摘要
新兴证据支持增强RNA（eRNA）在调控靶基因中的作用。在这里，我们研究骨骼肌成肌细胞分化过程中的eRNA调控和功能。我们提供了增强子转录和eRNA分类的全景视图。主转录因子MyoD在激活eRNA产生中至关重要。超级增强子（se）生成的seRNA-1和-2在体外和体内促进肌原性分化。seRNA-1通过与异质核核糖核蛋白L（hnRNPL）结合来调节两个附近基因，肌红蛋白（Mb）和载脂蛋白L6（Apol6）的表达水平。seRNA-1上的CAAA 片段对于介导seRNA-1至关重要/ hnRNPL绑定和功能。seRNA-1 -hnRNPL相互作用的破坏减弱了Mb位点上的Pol II和H3K36me3沉积，同时降低了其转录。此外，对整个hnRNPL结合转录组的分析表明，它与eRNA的关联是多种细胞中的普遍现象。总的来说，我们提出eRNA-hnRNPL相互作用代表了有助于靶mRNA激活的机制。
细胞类型的特异性转录程序通常由一类称为增强子的顺式调节元件决定。转录因子（TFs）通过嵌入的识别序列结合这些增强子，募集并与辅因子合作，通过增强子和启动子1之间的染色质环调节靶基因的转录。增强剂的簇，称为超增强剂（SES）或拉伸增强剂，被认为在确定小区标识发挥特别显着的作用2，3。与典型的增强子（TE）相比，SE包含较大的开放染色质结构域，在赖氨酸27（H3K27ac）处用组蛋白H3的乙酰化作用进行了分界，并富集了与主TF的结合。的TE / SE景观重塑常发生在响应于发育和/或环境刺激，占随后转录变化4，5。我们最近的工作巩固了骨骼肌成肌细胞（MB）分化过程6中的这一概念。此过程涉及MBs分化为肌管（MTs），并且是在肌肉发育和损伤诱导的再生过程7中骨骼肌形成的关键步骤。此外，我们巩固了成肌分化蛋白（MyoD）增强子/ SEs的组装和激活6。除了用作结合关键转录因子集线器，它已被广泛接受增强剂也普遍被RNA结合聚合酶II（POL II），生成双向的非编码RNA称为增强剂的RNA（eRNAs）8，9，10，11，12。但是，关于它们的功能和机械作用的当前知识是有限的。
新兴证据还表明，eRNA是增强子功能不可或缺的组成部分。在大多数情况下，eRNAs作用在顺刺激与尔娜基因座是相邻或驻留在相同的拓扑域相关联（TAD）的靶mRNA的转录9，10，11，13。机械上，赖等。和李等。证明eRNAs可以建立和/或稳定的染色质通过与介体的组分相互作用或黏结复杂增强子和启动子之间循环10，14。同样，最近的一项研究显示，MyoD1远端增强子表达的eRNA （DRR eRNA）激活通过与黏蛋白复合物15相互作用反式表达肌生成素。在一项单独的研究中，eRNA还通过充当负伸长因子（NELF）的诱饵来直接参与转录过程，以促进暂停的Pol II释放进入生产性伸长阶段16。赵等。后来还显示eRNA可能直接与正转录延伸因子b（P-TEFB）的成分相互作用，以控制转录延伸17。最近，显示出eRNA或更广泛意义上的新生RNA能够捕获转录因子YY1并增加其在DNA 18上的局部浓度。最后，eRNA还以独立于序列的方式与转录共激活因子CREB结合蛋白（CBP）相互作用，以刺激核心组蛋白乙酰转移酶活性，从而促进基因表达19。尽管我们对eRNA的理解有了这些实质性的进步，但是对它们的宿主增强子中的机械作用的研究仍很不完整，这保证了寻找额外的蛋白结合伴侣和eRNA调节靶基因表达的未知模式的努力。
在这里，在这项研究中，我们提供了eRNA纲要，并通过比较分化成肌细胞中全局运行测序（GRO-seq），PolyA +和总RNA-seq的数据，对不同的eRNA亚家族进行了分类。我们证明了具有不同表达水平，Pol II关联，组蛋白修饰和TF结合等特征的各种eRNA种类的存在。我们还显示了MyoD在肌原性分化诱导eRNA产生中的重要作用。使用从SEs产生的两个eRNA，seRNA-1和seRNA-2作为范例，我们进一步表明，分化诱导的seRNA在体外和体内均具有促进肌发生的作用。深入剖析seRNA-1如何调控靶基因Mb转录导致揭示出seRNA-1与hnRNPL蛋白特异性结合，而seRNA-1 -hnRNPL相互作用的破坏减弱了目标基因上的Pol II和H3K36me3沉积。明确指出了CAAA 通道对于介导seRNA-1 / hnRNPL 的相互作用和功能至关重要，从而在体内和体外调节邻近的基因表达。CLIP-seq可以识别hnRNPL在多种细胞类型中与转录组范围内的eRNA结合，这表明hnRNPL / eRNA结合可能是调节靶基因转录的一般机制。我们提供的证据表明，seRNA在通过与hnRNPL相互作用来协调目标mRNA的转录中起关键作用。
为了获得增强子转录及其在细胞分化过程中的重塑的全景和高分辨率视图，我们利用了经过充分研究的MB分化过程，利用了C2C12小鼠细胞系（补充图 1a，b）。GRO-seq用增殖的MB和区分的MTs（分化48小时）进行两次生物学重复（补充图 1c）。分析生成的数据以定义转录单位，然后将其与先前分类为C2C12细胞6的增强子库重叠。结果，在MB细胞中总共获得了16,835个TE相关的RNA（teRNA）以及6,698个SE相关的RNA（seRNA）。同样，在MT细胞中定义了14,997个teRNA和7,252个seRNA（补充图。 1d和补充数据 1）。不出所料，由于GRO-seq检测新生转录本的能力，teRNA / seRNA的数量远远超过了TE / SE的实际数量20。当检查它们在MB分化过程中的表达动态时，我们发现MT与MB显着上调了1,274，下调了1,627，而大多数保持不变（n = 24,184）（图 1a，补充图 1e和补充数据 1）。）。值得注意的是，H3K27ac水平（图1a）和±100 kb窗口内邻近基因的表达会随之变化 14（图 1b）观察到与eRNA表达的变化一致，这与以前的发现一致，表明eRNA的产生是活性增强子的关键特征。其中，有423个相邻基因在肌肉分化过程中与eRNA的表达趋势相同（分别上调157个和256个下调）（补充说明 1）。
一个 GRO-SEQ检测eRNAs那名上调，下调或肌管（MT）与成肌细胞（MB）细胞不变，而改变与H3K27ac重塑呈正相关。b MT与MB中与上调或下调的eRNA相关的邻近基因的表达。c eRNA分为“稳定”（由GRO-seq和总RNA-seq捕获）和“不稳定”转录本（仅由GRO-seq捕获）；发散的增强子转录又分为三类：双稳态（两个方向均产生稳定的转录本），单稳态（仅一个方向均产生稳定的转录本）和不稳定（两个方向均产生不稳定的转录本）。d以上类型的不同eRNA的分布。Ë箱形图显示了MT中上述三种类型的eRNA的GRO-seq信号或Pol II结合的读密度（RPM）。f分析总RNA-seq或GRO-seq显示，与TEs相比，MB或MT中较高百分比的SEs产生eRNA（eRNA +）。与teRNA相比，g seRNA显示出更高水平的GRO-seq信号。h TF热点区域显示出的GRO-seq信号水平明显高于非热点增强子区域。一世从MB-（左）或MT表达的SE（右）中鉴定出的代表性eRNA的基因组快照，显示了MB和MT细胞中的H3K4me1，H3K4me2，H3K27ac，H3K4me3，Pol II和H3K36me3 ChIP-seq图谱以及GRO-seq。红色栏突出显示东南地区。“笔录”轨道指示通过GRO-seq识别的笔录单位。GRO-seq信号分别以“ +”（红色）和“-”（浅绿色）链显示。Ĵ期间C2C12成肌120小时分化过程几种MT seRNAs表达动力学的定量RT-PCR测量。在心脏毒素（CTX）注射诱导再生后，测量肌肉中的k seRNA表达。 每组n = 3。j和k中的数据代表三个独立实验的平均值±sd b，e和h中的数据以箱图形式显示。中心线，中位数；框限制，上下四分位；晶须，四分之一间距的1.5倍。b，e和h的统计分析是通过Mann-Whitney非参数检验完成的；*** P ＜0.001。源数据作为源数据文件提供。
接下来，尝试对eRNA进行分类，我们利用来自C2C12细胞的总RNA 或PolyA + RNA 应用了利用多个RNA-seq数据集的整合分析（补充图 1d）。简而言之，从总RNA-seq组装RNA转录物以生成lincRNA目录。当与增强子库重叠时，它在MB中产生了1746 teRNA和1747 seRNA的目录（补充图 1d），其中在PolyA + RNA-seq中可以检测到803 teRNA和819 seRNA （补充图 1d，g）。同样，在MT中共定义了2406个teRNA和2275个seRNA，其中在PolyA +中发现了965和1,016RNA序列 我们认为被GRO-seq和总RNA-seq捕获的eRNA相对稳定，而仅被GRO-seq捕获的eRNA相对不稳定。与普遍的观念一致，它们中的许多被不同地转录。将趋异对的转录起始位点（TSS）进一步分为三类：双向（Bi）稳定的（两个方向均产生通过总RNA-seq检测的稳定转录本），单向（Uni）稳定的（仅一个方向产生稳定的转录本）和不稳定（只能通过GRO-seq检测到）（图 1c）。可以预期，大多数eRNA不稳定。很小的一部分是双稳态的（图 1d，补充图 1g，h）。我们的结果表明，与单稳态和不稳定的相比，双稳态eRNA表现出最强的GRO-seq图谱和Pol II结合（图 1e，补充图 2a）。该区别在组蛋白标记和TF结合方面也很突出（补充说明 1）。
与TEs 3相比，SEs表现出增强的增强活性。一致地，我们发现SE产生eRNA的比例更高，称为eRNA（图 1f）。通过GRO-seq，几乎所有的SE都被转录，而TE的转录率仅为60％。通过总RNA序列，MB或MT中约70％的SE产生了seRNA，而TE的＜20％。可以预期，在全球范围内，seRNA的表达要比teRNA高得多（图 1g）。SE产生的稳定eRNA（双稳态和单稳态）也比TE产生的比例高得多（补充图 1h），这表明SERNA是SE功能的重要组成部分。此外，我们发现在我们最近的研究中定义的TF热点6与非热点相比与更强的eRNA表达相关（图 1h），则需要进一步强调的是TF热点是超级活跃的中心，它可能会调节增强器功能。
我们先前证明了SE的阶段特异性及其在MB命运向MT 6过渡期间的逐步重塑。一致地，seRNA在此过程中表现出独特的表达动力学，例如在LOC106557447和Myosin重链（Myh）基因簇（Myh1，Myh2，Myh4，Myh8和Myh13）的增强子上得到了例证（图1i）。 ）。Myh基因与MT中的肌肉收缩有关，并且通过H3K27ac标记在MT中鉴定了相应的阶段特异性SE。GRO-seq揭示了该SE在分化过程中发生了双向转录，伴随着H3K4me1 / 2，H3K27ac，Pol II和H3K36me3等活性标记的诱导（图 1i）。相反，在LOC10655774基因上，在相关的SE上观察到这些活性标记和seRNA表达的降低（图 1i）。通过在不同时间点（DM -24、0、24、72和120 h）分化的细胞中进行定量PCR（qPCR），分化后的确能强烈诱导与MT阶段相关的seRNA（seRNA1-11）（图 1j）。）; MB seRNA在完全分化的MT（DM 120小时）中大大降低，但有些在早期分化阶段显示出有趣的上调（补充图 3a）。为了进一步巩固上述seRNA在肌肉细胞中的表达动态，我们还分析了它们在新鲜分离的肌肉干细胞（也称为卫星细胞，SC）中的表达（补充图 3b）。与C2C12细胞的结果一致，11种MT seRNA中有9种在SC分化过程中表达增加（72小时对48小时）。对于MB seRNA，可检测到十分之七，实际上五种表明该过程有所减少（补充图 3c）。）。此外，为了评估体内塞尔纳表达谱，我们采取了一种广泛使用的肌肉再生的模型，其中心脏毒素（CTX）或氯化钡的优点2个施用诱导肌肉损伤，随后肌肉再生21，22，23，24，25。大多数MT seRNA的表达在第2天之前几乎未检测到，但在CTX损伤后的第3-4天被强烈诱导（图 1k），与成肌细胞分化的高峰相伴，因此与上述C2C12体外发现相符（图2k）。 1j）。此外，在新生小鼠的肢体肌肉（3天至2周龄）中观察到大量的这些seRNA，它们经历了活跃的肌发生，但是当新生肌发生停止2周后下降（补充图 3d和补充说明 1）。总的来说，以上结果表明，eRNA在肌肉细胞中普遍转录，并可能充当增强子的组成部分，因此有必要对其功能机制进行进一步研究。
接下来，我们寻求鉴定决定在成肌分化过程中eRNA表达动态的关键TF。应用HOMER 26，我们预测了可能在以MB或MT高表达的eRNA的TSS的2 kb窗口内富集的潜在TF结合基序（log 2（倍数变化）> 2或<−2，P值<0.05）（补充）图 4a）。排名最高的基序的一部分被相应细胞阶段6中的已知关键调节子所束缚，例如，增殖MB中MT和JUN中的MyoD和MyoG（补充图 4a）。此外，分析了C2C12可用的TF ChIP-seq数据集后，我们注意到MB和MT上eRNA的TSS处有多个TF的收敛（图。 图2a，补充图 4b）。MT中公开的一种独特的组合模块涉及MyoD，MyoG，TCF12，TCF3，MEF2D，PBX1和FoxO3（图 2a，补充图 4b），这与我们最近的发现一致，表明该模块参与MT中的SE装配6。在MB中也发现了相似的TF关联和组合模块（图 2a，补充图 4b）。要了解由TF MyoD大师控制的eRNA的全谱，这在先前的报告中曾提出27，我们将MyoD ChIP-seq配置文件与上述GRO-seq数据集相交。我们的分析显示，增强子上MyoD结合位点周围有明显的信号，在SE上的读取密度远比TE更高（图 2b）。如果使用total或PolyA + RNA-seq，则读密度显着下降，表明GRO-seq是检测MyoD诱导eRNA的更灵敏方法，并且大多数eRNA可能不稳定。在GRO-seq衍生的增强子转录单位中，我们观察到MB中34.7％的seRNA和MT中59.1％的tRNA在其TSS处具有MyoD结合，而teRNA分别具有31.5％和45.5％（补充图 4c）。），这再次表明MyoD在MB和MT中都普遍结合了seRNA TSS。此外，对于MT与MB中上调的eRNA，MyoD结合在其同源TSS处急剧增强（图 2c）；相比之下，下调的eRNA在TSS处的结合略有减少（图 2c），反映了成肌细胞分化过程中MyoD结合在eRNA诱导中的关键作用。为了加强上述发现，在我们最近由CRISPR-Cas9产生的MyoD敲除（MyoD -/-）细胞中进行了GRO-seq （补充图 1c和补充数据 3）。6通过对MyoG和MyHC阳性细胞进行免疫荧光（IF）染色评估，突变细胞显示出预期的分化缺陷（补充图 4d）。响应于MyoD丢失，MT eRNA（teRNA和seRNA）的表达显着减少，但对于MB eRNA则适度增强（图 2d，补充图 4e，f和补充数据 3）。如seRNA-1，-2和-5所示（图 2e），MyoD耗尽几乎阻止了分化过程中其转录的剧烈诱导，这已通过qRT-PCR证实（图 2f）。，请参见补充图4g中有关其他MT相关seRNA的其他示例 。我们还应用了针对MyoD的短干扰RNA（siRNA）的敲低策略。我们发现，敲除MyoD也会减少MT seRNA（图 2g），再次支持了分化过程中MyoD在seRNA诱导中的激活作用。的耗尽肌细胞生成素，其也被富集在尔娜的TSS，在另一方面，一些但不是所有seRNAs（补充图的表达减少 4H）。最后，当MyoD在小鼠胚胎的10T1 / 2成纤维细胞中过表达过表达，以触发肌源性转分化，我们注意到seRNAs表达的诱导或增加（图 2h）。
MB或MT中eRNA TSS上TF结合的无监督聚类。颜色代码表示两个TF在其结合位点之间的Pearson相关系数（PCC）。b SE和TE处MyoD结合近端区域（MyoD结合位点中心的±1 kb）中GRO-seq，总和PolyA + RNA-seq信号之间的比较。c MyoD ChIP-seq信号位于上调（左）和下调（右）eRNA的TSS两侧±2.5 kb之内。d来自WT或MyoD基因敲除（MyoD -/-）细胞中SE或TE的平均GRO-seq信号的分布。e在MyoD中eRNA下调的插图-/-与WT细胞相比，seRNA-1，-2和-5的GRO-seq标签计数。条形图显示了RPKM中GRO-seq信号的定量。˚F在分化的MyoD seRNAs的qRT-PCR的测量- / - VS WT细胞。g qRT-PCR检测来自48 h分化为对照或MyoD siRNA的C2C12细胞的seRNA。h Top：用对照或表达MyoD的质粒转染10T1 / 2细胞；将细胞收集在生长培养基（GM）或分化培养基中48小时（DM）。通过半定量RT-PCR测量seRNA，MyoD和Myogenin的相对表达。底部：Western印迹证实了MyoD过表达。我在MT细胞的MyoD的ChIP-PCR在塞尔纳-1或塞尔纳-2的TSS。Ĵ在用对照或MyoD siRNA转染的48小时分化的C2C12细胞中检测到了seRNA启动子的荧光素酶报告基因活性。k在过量表达MyoD的10T1 / 2细胞中上述seRNA启动子的荧光素酶报道基因活性。l MyoD ChIP-seq信号在过表达MyoD的10T1 / 2细胞中的seRNA-1，-2和-5的TSS上的分布。数据在˚F，克，我代表平均三个独立实验的平均值±SD中的数据b在箱线图呈现。中心线，中位数；框限制，上下四分位；晶须，四分之一间距的1.5倍。统计学分析是采用Sidak事后检验（f）或两尾不成对学生t检验（g，i，j，k），ns，不显着，* P <0.05，** P <0.01和*** P <0.001。源数据作为源数据文件提供。
为了进一步阐述MyoD的直接调控，我们通过ChIP-PCR 证实了ChIP-seq在seRNA-1和-2位点上鉴定的MyoD结合（ChIP-PCR）（图 2i，补充图 4i）。另外，我们将其具有MyoD结合位点的TSS区-2克隆到了报告基因构建体中。预期地，报告子活性在分化期间显着增加，但是在MyoD抑制后显着降低（图 2j，补充图 4i）。启动子记者还显示，在10T1 / 2细胞中MyoD过表达后，活动随之增加（图 2k）。）。此外，在转分化28期间在这些启动子上检测到MyoD的直接结合（图 2l），表明在MyoD指导的细胞重编程期间，seRNA的MyoD诱导是突出的现象。总之，这些数据巩固了MyoD在成肌细胞分化过程中诱导eRNA产生的关键作用。
鉴于许多MT seRNA在C2C12成肌细胞分化过程中被明显诱导（图 1j），我们推测它们可能在驱动分化中发挥积极作用，成为SEs的重要组成部分。因此，被选择用于深度功能表征的最高诱导的两个seRNA -1和seRNA-2（补充图 5a）。如图3a所示 ，它们源自小鼠染色体15和3上的两个SE，并且如GRO-seq所示被双向转录。然而，PolyA + RNA-seq分别仅在SE中捕获了单向转录物。它们在MB中几乎检测不到，但在MT中高表达。没有人类对应的seRNA-1尽管实际上有8.44％的eRNA显示出人类和小鼠基因组之间的进化保守性，但-2和-2似乎仍然存在（补充图 5b）。不出所料，其表达的上调与活性组蛋白修饰H3K4me1，H3K4me2，H3K27ac，H3K4me3和H3K36me3和Pol II的结合一致，但与阻抑组蛋白标记H3K27me3的变化呈反相关（图 3a）。）。此外，对来自各种组织的公开可用RNA-seq数据进行的转录组分析表明，seRNA-1和-2在多种组织中均有表达（补充数据 2）。为了进一步表征其功能，我们使用互补DNA末端的快速扩增（RACE）将其克隆，结果表明seRNA-1是具有两个外显子的1606 nt转录物，而seRNA-2是具有两个外显子的seRNA-2 1384 nt（图 3b，c）。两个转录物均具有聚腺苷酸化位点。RNA荧光原位杂交（FISH）发现了两个同时存在于细胞质和细胞核中的seRNA（图 3b，c，补充图 5c，d）。在细胞核和细胞质中均检测到seRNA-1信号，但在细胞核中似乎更高。在细胞核中发现了几个强烈的聚焦信号，大概代表了它的转录或作用位点29。seRNA-2信号更分散在细胞中，并检测到相似的聚焦信号。与它们在MT和MB中的诱导一致，在MT与MB中，seRNA-1阳性细胞的百分比从4％增加到74％，而在seRNA-2中，seRNA-1阳性细胞的百分比从10％增加到48％。作为对照，仅在细胞核中检测到了Malat1（补充图 5c）。通过细胞分级测定进一步证实了以上发现。作为阳性对照，U1，Malat1和Xist RNAs主要存在于MB和MT 的细胞核中，而Gapdh位于细胞质中。核糖核酸1结果显示，MT中的核和细胞质裂解液水平相当，而seRNA-2的核级分稍富集（图 3d）。此外，seRNA-1的 MB 含量约为〜0.12个拷贝/细胞，而MT 含量约为7.79个拷贝/细胞（DM第2天）。seRNA-2在MB中约为2.44拷贝/细胞，在MT中约为10.04拷贝/细胞（补充图 5e，f）。此外，我们内部的iSeeRNA软件30预测这两个seRNA为非编码肽，没有任何微肽（补充图 5g）。实际上，大多数鉴定出的seRNA被预测为非编码的（补充图 5g）。）。为了深入了解它们在肌肉细胞中的功能，我们接下来在体外和体内检查了它们在各种肌生成情况下的表达动态。首先，如图1m所示 ，在C2C12分化过程中，seRNA-1表达在50％汇合（-24小时）时在增殖的MBs中低表达。当汇合度达到70-80％（0小时）时，检测到明显增加，并且急剧升高一直持续到分化后期（120小时）。一致地，其表达在SC分化期间显着增加（图 3e）。在C2C12和SC分化过程中，seRNA-2的时间动力学特征与seRNA-1相同（图 1j，3e）。
a小鼠seRNA-1和seRNA-2基因的基因组快照，显示MB和MT细胞中的Pol II和组蛋白标记ChIP-seq图谱，Poly A + RNA-seq和GRO-seq。红色栏突出显示SE区域，红色框表示seRNA基因座。GRO-seq信号分别以“ +”（红色）和“-”（浅绿色）链显示。b上图：相对于邻近基因Mb和Apol6的小鼠seRNA-1基因组结构的示意图。下图：左图：seRNA-1的RACE克隆产物（5'和3'）；右：通过单分子RNA FISH检测MT中的seRNA-1分子（红色）。比例尺，5μm。C上图：相对于邻近基因Atp1a1和Igsf3的小鼠seRNA-2基因组结构的示意图。下图：左图：seRNA-2的RACE（5'和3'）克隆产物；右：MT的FISH检测seRNA-2。比例尺，5μm。b，c中的FISH信号的定量对应于MB和MT细胞中的seRNA转录本。细胞核中至少有一个斑点的细胞被认为是“转录”。DNA（蓝色）用DAPI染色。显示了代表性的图像。d从C2C12细胞的核和胞质级分纯化的RNA的qRT-PCR分析。通过 qRT-PCR检测从Tg：Pax7-nGFP小鼠肌肉中分离出的分化SC中的seRNA-1和seRNA-2。F左：从对照或seRNA-1 siRNA（si-se1＃1或si-se1＃2）转染的48h分化的C2C12细胞中，通过qRT-PCR检测seRNA-1和邻近基因。右：qRT-PCR测量C2C12分化过程中seRNA-1以及Mb和Apol6的表达动力学。g对seRNA-2及其邻近的Atp1a1和Igsf3基因进行了上述实验。数据代表三个独立实验的平均值±sd通过单向方差分析采用Tukey事后检验（e）或两尾不配对学生t检验（f，g）ns 进行统计分析，不显着，* P < 0.05，** P < 0.01和*** P <0.001。源数据作为源数据文件提供。
生产eRNAs的已显示激活邻近基因的转录9，10，11，12，13。为了在肌发生中测试此功能性场景，我们使用siRNA消耗了seRNA-1和seRNA-2，并询问了对±150 kb窗口内相邻基因的影响14。在总水平或细胞核水平的seRNA-1或seRNA-2上实现了有效的敲除（图 3f，g，补充图 6a）。在周围的9个基因塞尔纳-1 ，敲下来的塞尔纳-1导致两个siRNA组中两个最接近的mRNA，即肌红蛋白（Mb）和载脂蛋白L6（Apol6）的水平降低，但对其他mRNA 没有影响（图 3b，f）。类似地，seRNA-2沉默导致邻近基因，ATPase Na + / K +转运亚基α1（Atp1a1）和免疫球蛋白超家族成员3（Igsf3）的减少（图 3c，g）。同时，seRNA-1的消耗对Atp1a1和Igsf3没有影响，而seRNA-2的损失并没有降低Mb或Apol6也可以证明seRNA敲低效应的特异性（补充图 6b）。当肌管过度异位反式，但是，我们并没有观察到它们的目标剧变（补充图 6C，d），大概是由于异位表达的RNA无法访问目标位点23，31。以上结果暗示，塞尔纳-1和塞尔纳-2可能施加其上的最近的目标基因的影响在顺它们的转录位点，其类似于许多已知eRNAs / lncRNAs的作用机制的接近范围内10，23，31。最后，在检查目标基因在肌肉分化和再生过程中的表达动力学时，我们观察到seRNA-1的诱导与C2C12早期分化（图3f）和SC分化期间Mb和Apol6 mRNA 的上调同时发生（补充图。 6E）。同样，对于seRNA-2基因座，Atp1a1和Igsf3的诱导与C2C12早期分化过程中seRNA-2的变化同时发生（图 3g）。在SC分化过程中，对Atp1a1观察到了相似的结果，但对Igsf3观察不到（补充图 6e）。在评估损伤诱导的肌肉再生过程中体内的表达动力学时，我们发现Mb和Apol6具有相同的动力学。它们在稳态肌肉中高表达，在肌肉受伤时急剧丧失，在再生过程中不断升高（补充图 6f）。这种模式不同于seRNA-1（图 1k），这表明seRNA-1可能在其激活中具有暂时的作用，但在恢复肌肉损伤时可能不一定要维持其表达。对于seRNA-2基因座，邻近基因与seRNA-2表现出相似的趋势（图。 1k，补充图 6f），其表达在第4天左右达到峰值。综上所述，以上结果证实了seRNA影响顺式相邻靶基因的表达，从而有必要进一步研究其潜在的作用机制（补充图7和补充图）。 注 2）。
为了寻找潜在的未确定的分子机制，其介导的seRNA介导的靶基因转录激活，我们试图通过RNA下拉测定法鉴定seRNA的蛋白质伴侣。将体外转录的生物素化的seRNA-1或seRNA-2 RNA与MT细胞的核提取物孵育，并分离出共沉淀的蛋白质。与相应的反义对照相比，在seRNA下拉序列中需进行质谱分析（MS）的55–70 kD左右的条带是独特的（图 4a）。该方法发现了分别与seRNA-1和seRNA-2潜在相关的9种和11种蛋白质（补充图 8a，b）。PLEC，VIM和CKAP4排在前列，可能是因为它们是肌肉细胞中高度丰富的细胞骨架相关蛋白。有趣的是，seRNA-1和seRNA-2都强烈回收异质核糖核蛋白家族成员hnRNPK和hnRNPL（补充图 8b）。因此，我们决定进一步探索seRNA / hnRNP关联，以试图揭示机理的见解。首先，通过蛋白质印迹法（WB）进一步证实了与seRNA的相互作用。seRNA与hnRNPL的关联要强于hnRNPK（图 4b））。然而，未发现已知的eRNA结合伴侣，介体复合物亚基1（MED1），RAD21黏附蛋白复合物组分（RAD21）与seRNA结合；与几个其它已知lncRNA结合蛋白，包括视网膜母细胞瘤结合蛋白5，组蛋白赖氨酸甲基复合体亚基（RBBP5）中未检测到交互32，YY1 18，21，和MyoD的33，34或者（图 4B），表明塞尔纳的特异性/ hnRNPL协会。此外，通过使用MT细胞的细胞提取物进行天然RNA免疫沉淀（RIP）分析，可以检测到高水平的seRNA-1，-2和-3通过hnRNPL检索到的RNRNPK抗体，但有趣的是没有通过hnRNPK抗体检索到（图 4c，补充图 8c），这表明体内hnRNPK与seRNA的相互作用可能是低亲和力的，因此无法通过相对严格的RIP条件检测到。上述结果使我们相信hnRNPL是seRNA的真正蛋白质伴侣。为了进一步巩固它们的结合特性，接下来，我们使用了一系列seRNA-1或seRNA-2的截短片段来绘制hnRNPL相互作用区域。我们的研究结果表明，在介导与hnRNPL相互作用中，seRNA-1的5'端的300 nt区域（1–300 nt）和seRNA-2的3'端的484 nt区域（901–1384 nt）至关重要。 。 4D）; 值得注意的是，hnRNPL与5'seRNA-1的相互作用与全长（FL）相当或强。一致地，这些结构域表现出RNAfold预测的高热稳定性（补充图 8d）。HnRNPL蛋白由四个RNA识别基序（RRM1-4）组成（图 4e）。通过下拉测定法，我们发现第二个RRM（RRM2）对于与两个seRNA结合都至关重要，并且RRM1的存在似乎增强了相互作用，尤其是与seRNA-2的相互作用（图 4e）。
一个在MT细胞和纯化的蛋白的核裂解物在SDS-PAGE上运行使用生物素化的塞尔纳或反义RNA的控制下进行RNA下拉测定法。提取突出显示的条带并进行质谱（MS）分析。b Western印迹（WB）分析证实了seRNA-1或-2与hnRNPK和hnRNPL的特异性结合。未检测到与MED1，RAD21，RBBP5，YY1和MyoD蛋白的关联。c在非交联的分化细胞中用针对hnRNPK或hnRNPL的抗体进行RNA免疫沉淀（RIP），然后对回收的RNA进行qRT-PCR分析。相对于IgG对照，富集确定为与hnRNPK或hnRNPL IP相关的RNA。d指示的seRNA-1或-2缺失片段是在体外产生的，用于RNA下拉分析以绘制与hnRNPL的相互作用区域。e将指定的Myc标签的hnRNPL变体（D1，D2，D3和D4）转染到293 T细胞中，并将整个细胞裂解物用于生物素化的seRNA的RNA下拉测定，以绘制hnRNPL域与seRNA-1相互作用的图谱或-2。左：Western印迹显示上述变体的过表达。D2和D4与seRNA-1或seRNA-2相互作用；右：上述变体的结构示意图。RRM，RNA识别基序。F用靶向hnRNPL的siRNA或加扰的阴性对照（si-NC）转染C2C12细胞。转染后24小时，将细胞切换至DM 48小时。通过qRT-PCR测量seRNA靶基因的表达。g进行了核运行试验，以测定在用si-hnRNPL＃1转染的上述细胞中Mb或Atp1a1的新生转录。数据代表三个独立实验的平均值±sd通过两尾不成对学生t检验（f，g），ns 进行统计学分析，不显着，* P <0.05，** P <0.01和*** P < 0.001。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们试图剖析seRNA与hnRNPL之间相互作用的功能相关性。当hnRNPL被敲除时（补充图 8e），seRNA-1靶基因Mb和Apol6明显减少（图 4f），而seRNA-1本身被上调（补充图 8f），表明功能协同作用hnRNPL与seRNA-1在激活靶基因表达中的作用 但是，与hnRNPL丢失无关，与seRNA-2，Atp1a1和Igsf3相关的靶基因不受影响（图 4f）。），表示hnRNPL / seRNA协同作用可能不适用于此seRNA。这是通过测定核上运行，这表明减少hnRNPL挫伤的转录进一步加强MB，但不是ATP1A1（图 4克）。我们推断，这可能是由于之间的相对较弱的相互作用塞尔纳-2作为和hnRNPL 塞尔纳-2只包含一个CACACA道副本在3'端类似于hnRNPL结合CA-丰富的主题35，36，而塞尔纳-1拥有8 CAAA序列在其5'端串联重复。进一步测试seRNA-1的8个CAAA是否重复（图 5a）通过介导seRNA-1和hnRNPL 之间的相互作用，从FL或5'片段中去除了CAAA片段（图 4d，∆CAAA），并用于体外RNA下拉实验。预期该缺失完全消除了FL或5'片段与hnRNPL之间的强相互作用（图 5b）。此外，我们采用CRISPR-Cas9方法在包含在C2C12细胞中的CAAA重复序列的seRNA-1基因座中引入了一个小缺失，从而产生了两个敲除（KO）克隆（图 5a，补充图 8g）。与WT细胞相比，带有hnRNPL抗体的KO细胞中的RIP测定未能检索到seRNA-1转录物（图 5c）），表明该CAAA 通道在介导seRNA-1 / hnRNPL相互作用中起着至关重要的作用。但是，CRN缺失不会改变hnRNPL的表达（补充图 8h），排除了相互作用丧失是由于hnRNPL水平降低的可能性。知道RNA选择性剪接是hnRNPL-RNA相互作用的主要功能，我们检查了seRNA-1是否在KO细胞中选择性剪接，发现CAAA 通道的丢失不影响其剪接，保留了连接位点完整（图 5a，补充图）。 。 8克）。然而，去除CAAA束似乎已经改变了seRNA-1的二级结构（补充图 8i）。）。为了测试CAAA 通道的功能重要性，我们发现KO细胞中Mb和Apol6的表达大大减弱（图 5d），强调了CAAA通道与hnRNPL之间相互作用的重要性。出人意料的是，seRNA-1本身在KO细胞中显着增加（图 5d）。我们认为该区域可能介导seRNA-1基因座本身的转录抑制，例如，该区域可能带有阻遏物TF结合；实际上，计算机TF预测表明，去除CAAA通道后，包括ETS2，FoxO4和FoxP1在内的多个TF的结合位点可能会被消除。或者，hnRNPL / seRNA-1相互作用可能会对seRNA-1转录产生反馈调节。
一个示意图CAAA缺失通过CRISPR-Cas9药在C2C12细胞中编辑的。顶部：黑框表示删除区域。引物组1（1F和1R）用于cDNA基因分型。引物组2（2F和2R）用于qRT-PCR分析。中：CAAA序列以红色突出显示。sgRNA被设计为删除包含CAAA域的带下划线的序列。底部：Sanger测序结果确认CAAA缺失。b将具有或不具有CAAA缺失（ΔCAAA）的全长（FL）或5'末端片段的生物素化seRNA-1转录物用于RNA下拉测定，以揭示seRNA-1通过嵌入其5'区的CAAA道与hnRNPL结合。C在WT中执行hnRNPL RIP或生成的CAAA缺失（KO）细胞，与WT对照细胞相比，显示KORN细胞中hnRNPL / seRNA-1结合被取消。相对于IgG对照，将富集确定为与hnRNPL IP相关的RNA。d通过qRT-PCR测定，KO细胞中相关靶基因Mb和Apol6的表达降低，而seRNA-1升高。e CRISPR-Cas9介导的CAAA体内缺失的示意图。在出生后10岁（P10）的Pax7 Cas9小鼠肌肉内（IM）注射5×10 11 vg AAV9-sgRNAs病毒，并在4周后恢复受感染的肌肉以进行分析（P38）。 每组n = 3。F与AAV-sg-Control相比，通过基因组PCR检测注射AAV9-sg-seRNA-1的肌肉组织中的CAAA切除。未编辑的产品，304 bp；缺失产物（红色星号），220 bp。进行 qRT-PCR以测量上述注射的肌肉中seRNA-1，Mb和Apol6的水平。 每组n = 3。数据代表三个独立实验的平均值±sd通过两尾未配对的学生t检验（c，d，g）进行统计分析，* P <0.05，** P <0.01和*** P <0.001。源数据作为源数据文件提供。
为了扩展上述发现，我们接下来确定了CAAA 通道在体内调节seRNA-1邻近基因中的重要性。为此，我们利用CRISPR / Cas9介导的体内基因组编辑37删除了CAAA片段。简而言之，通过使Pax7 Cre小鼠38与纯合的Rosa Cas9-eGFP小鼠37杂交，产生了Cre依赖性Pax7 Cas9小鼠，从而用eGFP标记了所有Pax7衍生细胞（肌肉谱系）。使用肌肉型AAV9作为递送载体，由U6驱动的AAV主链生成靶向CAAA区域的体外验证sgRNA对。Pax7 Cas9小鼠在出生后第10天（P10）肌肉注射AAV9-sgseRNA-1 单次剂量（每只小鼠5×10 11 vg），并于4周后在P38 39处进行分析（图 5e）。与AAV9-sg对照组相比，我们在注射AAV-sgseRNA-1的小鼠中观察到整个基因组基因座预期的86 bp缺失（图 5f）。另外，RNA分析显示一部分转录物具有CAAA缺失，证实了体内编辑的成功（补充图 8j）。重要的是，与使用KO细胞的体外结果一致，CAAA 通道的缺失显着降低了Mb和Apol6的表达，但强烈诱导了seRNA-1水平（图 5g），表明体内存在涉及CAAA束-hnRNPL相互作用的调节轴。总体而言，以上结果表明，seRNA-1在5'-300 nt区域通过CAAA通道与hnRNPL相互作用，该基序对于hnRNPL在体内外的结合和邻近基因的激活至关重要。
尽管以上研究主要是针对seRNA-1进行的，但我们很好奇eRNA / hnRNPL相互作用是否可能是介导增强子调控靶基因表达的一般机制。为了测试该概念，我们在分化C2C12细胞中进行了CLIP（交联免疫沉淀）-seq 40，以绘制hnRNPL的转录组范围的RNA结合事件。从hnRNPL蛋白-RNA复合物中分离出RNA（补充图 9a-d），而从非特异性IgG或HA标签免疫沉淀（IP）对照中未回收到蛋白-RNA复合物，这证实了所用hnRNPL抗体的高特异性（补充图。 9b）。通过交联诱导突变位点（CIMS）分析管道40，鉴定出一组hnRNPL结合的RNA区域，该区域由29,224个簇组成，具有5个以上的读数（补充图 9c，补充数据 4）。在CLIP-seq信号与转录本表达水平之间未见正相关（补充图 9e），这表明CLIP的特异性不仅允许检测相对稳定和丰富的转录本。一致地，基序分析表明典型的hnRNPL结合CACACA基序确实在转录组的CLIP标签的中心内富集（补充图 9f，g）。大多数hnRNPL结合的RNA定位于基因区域，其中很大一部分来自内含子（70.70％）（补充图 9h））中，用在调节mRNA剪接其众所周知的角色一致41，42。另一方面，CLIP标签的很大一部分（16.15％）属于非基因类别，包括非编码基因和基因间区域（补充图 9h）。在深入分析非基因hnRNPL CLIP信号时，我们观察到〜23％的这些RNA标签与增强子库重叠（SE分别为15.85％，TE则为7.10％）（即使是补充图 9h，补充数据 4） hnRNPL仅结合了5.49％的eRNA。此外，增强子中的这些hnRNPL CLIP阳性位点显示的GRO-seq读数比没有CLIP结合的位点要高得多（补充图 9i）。），证明hnRNPL与eRNA的结合可能是转录组范围的事件。此外，与SEs相比，SEs显示出更高的hnRNPL CLIP信号，并且从SEs产生的RNA标签倾向于是稳定的eRNA（补充图 9j–l），这表明hnRNPL-CLIP信号与增强子转录之间存在正相关关系（补充图9和图11）。 。 9，10和附记 3）。
然后，我们测试了hnRNPL-eRNA结合是否与靶基因的表达相关。通过将hnRNPL CLIP-seq和RNA-seq整合到MT中，我们注意到邻近mRNA基因表达的增加与相应eRNA上hnRNPL簇的数量呈正相关（补充图 9o），表明hnRNPL的潜在激活作用-eRNA结合在整个转录组附近基因的表达中。为了测试这一点，我们在hnRNPL敲低细胞中进行了RNA 测序。与si-Control相比，hnRNPL耗竭分别导致153个基因上调和103个基因下调（补充图 9p，补充数据 5）。相对于与非hnRNPL结合eRNA相关的基因，与hnRNPL结合的eRNA相关的基因的表达倾向于在hnRNPL敲低后发生改变（补充图 9q）。此外，这些邻近基因本身并未富集hnRNPL CLIP结合（补充图 9r），排除了这些mRNA的表达是通过与hnRNPL的直接相互作用来调控的。总体而言，我们的结果表明hnRNPL-eRNA相互作用可能在调节靶基因表达中起一般作用。
在确定hnRNPL-eRNA相互作用在调节邻近基因表达中的作用后，我们寻求获得对潜在机制的更多了解。尽管hnRNPL以调节RNA剪接而闻名，但已揭示其直接参与转录。值得注意的是，它可以与KMT3A结合，调节外显子43上的H3K36me3富集，或通过与P-TEFB成员，CDK9和CCNT1 44相互作用来影响转录延伸。。因此，我们推测eRNAs可能与hnRNPL结合并束缚于目标启动子，从而通过增加Pol II或H3K36me3的局部浓度来增强转录。为了检验这一观点，我们发现确实在从C2C12 MT分离的染色质上检测到了hnRNPL的高度富集，并且通过RNase的处理显着减少了hnRNPL （图 6a），这支持了hnRNPL与染色质的缔合是RNA依赖性的观点。在seRNA-1位点进一步剖析了seRNA-hnRNPL关联的功能调节。首先，我们通过RNA纯化（ChIRP）分析45进行了染色质分离，并确认seRNA-1直接与Mb启动子结合，而不与Atp1a1的启动子结合，MyoG或MyHC（图 6b，补充图 11a）。其次，ChIP-PCR结果表明hnRNPL与Mb位点（启动子和基因区域）相关，与MBs相比，其MTs结合力增加（图 6c），同时伴随着Pol II，CDK9，CCNT1，KMT3a，与H3K36me3结合（图 6c），与Mb RNA表达的诱导一致。相比之下，在Apol6基因座上未发现它们结合的一致增加。MTs与MBs的hnRNPL，CDK9和KMT3a结合水平增加（补充图 11b）。此外，我们证明了hnRNPL通过共免疫沉淀（Co-IP）分析与CCNT1和CDK9发生了物理相互作用（图 6d）。以上结果共同支持了seRNA-1 / hnRNPL 概念可以与Mb基因座结合并调节其转录。一致地，敲低hnRNPL降低了Mb区Pol II和H3K36me3的富集（图 6e）。seRNA-1敲低还导致跨Mb基因座的H3K36me3减少（图 6f）。令人惊讶的是，在细胞中观察到了hnRNPL结合的意外增加（图 6f）。一致地，CAAA道的缺失也导致hnRNPL在尽管hnRNPL水平不变，但Mb位点（图 6g）（补充图 8h）。有趣的是，在另一个seRNA-1突变细胞中，hnRNPL的结合没有改变，其中第二外显子的短序列被去除了（补充图 11c-e）。悖论提出了一种有趣的可能性，即seRNA-1不是指导hnRNPL与染色质结合，而是更可能起到防止hnRNPL超载的作用，这可能对转录有害。实际上，当hnRNPL过表达时，Mb和seRNA-1的表达降低了，但Apol6却没有降低（图 6h）。一致地，MbhnRNPL异位过表达会抑制启动子活性（补充图 11f），表明hnRNPL的量对于Mb转录至关重要。为了进一步检验这一概念，我们发现通过CRISPR介导的基因组编辑46将seRNA-1 RNA 束缚到seRNA-1或Mb启动子（图 6i）均导致hnRNPL在Mb基因座上的沉积增加，从而降低了Mb转录水平（图 6j，k）。但是，如果将具有CAAA缺失的突变体拴系在seRNA-1或Mb上，则这些作用会减轻。启动子，加强CAAA通道在调节hnRNPL结合和Mb表达中的重要性（图 6j，k）。此外，我们发现在敲除seRNA-1后hnRNPL的募集增加有趣地导致CCNT1减少，但跨Mb基因座的CDK9结合增加（图 6f），而hnRNPL，CCNT1和CDK9之间的总结合却没有（补充图 11g），暗示hnRNPL，CCNT1和CDK9之间相互作用的复杂和未知方面。
一个在鉴别C2C12未处理或用RNA酶A处理的hnRNPL细胞分布的Western印迹分析。全细胞提取物（WCE），细胞核（N）。hnRNPL的相对水平与H3K36me3标准化并以图片J.测定b RNA（左）和DNA（右）的qPCR定量与C2C12 MT两个不同的生物素化的探针组（偶数和奇数）的lacZ啁啾或塞尔纳-1线性调频后回收。P1，P3和P4是用于检测seRNA-1 RNA的三个不同引物对。Mb，seRNA-1和Atp1a1表示对应于启动子区域的引物。c在MT与MB跨Mb位点的区域（1、2、3和4）处hnRNPL，CCNT1，CDK9，Pol II，H3K36me3和KMT3a的ChIP-PCR。d使用针对C2C12 MT中的hnRNPL或CCNT1的抗体进行Co-IP分析，并检测内源性hnRNPL与CCNT1或CDK9之间的相互作用。* IgG轻链。È hnRNPL芯片-PCR，RNA聚合酶II，和H3K36me3在上述MB基因座在控制或hnRNPL敲低细胞（＃1或＃2）。f对照或seRNA-1敲低细胞（＃1或＃2）中上述Mb位点的hnRNPL，CDK9，CCNT1和H3K36me3的ChIP-PCR。克 hnRNPL芯片-PCR在上述MB两个CAAA KO细胞系基因座与WT相比的控制。h hnRNPL在C2C12细胞中的过表达降低了seRNA-1和Mb的表达，但未降低Apol6。一世dCas9介导的seRNA-1野生型或CAAA KO突变体（ΔCAAA）与seRNA-1 TSS或Mb启动子的系链。Ĵ在上述细胞塞尔纳-1和MB的定量RT-PCR检测。上述系留后，在指定的seRNA-1或Mb启动子上hnRNPL结合的k ChIP-PCR。数据代表三个独立实验的平均值±sd统计分析是通过两尾不成对的学生t检验（b，c，e – h，j，k）进行的。ns，不显着，* P <0.05，** P <0.01和*** P <0.001。源数据作为源数据文件提供。
这项研究的发现揭示了通过与hnRNPL结合，eRNA在转录调控中的作用机制。以成肌细胞分化为范例，以seRNA-1为例，我们剖析了它如何通过与hnRNPL相互作用并在Mb位点调节hnRNPL，Pol II，H3K36me3 激活靶基因Mb的转录（补充图 12和补充说明 3）。 。我们的研究结果表明eRNAs结合hnRNPL传达了一个本地化的活动轮廓目标染色质，这是在协议与最近的几项研究结果18，19，47。例如，CBP与CBP染色质结合附近产生的RNA相互作用，RNA结合反过来刺激CBP在增强子和靶标启动子上的核心乙酰基转移酶活性，然后激活基因19。尽管如此，不同于不依赖特定RNA序列的CBP / eRNA关联，hnRNPL代表了一种范例，其中相互作用是由优选的RNA结合基序介导的。我们的研究结果确定了在5'–300 nt区域内有8个CAAA串联重复序列，这对于hnRNPL结合和依赖于seRNA-1的靶基因在体内和体外的激活都是必不可少的（图 5）。因此，hnRNPL的基因座特异性可能在很大程度上取决于RNA序列，从而在基因转录中提供了强大而准确的局部调控。
HnRNPL是众所周知的RNA的可变剪接的调节器41，42，48，我们的研究结果，但是，证明其在转录控制参与。这符合一些现有报告。在另一项研究中，Li等人。结果显示，在THP-1巨噬细胞中，lncRNA THRIL与hnRNPL相互作用以激活TNFα表达49，而lincRNA-EPS与hnRNPL相互作用以抑制免疫基因在巨噬细胞中的表达50，提示hnRNPL / lncRNA相互作用的多种功能模式。看来，因为全转录物CLIP-SEQ肌管分析和HeLa建议hnRNPL势必eRNAs全局（补充图hnRNPL /尔娜相互作用可能一般发生在许多细胞 9，10）; 结合可以反过来调节靶基因的转录输出。实际上，新兴的RNA结合蛋白（RBP）研究表明，传统的剪接因子可能具有广泛的功能。例如，Lubelsky等。最近证明hnRNPK与lncRNA结合以促进其核保留51，报告显示U1进一步加强了核蛋白剪接也为lncRNAs的染色质圈养重要的52，53。
除了定义eRNA机制外，我们还通过比较GRO-seq，总RNA-seq和PolyA + RNA-seq数据集提供了eRNA的分类。通过分析与这些类型的eRNA相关的功能，我们发现双稳态对与最高表达水平，TF占有率和活性组蛋白标记有关。尽管如此，我们必须指出，我们对稳定/不稳定的定义仅基于GRO-seq与稳态RNA-seq中存在eRNA。将来，继续探索eRNA的营业额并研究其生物发生和亚细胞定位的决定因素将是有趣的。例如，研究eRNA序列上的固有特征（例如是否存在早期聚腺苷酸化位点（PAS）和U1）将很有趣剪接信号还确定eRNA的稳定性49并确定转录激活是否与eRNA的稳定性相关（补充图 2）。
我们的研究结果发现了的MyoD在调节增强剂转录从而增强组件和激活增强的MyoD功能中的关键作用6，27。在这项研究中，我们对MyoD -/-和WT C2C12细胞的分析表明，MyoD导致了MT中eRNA的诱导，这与其在增强子激活中的既定作用相符（图 2）。出人意料的是，消融MyoD诱导了MBs中eRNA的表达，这似乎暗示了MyoD在此阶段在增强子转录中的抑制作用。在MyoD丰富的基因中失落，我们发现一些与神经系统发育有关，这与报道显示MyoD表达阻止神经元分化的报道一致54。因此，很容易推测MyoD不仅可以引发对肌原性谱系重要的增强子，而且可以抑制MBs中的神经元基因。但是，我们不能排除某些其他抑制因子与MyoD结合以抑制基因表达的可能性。
总之，我们的发现突出了hnRNPL在通过CAAA结合的seRNA-1介导的转录调控中的关键作用，从而为eRNA调控靶转录的机制提供了见识。
所有动物实验均按照香港中文大学制定的实验动物实验指南进行，并得到香港中文大学动物实验伦理委员会的批准。在香港中文大学的动物设施中，将小鼠饲养在动物房间中，光照周期为12h /暗周期为12h。对于心脏毒素（CTX）注射，大约7周大的雄性C57BL / 6小鼠以10μgml -1的浓度注射50μlCTX 到胫骨前肌（TA）。在指定的天数处死小鼠并收获TA肌肉用于分析。对于卫星细胞分选，大约八周大的纯合雄性Tg：Pax7-nGFP小鼠用于分离MuSC。对于siRNA注射，首先向约8周大的雄性C57BL / 6小鼠注射50μl的1.2％BaCl2解成TA肌肉。通过将2μMsiRNA寡核苷酸（中国上海基因制药公司）与Lipofectamine 2000（Invitrogen）预孵育15分钟来制备寡核苷酸，并在OPTI-MEM（Life Technologies，Inc.）中以最终体积50μl进行注射。 ）21，23。在指定的时间点施用siRNA。注射BaCl 2后第7天杀死小鼠并收获TA肌肉，并提取总RNA进行qRT-PCR分析。对于AAV9注射，以5×10 11的剂量在P10向纯合的Pax7 Cas9小鼠注射AAV9-sgRNA。通过肌内（im）注射获得每只动物的病毒基因组（vg）。AAV注射后4周，处死动物并分离股四头肌。然后提取基因组DNA和RNA，分别进行基因分型和qRT-PCR分析。每组总共使用三只小鼠。
小鼠C2C12成肌细胞（CRL-1772）从ATCC获得，并在37 ％5％CO 2湿润培养箱中的DMEM中补充，DMEM中添加了10％FBS，100 U ml -1青霉素和100μg链霉素（生长培养基，GM）。℃。为了进行肌原性分化，当融合度达到80-90％时，将在60 mm或100 mm平板中培养的细胞转移到含有2％马血清（分化培养基，DM）的DMEM中。将C3H / 10T1 / 2成纤维细胞（ATCC，CCL-226）在补充有10％FBS，2 mM 1-谷氨酰胺，100 U ml -1青霉素和100μg链霉素的DMEM 中在5％CO 2中培养37°C的加湿培养箱。用表达MyoD的载体或空载体对照转染后，通过切换至含2％马血清的DMEM，诱导细胞分化。在装有10％FBS，2 mM L-谷氨酰胺，100 U ml -1青霉素和100μg链霉素的DMEM中，于5％CO2湿润的培养箱中于293°C 培养293T细胞（ATCC，CRL-3216）。肌肉卫星细胞（SCs）通过FACS根据既定方法进行分类55。简要地，收集来自Tg：Pax7-nGFP小鼠的后肢肌肉并用胶原酶II（800 U ml -1在37°C下90分钟，然后将消化的肌肉磨碎并在洗涤培养基（Hams F-10培养基（Sigma），10％HIHS（Gibco），青霉素/链霉素（1x，Gibco））中洗涤通过在37°C下用胶原酶II（800 U ml -1）和Dispase（11 U ml -1）处理30分钟来释放SC 。用70 µm细胞过滤器过滤单核细胞， 并按照制造商的说明通过BD FACSAria融合细胞分选仪（BD Biosciences）选出GFP + SC。在含有20％FBS，青霉素/链霉素（1x）和2.5 ng / ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，13256，Life Technologies）的F10培养基（Sigma）中培养SC。在指定日期收获SC，并提取总RNA用于qRT-PCR分析。
将MB或MT阶段的C2C12细胞收集在冷PBS中，洗涤两次，然后在缓冲液A中（HEPES-KOH 50 mM pH 7.5、10 mM KCl，350 mM蔗糖，1 mM EDTA，1 mM DTT，0.1％Triton X -100）在冰上10分钟，不时摇动。通过短暂离心（2000 g，5分钟）收获细胞核。收集上清液作为细胞质级分。用不含Triton X-100的缓冲液A将细胞核进一步洗涤两次。使用TRIzol试剂提取RNA，并照常制备cDNA。我们将1μgRNA用于eRNA，U1，Xist，Malat1和Gapdh的qRT-PCR分析。基于每种药水（细胞质或细胞核）的总回收量，我们计算了细胞核和细胞质RNA的富集度。所使用的引物序列在补充数据6中列出 。
针对seRNA，hnRNPL或对照寡核苷酸的siRNA获自中国上海基因制药公司。在每种情况下，用于瞬时转染的浓度为100 nM。根据制造商的规程，在60或100 mm培养皿或六孔板上用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）进行siRNA寡核苷酸或DNA构建体的细胞瞬时转染。siRNA寡核苷酸的序列在补充数据6中列出 。
MyoD表达载体是吴振国教授（香港科技大学，香港科技大学）的礼物。Myc标签的hnRNP L缺失突变体质粒是王刚教授（中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所）赠予的礼物56。AAV9血清型质粒和pDF6是来自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的周斌教授的礼物。为了过表达seRNA，将seRNA-1或seRNA-2的全长序列进行PCR扩增，并将其克隆到pcDNA3.1（Invitrogen）的BamHI和XhoI位点。对于RNA下拉测定，将seRNA的全长或截短片段进行PCR扩增，并将其克隆到pBluescript KS（+）载体21的BamHI和XhoI位点。对于seRNA启动子荧光素酶报道基因构建体，从C2C12基因组DNA扩增了一个313 bp序列的seRNA-1 TSS位点或332 bp序列的seRNA-2 TSS位点（包含MyoD结合位点），并将其克隆到pGL3的KpnI和NheI位点基本向量（Promega）。所使用的引物序列在补充数据6中列出 。
使用Lipofectamine 2000（Life Technologies）以24孔格式用指示的荧光素酶报告质粒（200 ng）和10 ng Renilla质粒转染细胞。转染后24小时，将细胞分化48小时，并根据制造商的指导使用Dual-Glo荧光素酶测定系统（Promega）测量荧光素酶活性。计算所有样品的萤光素酶/海肾比率。在一式三份的生物样品中进行测量。
设计，合成了用于seRNA-1，seRNA-2和hnRNPL基因敲低的小发夹RNA（shRNA），并将其克隆到pSIREN载体（Clontech）中。为了产生具有稳定敲除seRNA或hnRNPL的C2C12细胞，将2.5 µg空pSIREN-RetroQ逆转录病毒载体，pSIREN / seRNA或pSIREN / hnRNPL与2.5 µg包装质粒一起分别转染到6 cm皿中的HEK293T细胞中。转染后48小时，收集培养上清液，过滤并用于感染C2C12细胞，然后选择嘌呤霉素（2.5μgml -1）进行三天。然后将细胞在不含嘌呤霉素的培养基中再培养3天。收集剩余的细胞用于分析。所有shRNA序列均在补充数据6中提供 。
MyoD -/- C2C12细胞先前已产生6。要删除C2C12细胞中seRNA-1基因座中第2外显子的CAAA区域或短序列，请使用CRISPR设计工具（http://crispr.mit.edu/）选择靶标特异性向导RNA（gRNA ），然后进行克隆进入pX330质粒（Addgene，42230）57。使用Lipofectamine 2000（Life Technologies）用两个构建的质粒（每个2.5μg）转染C2C12细胞。将空的pSIREN-RetroQ质粒（Clontech）共转染以进行筛选。转染后48小时，以2.5μgml -1筛选细胞嘌呤霉素3天，再在不含嘌呤霉素的培养基中培养3天。然后将细胞稀释到96孔板中以获得单细胞克隆。挑选单个菌落，PCR验证并进行Sanger DNA测序。补充数据6中提供了所有gRNA的序列和基因分型PCR引物 。
将全长的seRNA-1 RNA或CAAA管道缺失突变体与靶向其5'端的seRNA-1 TSS或Mb启动子和其3'端的U1 3'盒的sgRNA融合。然后用dCas9将RNA-sgRNA融合构建体转染到C2C12细胞中。转染后24小时，将C2C12细胞分化48小时，然后收集进行RT-qPCR或ChIP-PCR分析。补充数据6中提供了sgRNA的序列 。
约1×10 7C2C12细胞在室温下用1％甲醛交联10分钟，然后用125 mM甘氨酸淬灭。洗涤细胞，并通过在4°C下以700 g离心5分钟收集细胞，在液氮中快速冷冻并在-80°C下保存。将细胞溶解在10 ml LB1（50 mM HEPES-KOH pH 7.5、140 mM NaCl，1 mM EDTA，0.25％Triton X-100、0.5％NP-40、10％甘油，补充了cOmplete蛋白酶抑制剂（Roche）中）并在4°C的转子上孵育10分钟。在4350°C下于1,350 g离心5分钟后，将沉淀用10 ml LB2（10 mM Tris-HCl pH 8.0，200 mM NaCl，1 mM EDTA pH 8.0，1 mM EGTA pH 8.0，补充cOmplete）洗涤。蛋白酶抑制剂），方法是将其在旋转器上于4°C孵育10分钟。在4°C下以1,350 g离心5分钟后，用2 ml超声缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0、0.1％SDS，1 mM EDTA，补充了cOmplete蛋白酶抑制剂）冲洗细胞核两次。然后，将细胞核重悬于超声处理缓冲液中，并用Covaris S220（强度140 W，占空比5％，每脉冲周期200次，时间7分钟）进行超声处理。向所得的裂解液中提供NaCl和Triton X100，使其达到150 mM NaCl和1％Triton X100的终浓度，然后通过以20,000 g离心20分钟进行澄清，然后与洗涤过的Dynabeads Protein G（Invitrogen，10004D）孵育2次。 h在4°C下。将澄清的裂解物与2μgMyoD（sc-304x，Santa Cruz），hnRNPL（sc-28726，Santa Cruz），Pol II（sc-899，Santa Cruz），H3K36me3（ab9050，abcam），CDK9（sc- 484（Santa Cruz），CCNT1（sc-10750，Santa Cruz）或IgG对照（sc-2027，Santa Cruz）在4°C下过夜。第二天，用IP缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl，0.1％SDS，1 mM EDTA，1％Triton X100，补充了cOmplete蛋白酶抑制剂）洗涤30μlDynabeads ProteinG。每次IP反应后，在4°C下再孵育2小时。然后收集珠子并用IP缓冲液洗涤两次，用高盐洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0、500 mM NaCl，0.1％SDS，1 mM EDTA，1％Triton X100，补充了cOmplete蛋白酶抑制剂）洗涤两次），用LiCl洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8，250 mM LiCl，1 mM EDTA，0.5％NP-40、0.5％脱氧胆酸盐，辅以cOmplete蛋白酶抑制剂补充）两次，并用冷TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH8.0、1 mM EDTA，50 mM NaCl）。免疫复合物在ChIP洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl pH8.0，10 mM EDTA，1％SDS）于65°C孵育30分钟，洗脱液通过65°C孵育16 h进行反向交联。免疫沉淀的DNA用RNase A（0.2 mg ml-1）在37°C下2 h，然后在55°C进行3个小时的蛋白酶K处理（0.2 mg ml -1）。然后将免疫沉淀的DNA进行苯酚：氯仿提取和乙醇沉淀，最后重悬于1x TE缓冲液中。使用目标基因组位点的引物，通过Power SYBR（Applied Biosystems）进行qPCR。ChIP-PCR引物在补充数据6中列出 。计算了输入回收率。
设计针对seRNA-1的生物素标记的反义寡核苷酸（长20个核苷酸），并分为奇数和偶数库。收集分化的C2C12细胞（DM D3），并与1％的戊二醛交联，并使用100 mg细胞沉淀一次下拉。用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.0、10 mM EDTA，1％SDS以及cOmplete蛋白酶抑制剂和SUPERase In补充）裂解细胞，并在4°C下用Covaris超声仪S220超声处理以将DNA剪切至100–500 bp 。在混合缓冲液（750 mM NaCl，1％SDS，50 mM Tris-HCl pH 7.0、1 mM EDTA，15％甲酰胺，补充cOmplete蛋白酶抑制剂和SUPERase In）中，将混合的奇数和偶数探针与超声染色质杂交。由Dynabeads MyOne链霉亲和素C1（65001，Invitrogen）提供。提取的RNA和DNA分别被分离。分离的RNA被反转录并通过qRT-PCR分析以评估下拉效率。使用引物对回收的DNA进行qRT-PCR，以检查seRNA-1在某些基因组位点的富集。补充数据中列出了所有通过RNA纯化（ChIRP）探针和ChIRP-PCR引物分离的染色质的序列 6。
使用TRIzol试剂（Invitogen）提取组织或细胞的总RNA。使用M-MLV或Superscript III（Thermo Fisher Scientific）逆转录酶和Oligo（dT）20引物或随机六聚体引物（Thermo Fisher Scientific）制备cDNA。mRNA的表达在480仪器II（Roche Life Science）中用SYBR Green Master Mix（4309155，Thermo Fisher Scientific）测定。使用Gapdh和18 s进行归一化。所有使用的引物的序列在补充数据6中列出 。
SMARTer TM cDNA末端快速扩增（RACE）cDNA扩增试剂盒（Clontech）按照生产商的说明使用。简而言之，为了制备5'RACE就绪cDNA，使用试剂盒中提供的5'-CDS引物A，SMARTer IIA oligo和SMARTScribe逆转录酶对DM D3的C2C12细胞中提取的1μg总RNA进行逆转录。随后，使用旨在靶向seRNA候选物的基因特异性反向引物（RP）和试剂盒中的通用引物混合物（UPM）进行PCR扩增步骤。同样，使用3'-CDS引物A生成3'RACE就绪cDNA。使用试剂盒中的基因特异性引物和通用引物混合物（UPM）进行以下PCR扩增。基因特异性引物的序列在补充数据中列出 6。
简而言之，首先通过单酶消化将DNA构建体线性化（BamHI用于反义转录，XhoI用于有义转录和片段化转录）。使用MAXIscript T7 / T3体外转录试剂盒（Ambion）和生物素RNA标记混合物（Roche），利用所得的线性化构建体通过体外转录产生生物素化的RNA。将上述RNA在90°C下变性2分钟，立即在冰上转移3分钟，然后添加RNA结构缓冲液（Ambion），然后在室温（RT）进行20分钟的复性步骤。收集核蛋白或总蛋白用于RNA下拉测定。对于核蛋白提取，2×10 7收获MT C2C12细胞（DM D3），并与补充了全蛋白酶抑制剂（Roche）的核分离缓冲液（1.28M蔗糖； 40mM Tris-HCl pH 7.5； 20mM MgCl 2； 4％Triton X-100）一起孵育。通过在4°C下以2500 g离心15分钟来收集细胞核。将核沉淀物重悬于1 ml RIP缓冲液（150 mM KCl，25 mM Tris-HCl pH 7.4、0.5 mM DTT，0.5％NP40、1 mM PMSF，补充有cOmplete蛋白酶抑制剂和100 U ml -1RNaseOUT），并使用Ika均质器（Ika-Werk Instruments，Cincinnati）均质8个循环。以16,200 g离心10分钟以去除核膜和碎片后，将1 mg C2C12核提取物与3μg复性RNA在室温下孵育1小时。然后，将30μl预洗涤的Dynabeads M-280链霉亲和素（11205D，Invitrogen）添加到每个反应中，并在室温下再孵育1小时。使用磁力架收集珠子，然后使用RIP缓冲液洗涤5次。将得到的珠子在蛋白质印迹上样缓冲液中煮沸5分钟，以回收蛋白质，然后通过标准蛋白质印迹进行检测。对于总蛋白提取，4×10 6收获C2C12细胞（DM D3）并与补充了cOmplete的RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，5 mM EDTA，1％NP-40，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS）直接孵育蛋白酶抑制剂和RNaseOUT（100 U ml -1）在冰上放置30分钟，偶尔摇动。通过在4 o C下以16,200 g离心10分钟来回收总蛋白。然后按照上述方法进行以下下拉步骤，只是用RIPA缓冲液代替RIP洗涤缓冲液。
简言之，将8×10 6的C2C12细胞（DM D3）收获并再悬浮在100μl的冰冷的多核糖裂解缓冲液（100mM的KCl，5mM的氯化镁被2，10mM的HEPES-KOH pH 7.0的，0.5％NP-40，1 mM DTT，100 U ml -1 RNaseOUT，400μM钒基核糖核苷复合物（VRC）和cOmplete蛋白酶抑制剂）。将裂解物在冰上孵育5分钟，然后以15,000 g离心15分钟以清除大碎片的裂解物。通过用冰冷的NT2缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl，1 mM MgCl 2）洗涤三遍，制备每个反应的50微升Dynabeads蛋白G（Invitrogen，10004D）。和0.05％NP40）。然后，将5μg每种抗体添加到NT2缓冲液中制备的Dynabeads蛋白G中，并在室温下孵育40分钟。即将使用之前，用500μl冰冷的NT2缓冲液洗涤5次。最后一次洗涤后，将抗体包被的珠重悬于850μl冰冷的NT2缓冲液中，该缓冲液中补充了200单位RNaseOut，400μMVRC，10μl的100 mM DTT和EDTA至20 mM。此后，将100μl澄清的细胞裂解液添加到抗体/ Dynabeads Protein G混合物中，孵育过夜。同时，将10μl细胞裂解物保存为“ 10％输入”，用于随后的RNA分析。下一天，蛋白质/抗体/ Dynabeads蛋白G复合物用1 ml冰冷的NT2缓冲液强烈洗涤5次，重悬于100μl冰冷的NT2缓冲液中，保存10μl进行蛋白质分析以测试免疫沉淀效率。然后，在55℃用蛋白酶K处理该复合物。 o C摇动30分钟。孵育后，加入1 ml Trizol试剂，并根据制造商的说明提取RNA。使用Superscript III逆转录酶（Life Technologies）和随机六聚体引物（SO142，Thermo Fisher Scientific）制备cDNA。针对hnRNPL（sc-28726），hnRNPK（sc-25373）和正常IgG（sc-2027）的抗体来自Santa Cruz Biotechnology。
将五百万个细胞（MB和MT阶段的WT C2C12细胞或MyoD KO细胞）重悬在冰上的冷溶胀缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.5、2 mM MgCl 2，3 mM CaCl 2）中5分钟，然后裂解加入裂解缓冲液（溶胀缓冲液+ 0.5％IGEPAL + 10％甘油+ 2 U ml -1 SUPERase In和cOmplete蛋白酶抑制剂）中，然后轻轻上下吹打20次。离心机之后，细胞核依次用裂解缓冲液和冷冻缓冲液（50mM的Tris-HCl pH值8.3，40％甘油，5毫摩尔MgCl 2，0.1mM的EDTA）和最后再悬浮于100μl的冷冻缓冲液中并保存在-80℃ C。如先前报道，使用生物素-11-UTP进行了核运行（NRO）分析。简而言之，使用2×NRO预混液（10 mM Tris-HCl pH 8.0、5 mM MgCl2、1 mM DTT，300 mM KCl，1％Sarkosyl，250 µM ATP，GTP，CTP，50 µM生物素-11-UTP和0.8 U µl -1 SUPERase In）在37°C下预先平衡10分钟。然后，5×10 6将100 µl细胞核中的细胞添加到相同体积的100 µl 2×NRO主混合物中，并在37°C下孵育5分钟。按照制造商的说明，用2 ml TRIzol试剂（Invitogen）提取连续的RNA（NRO-RNA），然后在冰上用5μl冰冷的1 N NaOH破碎10分钟。通过与25μl1 M Tris-HCl pH 6.8混合来中和反应，并通过在结合缓冲液（10 mM Tris-HCl）中与30μlDynabeads™M-280链霉亲和素珠（Thermo Fisher Scientific）一起温育来纯化片段化的生物素化RNA。 pH 7.4、300 mM NaCl和0.1％Triton X-100）在室温下旋转20分钟。然后，依次用高盐洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、2 M NaCl和0.5％Triton X-100）洗涤磁珠两次，并用结合缓冲液洗涤两次，一个计时器带有低盐洗涤缓冲液（5 mM Tris-HCl pH 7.4，0.1％Triton X-100）。从珠粒洗脱后，将生物素化的RNA进行3'RNA衔接子连接，并在10 µl反应体积中孵育，该反应体积包含50 pmol的3'RNA衔接子（5'p-rGrArUrCrGrUrCrGrGrArrUrGrUrArGrArArCrUrCrUrGrArrCr // 3'InvdT /）， ），10 nmol的ATP，10个单位的T4 RNA连接酶I（NEB），40个单位的SUPERase In和10％PEG 8000在20°C下反应6小时。通过链霉亲和素珠富集连接的RNA，并用TRIzol提取RNA。然后用RNA 5'焦磷酸水解酶（RppH）（NEB）和T4多核苷酸激酶（PNK）（NEB）修复生物素化RNA的5'末端，然后进行Trizol提取。随后，将纯化的RNA与10'l反应体积中的5'RNA衔接子（5'-rCrCrUrUrGrGrCrArCrCrCrCrGrArGrArArUUrUrCrCrA-3'）（IDT）连接，其中包含50 pmol 5'RNA衔接子，10 nmol ATP，10单位T4 RNA连接酶I（ NEB），20单位SUPERase In和10％PEG 8000在20°C联合6 h。连接后，通过第三轮链霉亲和素珠富集和TRIzol提取纯化连接的RNA。使用Superscript III RT酶（赛默飞世尔科技），使用RP1引物（5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3'）（IDT）反转录生成的RNA。将一小部分cDNA连续稀释并进行测试PCR扩增以确定光学PCR循环。使用Q5进行全面PCR扩增 40单位在20°C下将SUPERase In和10％PEG 8000结合6小时。连接后，通过第三轮链霉亲和素珠富集和TRIzol提取纯化连接的RNA。使用Superscript III RT酶（赛默飞世尔科技），使用RP1引物（5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3'）（IDT）反转录生成的RNA。将一小部分cDNA连续稀释并进行测试PCR扩增以确定光学PCR循环。使用Q5进行全面PCR扩增 40单位在20°C下将SUPERase In和10％PEG 8000结合6小时。连接后，通过第三轮链霉亲和素珠富集和TRIzol提取纯化连接的RNA。使用Superscript III RT酶（赛默飞世尔科技），使用RP1引物（5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3'）（IDT）反转录生成的RNA。将一小部分cDNA连续稀释并进行测试PCR扩增以确定光学PCR循环。使用Q5进行全面PCR扩增 使用Superscript III RT酶（赛默飞世尔科技），使用RP1引物（5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3'）（IDT）反转录生成的RNA。将一小部分cDNA连续稀释并进行测试PCR扩增以确定光学PCR循环。使用Q5进行全面PCR扩增 使用Superscript III RT酶（赛默飞世尔科技），使用RP1引物（5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3'）（IDT）反转录生成的RNA。将一小部分cDNA连续稀释并进行测试PCR扩增以确定光学PCR循环。使用Q5进行全面PCR扩增®带有12.5 pmol RP1引物和RPI索引引物（5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'，其中“ NNNNNN”是索引序列）的高保真2×主混合物（NEB）（IDT）。全面扩增的最佳PCR周期为14。分离PAGE的PCR产物，并从PAGE凝胶洗脱140至350 bp的DNA。然后，对文库进行定量并在Illumina HiSeq 1500中进行测序。
从C2C12细胞中提取总RNA，并进行poly（A）选择（Ambion，61006），然后使用NEBNext®Ultra™II RNA库制备试剂盒（NEB）进行库制备。带有条形码的库以相同的浓度合并，并在Illumina HiSeq 1500平台上测序。
C2C12细胞用冷PBS洗涤，并将1/10重悬在RIPA缓冲液（150 mM Tris-HCl，pH 8.0、150 mM NaCl，0.5％DOC，0.1％SDS，1％NP-40和cOmplete蛋白酶抑制剂（Roche）中），在冰上放置30分钟。在冰冷的CSKI缓冲液（10 mM PIPES，pH 6.8，100 mM NaCl，1 mM EDTA，300 mM蔗糖，1 mM MgCl 2，1 mM DTT，0.5％Triton X-100和完整的蛋白酶抑制剂（Roche））。将细胞裂解液在4 g下于500 g离心3分钟，然后将沉淀在CSKI缓冲液中洗涤两次，然后重悬于CSKII缓冲液（10 mM PIPES，pH 6.8、50 mM NaCl，300 mM蔗糖，6 mM MgCl 2，1 mM DTT和cOmplete蛋白酶抑制剂（Roche））。一半的悬浮液用1：100稀释的RNase A（20 mg ml -1，Thermo Fisher Scientific）在37°C下放置10分钟，而另一个未处理（对照）。洗涤后，用DNase处理RNase A处理和未处理的细胞核30分钟，然后在25°C 用250 mM NH 2 SO 4提取10分钟。收集上清液用于蛋白质印迹分析。
用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白。每种抗体使用以下抗体稀释液：抗MyoG（1：2000，sc-576，圣克鲁斯），抗MyHC（1：2000，M4276，Sigma），抗hnRNPL（1：5000，sc- 28726，圣克鲁斯（Santa Cruz），抗hnRNPK（1：5000，4675，细胞信号转导），抗MED1（1：5000，A300–793A，Bethyl Laboratories），抗RAD21（1：5000，A300–080A，Bethyl Laboratories ），抗RBBP5（1：5000，A300–109A，Bethyl Laboratories），抗YY1（1：2000，sc-1703，圣克鲁斯），抗MyoD（1：2000，sc-760，圣克鲁斯），抗α-Tubulin（1：5000，sc-23948，圣克鲁斯）和抗H3K36me3（1：5000，ab9050，Abcam）。为了对培养的C2C12细胞进行免疫荧光染色，使用以下稀释液：抗MyHC（1：350，M4276，Sigma）。用尼康荧光显微镜捕获所有荧光图像。
将C2C12细胞（DM D2）在低渗裂解缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.9，10 mM KCl，0.1 mM EDTA，0.1 mM EGTA和cOmplete蛋白酶抑制剂（Roche））中裂解并在冰上孵育15分钟。将裂解物以1530 g离心10分钟，弃去液体部分。用低渗裂解缓冲液洗涤沉淀的核一次，然后重悬于高渗缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.9，0.4 M NaCl，1 mM EDTA，1 mM EGTA，0.6％NP-40和cOmplete蛋白酶抑制剂（Roche）中），在4°C下用DNase I（AM2238，Thermo Fisher Scientific）消化45分钟，然后在13,800 g下于4°C离心10分钟。用IP缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.9，0.2 M NaCl，cOmplete蛋白酶抑制剂（Roche））将核裂解液稀释2倍，然后通过Protein-G磁珠在4°C旋转下预清1 h。然后将上清液与IgG（sc-2027，Santa Cruz）或特异性抗体（hnRNPL（ARP40368_P050，Aviva Systems Biology），CCNT1（sc-10750，Santa Cruz））孵育过夜，并在4°C下旋转，然后孵育与Protein-G磁珠一起在2°C下旋转2小时。然后将免疫复合物用IP缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.9，0.2 M NaCl，0.3％NP-40，cOpleplete蛋白酶抑制剂（Roche））洗涤五次。然后将结合的蛋白在样品缓冲液（62.5 mM Tris，pH 6.8，10％甘油，2％SDS，5％β-巯基乙醇和溴酚蓝）中洗脱，并进行蛋白质印迹分析。然后与Protein-G磁珠一起孵育4小时，并在4°C下旋转。然后将免疫复合物用IP缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.9，0.2 M NaCl，0.3％NP-40，cOpleplete蛋白酶抑制剂（Roche））洗涤五次。然后将结合的蛋白在样品缓冲液（62.5 mM Tris，pH 6.8，10％甘油，2％SDS，5％β-巯基乙醇和溴酚蓝）中洗脱，并进行蛋白质印迹分析。然后与Protein-G磁珠一起孵育4小时，并在4°C下旋转。然后将免疫复合物用IP缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.9，0.2 M NaCl，0.3％NP-40，cOpleplete蛋白酶抑制剂（Roche））洗涤五次。然后将结合的蛋白在样品缓冲液（62.5 mM Tris，pH 6.8，10％甘油，2％SDS，5％β-巯基乙醇和溴酚蓝）中洗脱，并进行蛋白质印迹分析。
过滤掉低质量的读数，并使用Trimmomatic-0.36 58从原始读数中修剪衔接子序列。然后使用Bowtie2（版本2.2.4）将其余的读数与小鼠基因组（mm9）对齐。如果多个读数与同一基因组位置对齐，则每个位置仅保留一个读数用于下游分析。使用HOMER（版本v4.4）从头开始在整个基因组中鉴定出初级转录本。根据Zhao等人的方法，在MB和MT中定义推定的eRNA。59，与蛋白质编码基因，反义转录物，差异转录物和其他基因区域（rRNA，snRNA，miRNA，snoRNA等）重叠的转录物被过滤，如果其余的转录物从头确定了转录起始位点，则将其定义为推定的eRNA（ TSS）位于超级增强器或典型增强器区域。为了确定差异表达的转录本，使用HOMER计算每个GRO-seq实验中每个转录本的标准化链特异性阅读计数。然后使用EdgeR确定差异表达（>两倍变化，FDR <0.05）。
将衔接子和低质量序列从3'端修剪到5'端。丢弃短于36 bp的读数，并使用TopHat（v2.0.13）将其余读数映射到小鼠基因组（mm9）。然后应用袖扣（v2.1.1）来评估笔录的数量。丰度以千基千百万碎片（FPKM）报告。如果表达水平的变化超过倍数变化阈值（> 1.5），则鉴定出差异表达的基因。如21所述，使用rRNA耗尽的RNA-seq数据从头开始转录组的组装，从而获得MB和MT中的新型lncRNA。为了在成肌过程中定义seRNA和teRNA，从以前的报告中检索了MB和MT中的超级增强子（SE）和典型增强子（TE）的基因组坐标6。如果lncRNA分别来自SE或TE，则定义了seRNA或teRNA。
简而言之，使用带有默认参数的Bowtie2，将从ENCODE和GEO下载的原始读取与小鼠基因组（mm9）对齐。ChIP-seq密度（强度或信号）计算为归一化为区域长度和总可映射读计数的合计读计数，从而得出RPKM（每千碱基对每百万个映射读的读数）作为测量单位。
ChIP-seq，GRO-seq和CLIP-seq的数据可视化是通过使用HOMER软件包将自定义轨道组织到UCSC基因组浏览器上进行的。将每个实验的可映射总读数归一化为“每百万读数（RPM）”，以方便不同轨道之间的比较。同时，seRNA，超级增强子，典型增强子也作为曲目上传到UCSC基因组浏览器以进行可视化。所有热图和读取的密度图均由ngsplot 60和R封装生成。
使用Vienna RNAfold服务器（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）进行最小自由能（MFE）结构分析。
使用GraphPad Prism（版本8； GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚）分析数据。数据表示为平均值±标准差（SD）。所有测试均为双面测试，P < 0.05被认为具有统计学意义。
有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的《 自然研究报告摘要》。
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