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含羟基的小分子蛋白的交联

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发表时间:2019-06-05 15:43作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

含羟基的小分子蛋白的交联


     这一类小分子包括糖、核苷酸、酚和醇,一般不能直接用于与蛋白的结合。将醇转变成琥珀酸半酯(半琥珀酸盐)则衍生了一个可用于结合的羧基,这种方法已用于许多小分子与蛋白的耦联。此外,双功能试剂葵二酰二氯(sebacoyldichloride)可将醇转变成氯酸,氯酸在pH8.5时,很容易与蛋白发生耦联反应。武汉新启迪生物科技有限公司部分小分子种类试剂采用此方法制备。


    1.醇羟基通过半琥珀酸盐的形成而转变成羧基

    目的:使含羟基的醇易于与蛋白耦联。

    操作步骤:

    (1)将15g 2,2,2—三氯乙醇(trichloroethan01)、12g琥珀酸酐(succinic anhydride)和8.7ml三乙胺(triethylamine)溶于100 ml乙酸乙酯;

    (2)加热及回流1h;

    (3)蒸发溶剂,用5%Na2C03水溶液溶解残渣;

    (4)用乙醚洗2次,然后再用H:S04调pH至2.0;

    (5)用水洗最后的固体(2,2,2—三氯乙酰半琥珀酸盐)2次,然后从氯仿—己烷中重结晶(产率约为75%,熔点88~900C):

    (6)加2.5g半琥珀酸盐至6.5 ml亚硫酰氯(thionylchloride)中,65~C加热30min;

    (7)真空蒸发至干,置残渣于高真空下1 h;

    (8)用15 m1N,N—二甲基乙酰胺溶解固体(2,2,2—三氯乙酰琥珀酰氯),与2.79g小分子的羟基,即1—p—D-arabinofuranofuranosylcytosine的5,—OH反应,室温搅拌2 h;

    (9)65~C毒真空下蒸发,再从异丙醇中重结晶(产率:约84%的结晶5,酯以盐酸盐形式存在,熔点1600C);

    (10)为得到小分子—半琥珀酸盐,用溶于DMF的锌和醋酸裂解三氯乙酯,因此,衍生的羧基可使用诸如碳二亚胺的方法结合于蛋白上。

    酚则可用重氮化的对氨基苯酸活化,于是对氨基苯酸可引入一个羧基,然后再通过混合酸酐的反应耦联载体蛋白或酶分子。

    糖可通过Landsteiner方法活化,形成一种对硝基苯葡萄糖苷,接着硝基还原,重氮化后形成结合。还有一个简单的方法是将糖的邻近乙二醇氧化裂解成醛基,醛基然后通过还原性烷基取代而结合至氨基上。这种方法已成功地用于核苷、核苷酸和地高辛与蛋白的耦联。

    2.使用NaIO4‘氧化糖类小分子邻近乙二醇而耦联腺苷与—半乳糖苷酶

    目的:使糖类小分子能与蛋白耦联。

    操作步骤:

    (1)溶解20 mg腺苷(adenosine)于1 m1 100 mmol/LNal04溶液中,4~C暗处反应30rain;

    (2)加1滴乙二醇;

    (3)将氧化好的腺苷加至p—半乳糖苷酶溶液(20 mg/m1 150mmol/L NaCl和10 mmol/L MgCl2,用K2C03调pH至9.0)中;

    (4)40C反应2 h,保持pH 9.0;

    (5)加入1/10体积的新鲜制备的NaBH,(50mg/m1),40C反应过夜;

    (6)用含10mmol/LMgCl2,10mmol/L 2—ME和10mmol/LNaCi的50mmol/LPB(pH7.4)缓冲液透析。


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