗体处理，RAGE中和抗体在低或高葡萄糖处理的NDM和DM ECM脂肪细胞培养物中对葡萄糖摄取没有影响（图 4B）。同样，相对于同型对照抗体，CD36中和抗体在低葡萄糖处理的NDM和DM ECM脂肪细胞培养物中对葡萄糖摄取没有影响（补充图 1）。）。这些观察结果暗示，AGE修饰的ECM对脂肪细胞葡萄糖摄取的调节部分地由hDia1介导，这种作用在与DM相关的AGE水平升高且不依赖于RAGE或CD36的情况下更为明显。
hDia1调节3D-ECM培养物中AGE介导的ECM-脂肪细胞代谢串扰。在体外，将前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞+/-（a）hDia1小分子抑制剂SMIFH2或（b）AGE受体（RAGE）拮抗剂或同种型对照抗体，这些抗体是由经治疗的内脏脂肪组织制备的疾病匹配的（NDM或DM）ECM低（17 mM）或高（100 mM）葡萄糖，然后在不使用（基础）或胰岛素刺激的情况下使用葡萄糖摄取测定法进行研究。纵坐标：相对于细胞裂解物蛋白浓度（mg / ml）标准化的平均3 H-2D-葡萄糖摄取（cpm）。不同字母的条表示P <0.050；n = 22个NDM，16个DM科目。（c）AGE调节脂肪细胞葡萄糖摄取的简化模型。
在DM的背景下，AGE在调节脂肪组织功能障碍中的作用仍然知之甚少。年龄在肾，肌肉，皮肤增加，肝在肥胖DM人类10，11，12，而在脂肪组织中肥胖的啮齿类动物13，但在人体脂肪组织AGE的研究是稀疏。一份报告显示，与瘦人相比，肥胖者的SAT中AGE水平升高了26，尚无关于人类VAT中AGE水平的公开报道。我们证明了VAT和SAT中AGE水平升高是人类肥胖相关DM的特征。相反，我们观察到血浆AGE水平与肥胖或DM之间无相关性。先前的一些研究表明，肥胖患者的血浆AGE水平降低10，26，27，而另一些显示相对 28。不同的患者人群和检测方法可能会解释这些冲突的数据。值得注意的是，AGE血浆水平的降低与脂肪组织AGE水平的升高相关[ 26]，这表明组织可以充当“ AGE-sink”，从而降低血浆水平。我们的数据与这些数据一致，因为它们支持血浆AGE水平不能准确反映人类代谢疾病中的组织水平。
我们表明，在2D培养，GC1衰减脂肪细胞的葡萄糖摄取在DM脂肪细胞，目的是证明糖化白蛋白或高葡萄糖在3T3L1类似的效果脂肪细胞之前的研究一致16，29，30，31。我们观察到了取决于DM状态的GC1对脂肪细胞葡萄糖代谢的不同作用，提示AGE修饰的胶原对细胞代谢的疾病特异性作用。GC1对DM而非NDM脂肪细胞的有害影响表明，与代谢疾病相关的内在细胞缺陷使脂肪细胞容易受到糖基化胶原蛋白的代谢损害。
为了更好地模拟天然脂肪组织的复杂性，我们使用了3D-ECM-脂肪细胞培养系统，该系统允许对ECM进行单独操作。使用该系统，我们观察到AGE修饰ECM的抑制作用对脂肪细胞的葡萄糖摄取，将其用PNG酶处理逆转，这表明糖化ECM有助于与DM相关的脂肪细胞的细胞的胰岛素抵抗的行之有效的状态32，33，34。此外，AGE修饰的ECM对葡萄糖摄取的影响比2D培养中的GC1更深刻，这表明AGE对脂肪细胞代谢的最大作用还需要除胶原蛋白1以外的ECM蛋白糖基化，并且可能涉及多个多种ECM蛋白上的AGE部分。值得注意的是，与NDM ECM-脂肪细胞培养物相比，DM中AGE修饰的ECM对脂肪细胞葡萄糖代谢的影响更大，此外，PAGEase对AGE修饰的ECM的PNGase处理使脂肪细胞葡萄糖摄取的水平高于未AGE修饰的ECM，而在非AGE修饰的ECM中则更高。在NDM和DM文化中都用PNGase处理过。这些观察结果表明一定程度的体内已有糖基化肥胖DM和NDM ECM上都存在的环境已经损害了脂肪细胞的代谢，进一步体外诱导ECM的AGE对脂肪细胞葡萄糖的摄取具有额外的不利影响，最后，完全除去ECM糖基化的体外作用将脂肪细胞葡萄糖的摄取提高到了该水平以上。在未经处理的ECM中观察到。
AGE通过在多种细胞上结合清道夫受体并触发下游信号通路来部分介导其作用。这些清道夫受体中占主导地位的是RAGE，激活其中在多个模型诱导细胞和全身胰岛素抵抗35，36，37。心外膜脂肪组织中的RAGE表达与心外膜脂肪厚度直接相关，与GLUT4表达间接相关38，而SAT中的RAGE表达与冠心病间接相关39。AGE还通过清除剂受体CD36发出信号。CD36在代谢疾病中的作用是有争议的，具有一定的数据表明有益的细胞和全身代谢的影响，而其他数据表明相反的40，41，42。我们观察到GC1对AGER没有明显影响表达，在NDM脂肪细胞中响应GC1降低CD36转录水平，最后，在AGE修饰的ECM中培养的脂肪细胞中，抑制RAGE或CD36的抗体对葡萄糖摄取没有影响。这些观察结果表明AGE-ECM对脂肪细胞胰岛素抵抗具有独立于RAGE和CD36的作用。GC1在NDM脂肪细胞中观察到CD36的下调，表明该受体可能介导对AGE的细胞应答，而胰岛素抵抗除外。进一步的研究将有必要探索这个假设。
关于Rho GTPases在调节细胞和全身代谢中的作用的数据相互矛盾。Rho信号家族由许多介体组成，这些介体具有复杂的组织和背景特定功能，不包括广泛的概括。GLUT4的细胞骨架动员Rac1的，例如，potentiates骨骼肌葡萄糖摄取通过调节转运43，但没有出现在脂肪细胞中发挥类似的作用，44，45。相反，RhoA和ROCK促进了心肌细胞46和胰腺β细胞47中的胰岛素抵抗。其他数据表明，Rho信号在脂肪和鼠其它组织中和人类肥胖上调48，49，50，51，和抑制的Rho改善全身代谢 52，53，54。总之，这些观察结果表明Rho信号传导对细胞和全身代谢的正面和负面影响。哺乳动物透照相关的formin蛋白家族是Rho GTPase效应子，可介导肌动蛋白聚合和微管稳定。人随机发货1（hDia1）及其同系物小鼠mDia1，是研究的直径家族的最好的，并且经由在非脂肪细胞的细胞类型AGE / RAGE介导的信号的细胞迁移 55，56。很少有数据描述hDia1在脂肪细胞中的作用，只有一份报告表明mDia1调节鼠间充质干细胞的成脂分化57。我们证明增加的DIAPH1转录水平在DM中而不是在响应GC1的NDM脂肪细胞中。此外，我们观察到用SMIFH2进行的治疗减弱了NDM和DM ECM脂肪细胞培养物中AGE-ECM诱导的胰岛素刺激的葡萄糖摄取的抑制作用，提示hDia1在促进AGE引起的脂肪细胞中细胞胰岛素抵抗方面发挥了作用。这些观察结果，与脂肪组织Rho活性链接到胰岛素抵抗现有数据沿48，49，50，51，表明DM脂肪细胞可能比NDM脂肪细胞更易受AGE刺激而增加hDia1表达，从而导致DM中的细胞胰岛素抵抗。与此假设相一致的是，在DM中而非在NDM脂肪细胞中观察到响应GC1的DIAPH1转录水平增加。
我们研究了VAT，因为它与代谢性疾病有更强的联系，并且由于获取SAT的限制。DM受试者比NDM受试者年龄更大，包括更多的男性，并且其他代谢疾病的患病率更高。我们在NDM组和DM组之间的比较中对事后年龄，性别和BMI进行了调整，并根据配对分析对每个受试者的AGE治疗组和非AGE治疗组进行了比较，从而进行了内部控制。尽管如此，仍将需要进行更大的研究，以严格解决年龄，性别，药物使用和其他临床变量在导致ECM-脂肪细胞串扰的DM特异性差异中所起的作用。已知PNGase F对N-聚糖具有特异性，但我们的数据表明，至少通过荧光测量，它也能去除AGE部分。PNGase F可能具有比目前理解的更广泛的特异性，或者，我们可能已经观察到PNGase F去除了AGE修饰的N-聚糖。将来需要使用质谱和其他生物化学方法进行详细研究才能回答这些问题。通过将可溶性糖基化胶原蛋白直接添加到培养基中，我们研究了糖基化胶原蛋白对脂肪细胞的影响，但是对胶原蛋白包被的培养板的研究可能会提供不同的结果，这将在以后的研究中加以解决。体外高糖调节不是AGE诱导的理想模型，可能诱导的AGE部分与体内存在的不同。但是，这是公认的AGE诱导方法，在我们的模型系统中，达到的AGE水平与在DM脂肪组织中观察到的相似。未来的研究将研究替代AGE-诱导方法，包括核糖或乙醛酸空调58，59。最后，虽然经常用作hDia1的抑制剂60，61，SMIFH2还抑制其他包含formin域的蛋白质，这些蛋白质可能调节AGE对脂肪细胞代谢的影响。未来研究使用shRNA靶向靶向敲除hDia的未来实验将阐明这一问题，迄今为止，该方法在3D-ECM-脂肪细胞培养中尚不可行。
我们证明AGE可能通过Rho信号介导hDia1的调节介导人类脂肪细胞中的ECM-脂肪细胞代谢串扰。这些数据暗示AGE修饰的脂肪组织ECM和Rho信号传导是DM中脂肪细胞代谢功能障碍的贡献机制。
所有人类受试者均获得研究参与的知情同意书，并获得了密歇根大学和安阿伯·退伍军人事务医疗系统的机构审查委员会的批准。按照所有方法均按照所有相关的机构，联邦和国际准则和法规进行患者招募和所有方法。大肥胖的大网膜的增值税，腹壁的SAT以及减肥手术期间从肥胖受试者中收集的外周血（表 1）。由于组织数量的限制，每个实验总共使用了165个受试者的组织和细胞样本子集，每个实验的受试者数以图例形式报告。DM受试者是根据需要药物治疗且血红蛋白A1c（HbA1c）> = 6.5％的临床诊断定义的。根据美国糖尿病协会的标准，没有糖尿病的临床病史和HbA1c <5.7％定义了非糖尿病（NDM）受试者62。
使用基于AGE自发荧光的荧光显微镜的脂肪组织和血浆中的AGE水平进行定量24，25。将脂肪组织在液氮中冷冻，包埋在最佳切割温度化合物中，在Microm HM500OM低温恒温器（GMI Inc.，Ramsey，MN，美国）上切片（100μm），并使用10X物镜在Olympus IX-81荧光显微镜上成像，激发377nm +/- 25nm，发射447nm +/- 30nm。对于每张幻灯片，在9.6 ms曝光，ISO 200的条件下，捕获了四张灰度TIFF图像。使用ImageJ软件测量像素强度。对于血浆，将5μl血浆点在载玻片上，干燥，然后用相同的技术成像，但曝光时间为8.78 ms。
脂肪组织ECM隔离按照描述进行6的基础上公开的方案的修改，63，64，65。将VAT外植体在10 mM Tris，5 mM EDTA，1％苯基甲磺酰氟（PMSF），pH8.0中于−80°C，20分钟至37°C冻融三遍，然后在0.25％中于37°C孵育24小时胰蛋白酶/0.1%EDTA；然后在漂洗缓冲液（8 g / L NaCl，200 mg / L KCl，1 g / L Na2HPO4、200 mg / L KH2PO4、1％PMSF）中于37°C洗涤20分钟3次; 然后在55 mM Na2HPO4、17 mM KH2PO4、4.9 mM MgSO4 * 7H2O，160 U / mL DNase I II型，100μg/ mL RNase IIIA，80 U / mL脂肪酶VI-S（Sigma）中于37°C孵育24小时-美国密苏里州圣路易斯的奥尔德里奇公司（Aldrich Inc。），PMSF为1％；然后依次在37°C的漂洗缓冲液中洗涤20分钟3次; 99.9％异丙醇，1％PMSF 25°C一次，持续24小时；然后在漂洗缓冲液37°C中洗涤20分钟3次；然后在70％乙醇中，37°C下洗涤20分钟，三遍；然后在37°C的存储溶液（PBS，1％PMSF）中洗涤20分钟一次;
为了制备AGE修饰的ECM，将200 mg VAT外植体在37°C的维持培养基中培养72小时，该培养基包含17 mM（低葡萄糖），50 mM或100 mM（高葡萄糖）葡萄糖或100 mM甘露醇，基于剂量先前文献59，66，67和剂量-反应实验表明100 mM葡萄糖的AGE-修改类似于天然DM脂肪组织（图的产生水平 3B）。加入去糖基化酶PNGase-F，用于72小时处理的最后24小时（2.5单位/ mL，Sigma-Aldrich Inc.，美国密苏里州圣路易斯，目录号F8435-300UN）。然后如上所述从处理过的组织制备ECM。
SEM如所述进行6。简要地说，将组织固定，用胶体石墨固定在SEM存根上，溅射镀金，并在Amray 1910扫描电子显微镜上捕获图像。
2D-脂肪细胞培养物如所述进行6，68。简言之，脂肪组织用II型胶原酶（PBS / 2％BSA中的2 mg / mL，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司）在37°C下消化60分钟，离心250rcf，回收基质血管细胞沉淀接种过夜，贴壁细胞传代3次以富集前脂肪细胞，将其在DMEM / F12、15％胎牛血清（FCS），10％DMSO的液氮中冷冻直至使用。为了产生用于2D培养的成熟脂肪细胞，将前脂肪细胞（60,000个细胞/孔在24孔板中）铺在DMEM / F12、15％FCS中直至融合，在分化培养基（DMEM / F12、2.5 mM谷氨酰胺，15 mM HEPES）中培养7天，10 mg / ml转铁蛋白，33μM生物素，0.5μM人胰岛素，17μM泛酸酯，0.1μM地塞米松，2 nM T3、540μMIBMX，1μM西格列酮），然后在维持培养基（DMEM / F12，2.5 mM）中培养7天谷氨酰胺，15 mM HEPES，
将未糖化或糖化的重组人胶原1以可溶形式添加到培养基中进行2D培养。为了糖基化，将重组人胶原蛋白1（Rockland Immunochemicals，Inc.，利默里克，宾夕法尼亚州，美国，目录号009-001-103）与100 mg / ml的500 mM D-葡萄糖-6-磷酸酯在PBS中孵育4周。 ，在37°C的温度下，以20μg/ ml的浓度用于培养中，根据先前公布的方法69以及剂量响应研究，我们进行了研究，浓度范围为20–100μg/ ml，证明20μg/ ml可最大程度地脂肪细胞葡萄糖摄取。
3D-脂肪细胞培养物如所述进行6，68。将脱细胞的人VAT ECM用70％乙醇冲洗，在PBS中再水化，切成200 mg片段，将60,000个前脂肪细胞接种在20μL完全生长培养基（DMEM，10％FCS）中，在37°C，5％CO 2下孵育， 40分钟以使细胞粘附，然后添加0.5 mL完全生长培养基，在37°C，5％CO 2下孵育24小时，转移至新鲜的培养皿中，添加0.5 mL完全生长培养基，培养3天，然后培养在0.5 mL分化培养基中培养14天，以在ECM中生成成熟的脂肪细胞。
RAGE中和抗体（IgG2bmu-α-huRAGE）和IgG2bmu-α-hu同种型对照抗体（Abcam Inc.，Cambridge，MA，USA，Cat＃ab89911，Cat＃ab170192，2μg/ mL）或CD36中和抗体（IgAmu-α-huCD36）和IgAmu-α-hu同种型对照抗体（Abcam Inc.，Cambridge，MA，USA，Cat＃ab23680，Novus Biologicals，Centennial，CO，USA，Cat＃NBP1-97030，2在整个脂肪细胞分化过程中以及在葡萄糖摄取测定过程中，将μg/ mL）加入ECM-脂肪细胞培养物中；所述hDia1小分子formin FH2结构域抑制剂SMIFH2 60，61（25μM，Sigma-Aldrich公司公司，圣路易斯，MO，USA，目录号344092）用于前以及在整个葡萄糖摄取测定20分钟。
为了进行葡萄糖摄取测定，将2D培养或3D-ECM中的脂肪细胞在0.5 mL维持培养基中37°C培养72小时。然后在无血清DMEM：F12中，37°C，12小时; 在PBS / 1％BSA中，37°C，2小时; 在PBS中洗涤，然后在0.5mL PBS +/- 100nM人胰岛素中，在37℃下培养40分钟；于0.5mL PBS +/- 200nM的胰岛素，0.1mM的2-脱氧葡萄糖，2微居里/毫升脱氧d葡萄糖基-2- [1,2- 3 H（N）]（Perkin Elmer公司，沃尔瑟姆，MA， USA）37°C，40分钟，然后用PBS洗涤，并加入420μL1％SDS溶液，并用移液器裂解细胞。10μL细胞裂解液用于Bradford蛋白测定；将400μL裂解物转移到2 mL闪烁液中，并在闪烁计数器上测量每分钟的计数（cpm），并针对细胞裂解物蛋白浓度进行标准化。
在Trizol中裂解脂肪细胞，并用RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit（Qiagen Inc.，Hilden，德国）提取RNA。使用NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）评估mRNA的纯度，浓度和完整性。使用Applied Biosystems高容量cDNA存档试剂盒（Applied Biosystems，福斯特城，加利福尼亚州，美国）将等量的输入RNA逆转录。用TaqMan引物和试剂（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司）进行RT-qPCR。数据表示为倍数变化，该倍数变化是根据2- ΔΔCt方法70从最小二乘均方差计算得出的，并已标准化为B2M和GAPDH的均值 管家基因对照，其Ct值不随GC1处理而变化。
在STATA 15版（StataCorp LLC，美国德克萨斯州大学城）中进行统计分析。测试数据的正态性和均方差性，并进行相应分析。先验α水平设定为5％。度量的平均值和标准误差显示在图中。线性混合模型用于比较糖尿病状态下组织中的AGE-免疫荧光，使用糖尿病状态和仓库之间的相互作用项来评估DM和NDM组织之间的差异是否受到仓库的影响。使用线性混合模型分别在VAT和SAT中估算AGE免疫荧光与HbA1c之间的关系（图 1）。在2D培养实验中，线性混合模型用于检测经对数转化的葡萄糖摄取量（UC1，GC1）和糖尿病状况的差异。治疗和糖尿病状态的交互作用术语用于评估DM和NDM患者治疗对葡萄糖摄取的影响是否不同。对于RT-qPCR数据，使用双向ANOVA混合模型比较了实验组之间的dCT值（图 2）。对于3D培养实验（图 3，4），使用线性混合模型估算不同水平的ECM糖基化（甘露醇，低血糖，中葡萄糖，高血糖，PNGase，如适用），糖尿病状态，RAGE抗体和SMIFH2的影响，以及这些因素之间的相互作用葡萄糖摄取。所有模型均采用随机截距法来解释受试者内部的相关性，同时控制脂肪细胞和ECM患者来源的年龄，性别和BMI。使用Bonferroni校正进行多次测试，进行事后成对比较，以检测自变量不同水平下结果变量的差异。图中的数据为平均值的标准误差。
为该研究生成和分析的所有数据都包含在已发表的文章和补充信息文件中。所有试剂均应根据合理要求免费提供，但人体组织和细胞样品以及人体受试临床信息或鉴定信息除外，由于IRB，HIPAA和机密性限制，这些信息不允许共享。
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