培养细胞免疫荧光成功秘诀
免疫染色是一项复杂的技术，并且受到若干技术障碍的影响，这可能意味着经过大量时间和努力，结果要么是没有信号，要么是无法解释的信号，而不是一组清晰明确的图像。但即使这样也不是最坏的情况。
成功建立免疫染色试验的第一步是使用正确的缓冲液。抗体蛋白是复杂的分子，设计用于血液中，含有高钠离子浓度。这就是为什么强烈推荐磷酸盐缓冲盐水( PBS )染色细胞表面的原因。然而，由于细胞内部主要是钾离子的存在，所以尽可能接近这些条件是很重要的。
这就是缓冲体系变得如此重要的地方，因为毕竟，它是在细胞培养时使用的，也是在进行固定和透化后的细胞洗涤过程中使用的。它的存在可以在很大程度上改变信号的强度。
一些缓冲液用于未固定但已透化的细胞，并用于测定功能。这些包括PHEM和CSK。另一方面，在对已经进行固定和透化的细胞进行分析时，尤其是在处理存在于细胞骨架或细胞质中的抗原时，这些可以取代PBS。
当考虑信号强度时，经验告诉我们，当PHEM用作缓冲液而不是PBS时，大约10 %的细胞抗原的染色显著改善，而50 %显示中度增强，30 %没有显示任何显著差异。
最后10 %显示PBS染色比PHEM好得多。因此，在对首次使用的抗体进行免疫染色时，同时使用PBS和PHEM是明智的。成功的免疫染色实验要求抗原抗体组合与正确的固定剂配对。免疫染色方案需要正确的缓冲液，正如已经讨论过的，但是在进行温育和洗涤时，细胞也必须保持尽可能原始的状态。
在这方面，固定是至关重要的一步，因为尽可能保持细胞结构完整是至关重要的。完成后，染色方案的其余部分可以进行，而不必担心损伤细胞，特别是靶蛋白。然而，抗原位点被固定破坏，这意味着即使同一固定剂对其中一种表现出优异的效果，它也不能保持所有抗原-抗体组合处于良好的工作状态。
如果一种新蛋白质被染色，特别是如果它的位置有些不确定，或者如果所使用的抗体是不熟悉的，那么固定剂-缓冲液组合应该改变几次，以确定哪种组合将提供抗体结合的最佳混合物，同时结构破坏最小。
醛固定剂通常是甲醛或戊二醛，它在细胞骨架蛋白和其他成分之间产生交联。这使得膜结合抗原和细胞骨架上的抗原可以双重标记，是这种情况下的首选。
缺点是它在能够破坏抗原的蛋白质中诱导化学变化。细胞固定通常与抗原破坏无关，因为在大多数情况下，它是通过使用2 - 4 %多聚甲醛10 - 20分钟来完成的。问题是醛的固定只能通过将组织长时间暴露在化学物质中来完成，这导致蛋白质结构的改变。
这就是为什么总是建议细胞和组织的固定时间应该尽可能短。另一个潜在的障碍是在使用醛进行固定后，通过胺和蛋白质反应产生荧光产物而产生自发荧光。这意味着需要一个称为淬火的附加步骤。
有机溶剂包括甲醇、乙醇和丙酮。它们不通过共价反应与目的蛋白质反应，而是使溶解的蛋白质沉淀，保持蛋白质壳完整，但降低蛋白质的溶解度，从而使细胞变平。
这里的问题是，进入线粒体和细胞核变得更加困难，同时也去除了与(未受保护的)脂质相关的蛋白质。然而，在某些情况下，这是有益的，因为一些抗体只与隐藏在蛋白质结构内部的抗原结合。这方面的一个重要例子是与单个表位结合的单克隆抗体。建议保存细胞并染色细胞骨架结构。
甲醛、多聚甲醛和福尔马林经常相互误解。其中最简单的醛是甲醛CH2O。多聚甲醛是由甲醛聚合而成，可作为粉末使用，必须在通风柜中加热至溶解点。
多聚甲醛溶液进入细胞需要相当长的时间，渗透进行得太慢，抗体无法渗透到细胞内部。这意味着还需要渗透步骤。
福尔马林是由37 %甲醛和10 - 15 %甲醇组成的液体，以抑制多聚甲醛的形成。甲醇的存在是不容忽视的，因为它本身就是一种有机溶剂。
因此，如果方案包括使用10 %福尔马林，应该注意，这相当于使用4 %甲醛和足够的甲醇以引起部分透化。然而，如果不将细胞长期暴露于福尔马林中，则不能预测持续的通透性。为什么需要细胞固定？毕竟，已知会对某些抗原造成损伤或掩蔽某些抗原，这意味着免疫染色后的信号强度将会降低。因此，可以对方案进行一些修改，例如在固定前添加抗体，或者完全取消固定步骤。如图1.1所示，当试图对暴露的细胞表面蛋白质染色时，这一点尤其重要。
在这种情况下，应该将抗体添加到培养基中，只是为了验证表面上目标抗原的存在。但是，每一步都应该小心，记住细胞表面有许多分子在任何给定时间进入细胞，或者如果发生交联，这些分子将进入细胞内部。当将具有两个结合位点的抗体加入到溶液中时，这是很有可能的。影响这一步骤的另一个因素是，参与细胞间粘附的一些抗原在被抗体结合后可能受到功能损害。
通常是使用福尔马林或甲醛作为固定剂的几种方案的一部分。这可以使用洗涤剂或有机溶剂来完成。如果第一种是优选的，则选择温和至中等洗涤剂、皂苷或洋地黄黄酮、0.1 - 0.5 % Triton - X100和NP40。
|
|
