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培养细胞免疫荧光成功秘诀(二)

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发表时间:2019-06-11 11:53作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

培养细胞免疫荧光成功秘诀

有机溶剂包括甲醇和丙酮。当然,如果细胞固定是使用有机溶剂进行的,渗透不需要作为额外的步骤。下图显示了渗透的有效性。

抗体种类繁多。一些只与它们靶向的分子的微小区域结合,例如单克隆抗体和肽特异性抗体。这些是通过将细胞仅暴露于非常大分子的小区域而产生的。有许多这种类型的商业抗体,但并非所有抗体都这样做。

一些是由包含整个蛋白质的抗原产生的。这些是多价抗体,包括源自许多免疫细胞克隆的多种抗体的混合物,每种抗体对整个大抗原的一小部分具有特异性,如图3所示。

一般来说,抗体的多价性增加了其亲和力,这种抗体在抗体定位研究以及免疫沉淀和免疫印迹中特别重要。然而,经验表明,单克隆抗体和肽特异性抗体也有其独特的位置。

当抗体对整个蛋白质起反应时,它仍然可以选择性地对整个分子的一部分起反应。例如四聚异二聚体,由四个不同种类的单元组成的分子。在这种情况下,这种大分子的两个亚基可能不是多价抗体识别的组分。

与高亲和力的单个表位反应的抗体也用于检测磷酸化位点、O - GlcNAc修饰和一些具有特定构象的表位。

因此,如果目的是鉴定给定蛋白质并研究其功能状态,那么多价和单表位抗体最好结合使用。

当抗体或细胞经受免疫染色程序时,可能由于方案而不是细胞或抗体的任何性质而发生故障。特别是当研究细胞表面抗原时,严格的方案很有效。

但当抗原在细胞内时,通常需要使用大得多的抗体分子检测细胞内部细胞结构上的小分子。这需要渗透或产生足够大的细胞膜孔,以便抗体渗透到内部,同时尽可能充分地注意防止由于这些分子在细胞内的存在而产生的不利影响。

因此,单一尺寸的溶液不能用于细胞内抗原靶的免疫染色,当感兴趣的蛋白质第一次染色时,这是更明显的挑战。最好是用手头的不同方法进行实验,发现它们各自的局限性和优势。


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