摘要
Npl4可能是识别酵母中蛋白酶体降解途径中Lys48连接的多泛素化底物的最上游因素。Npl4与Ufd1一起形成异二聚体（UN），并充当Cdc48 ATPase的辅因子。在这里，我们报告与Lys48连接的双泛素和Ufd1的Npl4结合基序复杂的酵母Npl4的晶体结构。Lys48连接的泛素的远端和近端泛素部分分别主要与Npl4 C末端域（CTD）的C末端螺旋和N末端环相互作用。突变分析表明，CTD有助于连接选择性和泛素链的初始结合。Ufd1占据Npl4的Mpr1 / Pad1 N端（MPN）域的疏水槽，它对应于JAB1 / MPN / Mov34金属酶（JAMM）家族去泛素化酶的MPN域的催化槽。这项研究为Cdc48–UN复合物及其组装对多聚泛素链识别提供了重要的结构见解。
泛素（UB）是从酵母保守到哺乳动物的重要的翻译后修饰1，2，3。通常，Ub的C端甘氨酸残基与底物蛋白的赖氨酸残基共价连接。Ub本身也是泛素化的底物，并形成共价连接的Ub链。通过Lys48（K48链）连接的泛素链是蛋白酶体降解的主要靶向信号1，2，3，4，5。分离的泛素化蛋白可以是蛋白酶体的直接靶标，而嵌入膜中或组装成多亚基复合物的蛋白则需要借助保守的AAA家族ATPase Cdc48（酵母）或p97 / VCP（metazoan）进行提取或分离。其辅因子复合物，Ufd1-NPL4（UN），之前的蛋白酶体降解6，7，8，9，10，11。Cdc48 / p97 ATPase的细胞功能或定位受许多辅助因子控制。联合国异二聚体是最佳表征的辅因子之一12，13，14，15。
Cdc48 / p97 ATPase由一个N端（N）域和两个ATPase域（D1和D2）组成。D1和D2形成具有中心孔16的六聚双环。相对于D1-D2环的N结构域的构象与D1的核苷酸状态偶联；N结构域位于ATP状态（向上构象）的D1环的上方，并且是共面的与所述ADP状态D1环（向下构象）17，18，19，20，21。另外，D1和D2环之间的相对旋转是在ATP与D2结合时发生的。尽管了解伴随Ub链结合和ATP水解的底物易位机制一直是一个长期存在的问题，但最近的结构和功能研究为Cdc48 / p97-UN复合物的反应步骤提供了重要的力学见解22。在最初的步骤15中，UN异二聚体捕获与底物连接的Ub链。
Npl4负责识别连接有底物的Ub链，因此可能介导与Ub链相关的反应步骤15。哺乳动物Npl4（也称为NPLOC4）由Ubx样（UBXL）域，锌指结构域（以前称为zf-Npl4），Mpr1 / Pad1 N末端（MPN）域，C末端域（CTD）组成）和NZF域。哺乳动物Npl4结合Ub链而没有通过NZF域的连接特异性。在另一方面，酵母NPL4缺乏NZF域，并结合通过ZF-NPL4-MPN-CTD具体地K48链15，23，24。Npl4的MPN结构域在拓扑上类似于JAB1 / MPN / Mov34金属酶（JAMM）-家族去泛素化酶（DUB）的催化结构域19，可容纳Ub的C末端尾巴。因此，对应于JAMM DUB的催化位点的槽25，26已经被提出作为NPL4的电位UB-结合位点。但是，最近对以3.9Å分辨率与底物结合的Cdc48–UN复合物进行的冷冻-EM分析表明，底物上的K48链与yNpl4 MPN的凹槽不相互作用，而与CTD和MPN 22的其他区域相互作用。然而，由于低的地方的分辨率，用于Ufd1密度没有与原子模型和NPL4之间的相互作用解释和两个折叠部分泛素尚未详细表征22。
在这里，我们介绍了酵母Npl4（zf-Npl4-MPN-CTD）的晶体结构，分别与Lys48连接的双泛素（K48-Ub 2）和Ufd1分别具有2.55和1.58Å的分辨率。晶体结构显示K48-Ub 2的远端和近端Ub（分别为Ub dist和Ub prox）部分分别与Npl4 CTD的C末端螺旋和N末端环（N环）相互作用，并且Ufd1结合到Npl4的对应于JAMM催化槽的槽。体外和体内突变分析证实，Npl4 MPN沟是结合Ufd1而不是K48链所必需的。同样，旨在破坏Ub结合的Npl4突变体显示，Npl4 C末端螺旋和Ub之间的相互作用对于Ub链结合和Cdc48–UN复合物的ATPase活性刺激至关重要。此外，我们揭示了Npl4的近端Ub结合位点上的突变会影响其连锁特异性。我们的晶体学和生化研究为了解Cdc48 / p97-UN复合物的反应机理提供了重要的见解。
包含酿酒酵母 Npl4的残基113-580的区域（yNpl4 113-580，前缀“ y”表示酿酒酵母蛋白）在体外可特异性识别K48链（图 1）15。引入了三重E123A K124A E125A突变，以减少过量的表面构象熵27。yNpl4 113–580（E123A K124A E125A）蛋白产生了高质量的晶体，并使用锌边缘通过单波长异常衍射（SAD）方法以1.72Å的分辨率确定了其结构（表 1）。我们还尝试结晶yNpl4 113–580与K48链条配合使用。尽管测试了K48-Ub 2，K48-Ub 3，K48-Ub 4和K48-Ub 5的结晶，但只有K48-Ub 2与yNpl4 113-580成功共结晶。最终，我们确定了以2.55Å 分辨率与硒代蛋氨酸（SeMet）标记的K48-Ub 2配合的yNpl4 113–580的晶体结构（图 2a和表 1）。结构是通过分子置换法确定的，仅使用yNpl4 113–580作为搜索模型。尽管使用Ub（PDB 1UBQ [https://doi.org/10.2210/pdb1ubq/pdb ]）28作为搜索模型是不成功的，我们发现对应于K48-UB残余电子密度2和手动内置K48-UB的模型2。最终模型在不对称单元中包含一个yNpl4 113–580 –K48-Ub 2复合物和一个分离的yNpl4 113–580分子。我们在这里注意到，K48-Ub 2的电子密度很弱，尤其是Ub prox（补充图 1a）。泛素的yNpl4相互作用部分的电子密度PROX被观察到的，而泛素的溶剂暴露的部分PROX被遮盖（补充图 1a，b）。为了确认泛素的位置DIST和UB PROX，我们替换Pro19 Val26或UB的Ile30与蛋氨酸和在yNpl4中计算出的异常的差值Fourier图113-580 -K48-UB 2复合物（补充图 1C）。尽管来自蛋氨酸衍生的一些信号是难以区分的或没有检测到，我们发现从SeMet1，SeMet19，和泛素SeMet26中得到的信号DIST和SeMet1，SeMet26，和泛素SeMet30 PROX。
yNpl4的zf-Npl4，MPN和CTD子域分别是紫色，深黄色和灰色。yNpl4的ZF1和ZF2用黄色星号表示。Ufd1的NBM地区是青绿色。Cdc48的N，D1和D2域分别是品红色，橙色和黄色。
yNpl4-K48-Ub 2复合物的两个方向的总体结构。b yNpl4和K48-Ub 2之间相互作用的特写视图。氢键显示为黑色虚线。c K24-Ub 2异肽键周围区域的特写视图。A 2 ˚F ø - ˚F Ç复合省略图被示出为在橄榄1级网眼轮廓σ水平。d通过下拉分析分析K48链与包含野生型或突变GST-yNpl4的Cdc48–UN复合物之间的结合。通过用抗Ub抗体免疫印迹检测结合的K48链（上图）。印迹膜用丽春红S染色（下图）。总之，输入的20％表示与GST-yNpl4结合的谷胱甘肽树脂混合的样品（K48链，Cdc48和yUfd1）的体积的20％。星号表示污染。用不同的样品重复该实验（补充图 3a）。源数据作为源数据文件提供。e含有或不含K48-Ub n的含有野生型或突变yNpl4的Cdc48–UN复合物的ATP水解速率-GFP。将速率标准化为不具有K48-Ub n -GFP 的野生型Cdc48-UN复合物的ATP水解速率的平均值。该线代表归一化后速率的平均值（平均值，n = 10个独立实验； * P < 0.05； ** P < 0.01； *** P < 0.001，来自Tukey检验）。
该yNpl4 113-580结构由三个子域，ZF-NPL4，MPN和CTD，NPL4的先前报告的结构类似于19，22。yNpl4 MPN子域由MPN核心和两个插入片段Ins-1（残基287-317）和Ins-2（残基403-462）组成，与其他MPN DUB相似。泛素DIST部分接触yNpl4的CTD子站点460埃的埋表面积2（图 2B）。泛素PROX部分接触yNpl4的CTD和MPN子域具有468埃的埋表面积2。尽管电子密度对应于Ub dist的C端五个残基（Arg-Leu-Arg-Gly-Gly）和UB的Lys48的侧链PROX是看不见的（图 2C），泛素Leu71之间的Cα-Cα距离DIST以及Lys48泛素的PROX（11 A）是那些在K48链先前报道的晶体结构的范围内与其特定的效应子（SARS PLpro 29，AIRAPL 30和Mindy-1 31；9-20Å）形成复合物。此外，我们通过SDS-PAGE 检查了yNpl4-K48-Ub 2晶体（补充图 1d），并确认K48-Ub 2的键合保留在晶体中。因此，我们得出结论，异肽键连接Ub dist和Ub prox在目前的yNpl4-K48-Ub 2结构中。仅在yNpl4 113–580和yNpl4 113–580 –K48-Ub 2之间没有观察到大的构象差异，除了在Ins-1中包含残基290–300的区域，其构象受晶体堆积限制（补充图 2a）。 。
K48-Ub 2的 Ub dist主要与yNpl4 CTD的C末端螺旋相互作用（图 2b）。Met574和Ile575形成疏水表面，与Ub dist的以Ile44为中心的疏水膜相互作用。疏水相互作用通过yNpl4的Thr571与Ub dist中的Ala46和Gly47的主链NH基团之间的氢键进一步稳定。与C末端螺旋介导的相互作用相邻，yNpl4的Tyr501和Ile538突入由Ub dist的 Leu8，His68和Val70形成的疏水口袋中。为了评估这些相互作用在Npl4识别Ub链中的作用，我们通过表面等离子体共振（SPR）光谱检查了yNpl4的T571A，M574A，M574Q和I575A突变体与K48链的结合（表 2）。使用K48-Ub 4进行突变yNpl4的SPR分析，因为对K48-Ub 2的亲和力太低，无法分析。较长链泛素结合到其与一般的更高的亲和力效应30，32，33。yNpl4的T571A突变113-580为K48-UB降低的亲和力4至5.0野生型亲和力％（表 2）。yNpl4的I575A突变113–580将亲和力降低到无法衡量的水平。yNpl4的M574A突变113-580有微弱的作用和对K48-UB的亲和性降低4到野生型的亲和力的43％。另一方面，M574Q突变比M574A突变具有更大的作用，并且对K48-Ub 4的亲和力降低至野生型亲和力的9.1％。这可能是因为Gln的亲水性侧链抑制了yNpl4 113–580和Ub dist之间的疏水相互作用。我们进一步分析了yNpl4 113–580突变体与K63-或M1-Ub 4之间的亲和力。T571A，M574A，M574Q或I575A突变降低了对K63-或M1-Ub 4的亲和力达到不可衡量的水平（表 2）。这些结果表明，yNpl4–Ub dist接口主要是对Ub链的亲和力而非连锁特异性。
接下来，通过GST下拉分析法分析了Cdc48–UN复合物与K48链之间的结合。将GST-yNpl4突变体固定在谷胱甘肽珠上，并与Cdc48，yUfd1和K48链一起孵育。洗涤后，将结合的蛋白用LDS上样缓冲液洗脱，并用抗Ub抗体进行免疫印迹分析（图 2d和补充图 3a）。在该分析中，yUfd1或Cdc48对与K48链的结合影响很小，并且本研究中检测到的yNpl4突变不影响UN或Cdc48-UN复合物的形成。另一方面，T571A，M574Q或I575A突变对K48-Ub 4产生了严重影响结合，完全废除了Cdc48–UN对K48链的结合。对K48-Ub 4的亲和力有轻微影响的M574A突变并未完全消除结合。使用GST-yUfd1代替GST-yNpl4进行的相似的GST下拉试验显示出一致的结果（补充图 3b）。为进一步评估体内yNpl4–Ub dist相互作用的功能意义，突变yNpl4-3xFLAG在其自身的启动子下在npl4Δ细胞中表达。用抗FLAG抗体免疫沉淀yNpl4-3xFLAG，用抗K48链抗体分析Lys48连接的多泛素化蛋白的共免疫沉淀（补充图 3c）。与体外结合测定的结果一致，T571A，M574Q或I575A突变减少了共免疫沉淀的Lys48连接的polyUb共轭物的量，尽管这些突变对Cdc48结合的影响很小。
以往的研究表明Ufd1结合到K48链通过其UT3域24，34。但是，我们的下拉分析未能检测到yUfd1与K48链的结合（补充图 3b）。接下来，我们通过GST下拉分析法分析了GST-yNpl4和K48链之间对yUfd1浓度增加的结合，但未观察到实质性影响（补充图 3d）。使用纯化的yUfd1-yNpl4 113-580复合物和K48-Ub 4的 SPR分析还显示yUfd1的存在对yNpl4对K48-Ub 4的亲和力影响很小（表 2）。虽然ķ dpolyUb的yUfd1值尚未估算，monoUb的yUfd1估算值在1-2 mM 34范围内。该值远高于针对K48-Ub 2或K48-Ub 4的yNpl4 的K d值（表 2），表明yUfd1对K48链的亲和力远低于对yNpl4的亲和力。总的来说，这些体外和体内结果表明，yNpl4的C末端螺旋是Cdc48–UN复合物识别Ub链的关键决定因素。
UB PROX K48-UB的2主要与yNpl4 CTD（残基493-501）（图的N环相互作用 图2b）。yNpl4 CTD相互作用的N-环与由Leu8，Ile44，和泛素Val70形成的疏水补丁PROX。yNpl4的Ser498形成与泛素Arg42氢键PROX。在yNpl4主链CO基Gln493的形成与在泛素的主链NH基Leu71的氢键PROX。通过使用His 6 -yNpl4 113-580的A494F，S498L和S498R突变体进行SPR分析，证实了这些相互作用的功能重要性（表 2）。yNpl4的S498L突变对K48-，K63-和M1-Ub 4的亲和力几乎没有影响，而yNpl4的S498R突变将对K48-Ub 4的亲和力降低至野生型亲和力的36％（表 2）。这些结果表明，yNpl4 CTD的N环为泛素的结合位点PROX，虽然N个循环到K48-UB的贡献4结合比C端螺旋的小。这反映，差距在yNpl4和UB之间的界面发现PROX。其中的差距所在yNpl4的Ala494和UB的Leu8之间PROX。yNpl4中Ala494的Phe替代增加了yNpl4对K48-Ub 4的亲和力2.2倍（表 2）。苯丙氨酸的庞大侧链可能填补了缺口并增加了亲和力。yNpl4 CTD在泛素的N个循环的参与PROX识别通过使用CDC48-UN复杂含有GST-yNpl4突变体GST pulldown测定进一步支持：yNpl4的A494F突变增强了CDC48-UN和K48链之间的结合，而S498R突变降低了它（图 2d）。即使当GST标签融合到Ufd1而不是Npl4时，也获得了相似的结果（补充图 3b）。
与对K48-Ub 4的亲和力相比，S498R或A494F突变几乎不影响对K63-或M1-Ub 4的亲和力，从而改变了连接特异性（以解离常数的倒数比表示；表 2）。野生型yNpl4对K48-Ub 4的亲和力分别比对K63-或M1-Ub 4的亲和力高11和15倍。yNpl4的S498R突变降低了连接特异性。相反，yNpl4的A494F突变体增加了连接特异性，因为该突变体增加了对K48-Ub 4的亲和力，但几乎不影响对K63-或M1-Ub 4的亲和力（表 2）。这些结果表明，泛素之间的相互作用PROX和yNpl4 CTD的N环有助于yNpl4的特异性K48链。
Lys48联polyubiquitylated GFP（K48-UB Ñ -GFP）已被用作，能刺激CDC48-UN复合物的ATP水解的模型基板13，14。为了评估与Cdc48–UN复合物中K48链的结合与ATP水解之间的耦合，我们分析了含有突变yNpl4的Cdc48–UN复合物对ATP水解的速率。根据yNpl4对K48链的亲和力，添加K48-Ub n -GFP可以提高Cdc48-UN复合物的ATP水解速率（图 2e和补充图 3e）。例如，K48-Ub n-GFP将Cdc48–UN复合物的ATP水解速率提高了约5倍。yNpl4-Ub dist界面的T571A，M574Q或I575A突变会严重降低与K48链的亲和力，从而降低ATP的水解速率。在yNpl4-UB的S498R突变PROX接口，其示出了在亲和温和的效果，也比T571A，M574Q，或I575A突变降低了ATP酶水解速率，但以下。这些结果表明，刺激Cdc48–UN复合物的ATPase活性需要yNpl4 CTD与K48链的结合活性。
即使没有Cdc48 / p97或多泛素化的底物，Npl4和Ufd1也可以形成异二聚体。尽管人Ufd1的残基258-275（hUfd1 258-275，带前缀“ h”表示人类蛋白），但Ufd1-Npl4相互作用的机制仍不清楚，相当于yUfd的残基288-305（yUfd1 288-305）。 ）已被指定为Npl4-结合基序（NBM）（图 1）35。确实，使用FlAsH标记的yUfd1 288-305进行的基于荧光各向异性的亲和力测量显示yUfd1 288-305与yNpl4结合，K d为85.7 nM（表 3）。）。为了进一步揭示Npl4与Ufd1之间相互作用的结构基础，我们确定了yNpl4 113–580（E123A K124A E125A）与yUfd1 288–305的复合物的晶体结构（图 3a，b和表 1）。结构是通过分子置换法确定的，仅使用yNpl4 113–580作为搜索模型。在晶体中，yNpl4 113-580与yUfd1 288-305形成了化学计量的配合物。yNpl4之间没有观察到大的构象差异113-580单独和yUfd1 288-305结合的yNpl4 113-580（补充图 2B）。
yNpl4–yUfd1复合体的两个方向的总体结构。b yNpl4和yUfd1之间相互作用的特写视图。氢键显示为黑色虚线。c Ufd1的NBM区的序列比对。序列上方显示了yNpl4–yUfd1结构中NBM区中β链的位置。d的yNpl4-yUfd1的MPN区域的比较和Rpn8-Rpn11-UB（PDB 5U4P [ https://doi.org/10.2210/pdb5u4p/pdb ]）25种复合物。yNpl4–yUfd1复合体的着色方案与图 3a相同。Rpn8–Rpn11–Ub复合体的Rpn8，Rpn11和Ub分别为蓝色，橙色和粉红色。氢键显示为黑色虚线。e，f通过下拉分析分析GST-yNpl4和yUfd1单独（e）或yUfd1-Cdc48（f）之间的结合。显示了yNpl4的三重突变体（L296A L353A Y424）（左）或yUfd1的三重突变体（G297R L299A F301A）（右）的结果。总之，输入的20％表示与GST-yNpl4结合的谷胱甘肽树脂混合的样品（yUfd1和/或Cdc48）的体积的20％。星号表示污染。通过SDS-PAGE分析结合的蛋白质，并用考马斯亮蓝染色。源数据作为源数据文件提供。
在复合物中，yUfd1 NBM的残基298-300与yNpl4的Ins-1形成一个β-折叠（图 3c，d）。yNpl4的Leu296，Phe326，Leu353，Met357，Phe419，Pro420和Tyr424形成疏水凹槽，以容纳yUfd1的Pro289，Leu292，Leu294，Gly297，Leu299，Phe301，Phe303和Met305。通过基于荧光各向异性的结合分析检查了除yNpl4的Pro420和yUfd1的Pro289以外的所有这些残基的突变（表 3）。yNpl4的Leu296，Leu353或Tyr424或yUfd1的Leu292，Gly297，Leu299或Phe301的突变严重影响yUfd1 288-305和yNpl4 113-580之间的亲和力。阿拉置换Leu292，Leu299，或Phe301在yUfd1 288-305降低了亲和力至野生型亲和力的1.6％，0.68％或0.41％。yUfd1 288-305的Gly297的Leu，Arg或Tyr替代将对yNpl4 113-580的亲和力分别降低至野生型亲和力的14、0.41或4.0％。Gly297的主链二面角分别为90.1°和-8.5°。蛋白质结构验证的标准程序MolProbity 36将这些角度判断为Gly的偏爱角度，但将其视为非Gly / Pro残基的允许角度。Gly比残基297处的非Gly / Pro残基更有利。yUfd1 NBM在Gly297处扭结，从而适合yNpl4的MPN子域中的疏水性凹槽（图 3b））。yUfd1的Gly297和Phe301从酵母到人都是保守的，而yUfd1的Leu299被其他真核生物中功能上等效的疏水残基取代（图 3c）。尽管Ufd1 NBM的序列在真核生物之间是可变的，但该GxΦxF基序（x和Φ分别代表任何氨基酸和疏水性氨基酸）都非常保守，反映了其功能重要性（图 3c）。yNpl4 113–580的Leu296，Phe326，Leu353或Tyr424的Ala替代将亲和力分别降低至野生型亲和力的1.2％，33％，6.2％或1.0％（表 3）。值得注意的是，yNpl4的Leu296，Phe326和Tyr424在hNpl4中是保守的（补充图 4）。）。yNpl4的Leu296和Phe326与yUfd1的Leu299和Phe301相互作用，它们分别占据GxΦxF基序的第三和第五个位置，而yNpl4的Tyr424疏水地与Ala290的主链CO基团和yUfd1的Lys291的Cα原子相互作用。这些疏水性相互作用可能从酵母到人都是保守的。除疏水相互作用外，yNpl4的Arg364和Thr418分别与yUfd1中的Glu296和Ala290的主链NH基团形成氢键。yUfd1的E296A突变288-305或yNpl4的R364A突变113-580的亲合性降低到20％或分别与野生型亲和力，27％（表 3）。这些残基在酵母和人之间不是保守的。Npl4和Ufd1之间的亲水相互作用在物种之间可能是可变的。
在JAMM家族的DUB的MPN域的催化槽容纳泛的用于切割的C-末端尾部25，26，37。在JAMM核中的第一个插入（即Ins-1）形成一个β-折叠，在催化槽中Ub的C末端为尾（图 3d）。Npl4是无酶活性的，但是具有Ins-1和类似于JAMM家族DUB 19的催化槽的槽。因此，已假定该凹槽和Ins-1形成了潜在的Ub链结合位点。然而，目前的yNpl4 113–580 –yUfd1 288–305结构显示，MPN域的凹槽可容纳yUfd1 NBM（图 3d）。所述NPL4结合yUfd1不重叠K48-UB 2在yNpl4-K48-UB 2络合物。一致地，yUfd1不会抑制K48链与yNpl4的结合（图 2d，补充图 3d）。此外，最近报道的与底物结合的Cdc48-UN的cryo-EM结构表明，结合的K48链和Ufd1不相互重叠。尽管Npl4和JAMM DUB的MPN域相似，但是Ins-1和凹槽的功能在它们之间是不同的。
为了分析Ufd1-Npl4相互作用与Cdc48-UN装配之间的关系，我们首先通过全长蛋白质的GST下拉实验筛选了有效抑制yUfd1和yNpl4相互作用的突变。尽管yNpl4或yUfd1的单点突变几乎不会影响yNpl4–yUfd1的相互作用（补充图 5a，b），但yNpl4（L296A L353A Y424A）或yUfd1（G297R L299A F301A）的三重突变分别完全抑制了联合国异二聚体的形成， （图 3e和补充图 5a，b）。三突变体yNpl4被证实与野生型yNpl4结合到K48链上（补充图 5c）。接下来，我们通过GST下拉实验分析了yNpl4或yUfd1突变对Cdc48-UN装配体的影响，发现yNpl4或yUfd1的三重突变体显着减少了Cdc48-UN复合物的形成（图 3f和补充图。 5d）。因此，尽管yNpl4和yUfd1都可以直接与Cdc48结合，但UN异二聚体的形成促进了Cdc48-UN的组装。
为了进一步评估Ufd1-Npl4体内相互作用的功能重要性，突变的Npl4-3xFLAG或Ufd1-3xFLAG分别在npl4Δ或ufd1Δ细胞中表达。我们检查了这些细胞中Ub共轭物在总细胞裂解物中的积累。所述npl4-1温度敏感型株还检查作为NPL4缺陷控制。在表达yNpl4或yUfd1单点突变体的细胞中，Ub缀合物的水平没有改变（补充图 5e）。相反，在表达yNpl4或yUfd1的三重突变体的细胞中，我们观察到Ub共轭物的大量积累，这与npl4-1细胞中的积累相当（补充图 5e））。相应地，这些表达三重突变体的细胞显示出对温度敏感的生长表型，尽管它比npl4-1表型温和（补充图 5f）。这些发现表明，Ufd1-Npl4相互作用对于Ub共轭物的降解和细胞生长很重要。
Npl4是从酵母到哺乳动物的高度保守的蛋白质。在哺乳动物Npl4中，位于其C末端的NZF域与K48链和与Lys63连接的Ub链（K63链）结合。缺少NZF域的人Npl4（hNpl4）突变体几乎不与Ub链结合15。在另一方面中，子囊菌和植物界 NPL4蛋白质缺乏在它们的C-末端（补充图的NZF域 6A，B）。来自酿酒酵母和嗜热链球菌的Npl4蛋白通过zf-Npl4-MPN-CTD域19与K48链结合。包括yNpl4和hNpl4的多个氨基酸序列比对显示Ub dist在CTD的C末端螺旋中的相互作用残基在酵母和人之间部分保守；yNpl4的Thr571是保守的，而yNpl4的Ile575被hNpl4中的Leu取代，其功能应等同于Ile（补充图 6a）。有趣的是，hNpl4的T551A突变（相当于yNpl4的Thr571）将其对K48-Ub 4的亲和力降低至野生型亲和力的58％（表 2）。另一方面，yNpl4的Met574在hNpl4中被Gln取代，在粟酒裂殖酵母中被 Ala取代。yNpl4的M574Q突变将其对K48-Ub 4的亲和力降低至野生型亲和力的9.1％，而M574A突变将其降低至仅43％（表 2））。相反，hNpl4的Q554M突变（相当于yNpl4的Met574）使对K48-Ub 4的亲和力增加了约两倍（表 2）。这些发现表明，hNpl4 CTD的C末端螺旋也与yNpl4 CTD的Ub链结合。
为了评估Ub链结合和Cdc48 ATPase活性下yNpl4 CTD和hNpl4 NZF之间的功能等效性，我们研究了yNpl4蛋白，其中hNpl4的NZF域（包括CTD和NZF域之间的连接子区域）为融合到全长yNpl4（yNpl4-NZF）的C末端，有或没有与Ub链结合不足的突变（T571A或I575A）。GST下拉分析表明，即使有T571A或I575A突变，yNpl4-NZF仍与K48和K63链结合，这表明NZF融合可以挽救CTD突变的Ub链结合缺陷（图 4a，b和补充图）。 。 6C）。接下来，我们分析了yNpl4-NZF蛋白是否支持Cdc48复合物的K48链依赖性ATPase活性（图 4c和补充图 6d）。NZF与野生型yNpl4的融合没有使ATPase活性高于野生型水平，这可能是因为野生型yNpl4对K48链的亲和力足以刺激Cdc48的全部ATPase活性。另一方面，NZF融合体完全恢复了由T571A或I575A突变引起的ATPase刺激的降低，这表明yNpl4 CTD和hNpl4 NZF在功能上是等效的。这也增加了ATP水解的增强不依赖于Lys48键特异性的可能性。但是，K63链不会刺激含有yNpl4-NZF的Cdc48–UN复合物的ATPase活性，该复合物可以与K63链以及K48链结合（图 4c）。）。因此，对Cdc48–UN复合物ATPase活性的刺激实际上取决于yNpl4的Lys48连锁特异性。考虑到yNpl4 CTD的Lys48-连接特异性对于刺激ATP水解是可有可无的，因此可以预期yNpl4，yUfd1和/或Cdc48除了Npl4 CTD之外还具有其他Lys48-linkage特异性识别位点。底物结合的Cdc48–UN的冷冻EM结构表明yNpl4 MPN与未折叠的Ub结合，后者在Ub 受体和Cdc48 22的中心孔之间架桥（补充图 6e）。这种结合可能与Cdc48的ATPase活性的K48链特异性刺激有关。
a，b通过下拉分析分析GST-hNpl4，GST-yNpl4或GST-yNpl4-NZF与K48链（a）或K63链（b）的结合。通过用抗Ub抗体进行免疫印迹检测结合的Ub链（上图）。印迹膜用丽春红S染色（下图）。输入20％表示与结合GST-yNpl4-或GST-yNpl4-NZF的谷胱甘肽树脂混合的样品（Ub链）体积的20％。用不同的样品重复这些实验（补充图 6c）。源数据作为源数据文件提供。c包含yNpl4或yNpl4-NZF和K48-Ub n -GFP或K63-Ub n的Cdc48–UN复合物的ATP水解速率-GFP。将速率标准化为没有Ub n -GFP 的野生型Cdc48-UN复合物的ATP水解速率的平均值。该线表示归一化后的速率的平均值（平均值；n ＝ 3个独立实验； * P ＜0.05，来自Student t-检验）。
在这项研究中，我们确定了yNpl4 113–580 –K48-Ub 2复合物的晶体结构。既泛DIST和UB PROX与yNpl4 CTD，这是一种新鉴定的泛素结合结构域（图交互 图5a）。yNpl4 CTD的C末端螺旋是yNpl4的主要Ub结合位点。在先前报道的Ub结合域（UBD）中，Ub相互作用基序（UIM），与Ub相互作用的基序（MIU）以及UIM和MIU相关的UBD（UMI）具有单个螺旋作为Ub结合位点。yNpl4 CTD，MIU和UMI但UIM相对于绑定的Ub显示相同的螺旋方向。因此，我们比较了yNpl4 CTD和RNF168 UMI的Ub结合螺旋（PDB 5XIS [ https://doi.org/10.2210/pdb5xis/pdb ]）38和Rabex5 MIU（PDB 2C7N [ https://doi.org/10.2210/pdb2c7n/pdb ]） 39（图 5b）。这些UBD具有一个N端亲水残基，用于与Ub的Ala46和Gly47的NH基团进行氢键键合，以及一个中央疏水残基，用于与Ub的Leu8，Ile44和Val70形成的疏水口袋相互作用（图 5b，c）。Ub结合螺旋中N末端亲水残基和中央疏水残基的差异会影响其相对于Ub的方向。中心疏水残基是Npl4 CTD和UMI中的Ile和MIU中的Ala。yNpl4 CTD或UMI中Ile的较长侧链推出了螺旋UBD的C末端，而那些N末端的亲水残基则移动到Ub的Ala46和Gly47的NH基团附近。由于这种邻近性，yNpl4 CTD和UMI的N末端亲水残基分别为Thr和Ser，它们比MIU的N末端亲水残基Asp短。
yNpl4–K48-Ub 2复合物的总体结构。着色方案与图 2a相同。b yNpl4（本研究中），RNF168 UMI（PDB 5XIS [的C端螺旋的泛素-结合的接口结构比较https://doi.org/10.2210/pdb5xis/pdb ]）38 Rabex-5和MIU （PDB 2C7M [ https://doi.org/10.2210/pdb2c7m/pdb ]）39。yNpl4-Ub dist复合体的着色方案与图 2a相同。RNF168 UMI和Rabex-5 MIU分别染成黄色和绿色。氢键显示为黑色虚线。参与yNpl4和Ub结合的残基dist和RNF168 UMI和Rabex-5 MIU的相应残基显示为棒。c yNpl4，RNF168 UMI和Rabex-5 MIU的C末端螺旋序列比对。yNpl4和Ub dist之间的结合涉及的残基以及RNF168 UMI和Rabex-5 MIU的相应残基以青色突出显示。
基板接合CDC48-UN的冷冻电镜结构22包含两个折叠部分泛素，它们对应于泛素DIST和UB PROX在yNpl4本晶体结构113-580 -K48-UB 2（图 6A）。在这两种结构中，yNpl4 CTD的C末端螺旋与Ub dist的以Ile44为中心的疏水性斑块相互作用（图 6b），因此，yNpl4 的Ub dist识别模式基本相同。另一方面，Ub 代理识别模式不同。在yNpl4-K48-Ub 2结构中，yNpl4的Ser498与Ub的Arg42形成氢键代理。yNpl4的S498R突变体的GST下拉和SPR分析表明yNpl4的Ser498实际上参与了与K48链的结合（图 2d，补充图 3b和表 2）。在该结构衬底接合CDC48-UN，泛PROX移向CDC48由〜10埃，与yNpl4-K48-UB相比2，并且不相互作用与yNpl4的Ser498（图 6B）。这种Ub 邻近运动似乎与未折叠的Ub部分的穿线有关。即，Ub 代理在最初的Ub链识别步骤中与yNpl4的Ser498相互作用。在随后的基底线程步骤中，展开的泛素插入CDC48的中心孔，并且拉动泛PROX，其失去其与yNpl4的Ser498相互作用。
一个的CDC48-UN复合物（PDB 6OA9 [的冷冻电镜结构的总体视图https://doi.org/10.2210/pdb6oa9/pdb ]）22。着色方案与图 1相同。展开的Ub为洋红色。b比较yNpl4–K48-Ub 2和底物结合的Cdc48–UN复合物的K48链结合位点。着色方案与图6a中的相同 。c，d使用Coot LSQ协议以yNpl4的zf-Npl4-MPN-CTD结构作为参考47，将yNpl4–yUfd1的结构叠加在与底物结合的Cdc48–UN复合物中。。将yUfd1 NBM作为刚体进一步拟合到与底物结合的Cdc48-UN（EMD-0665）22的冷冻电磁图中，并在Phenix 45中对其进行了实际空间优化。着色方案与图 3a相同。低温EM贴图显示为灰色网格。Ç yNpl4-yUfd1的总体视图，并与两个折叠部分泛素冷冻电镜地图在5轮廓σ水平。d与yNpl4和yUfd1之间的相互作用的特写视图冷冻电镜地图在8轮廓σ水平。
我们还确定了yNpl4 113–580 –yUfd1 288–305的晶体结构。我们将Ufd1的NBM区的结构对接至与底物结合的Cdc48–UN 22的冷冻EM结构中（图 6c）。当前的yUfd1 288-305模型很好地适合了在冷冻电磁图（图6c，d）中观察到的未分配密度，该密度 应该对应于yUfd1 22的一部分。这表明联合国复合物的晶体学揭示的yNpl4–Ufd1相互作用类似地发生在与底物结合的Cdc48–UN中（图 6d）。
Ub-蛋白酶体系统（UPS）的抑制剂最近已被开发为抗癌药物40。由于p97 / Cdc48-UN复合物在蛋白酶体的上游起关键作用，因此它的抑制作用已成为癌细胞中的一种新型治疗靶点41。但是，由于p97 / Cdc48在UPS途径之外也起着各种作用，因此其抑制作用可能会影响许多细胞功能。在上下文中，特异性p97-辅因子缔合的破坏将可能导致具有增强的抗癌活性特异性的新型p97抑制剂。Ufd1和Npl4之间相互作用的抑制阻止了Cdc48-UN复合物的形成（图 3f）。yNpl4 113–580 –yUfd1 288–305的当前结构 通过用作基于结构的设计的有用平台，可能有助于此类抗癌药物的开发。
合成了密码子优化的yNpl4，hNpl4和yUfd1 cDNA（Eurofins），以改善它们在大肠杆菌中的表达。为了结晶，分别使用Bam HI和Xho I位点将编码yNpl4 113–580或yUfd1 288–305的基因克隆到pGEX-6P1表达载体中，或分别使用Nde I和Xho I位点克隆到pCold-GST表达载体中，以产生N端GST融合蛋白。对于GST下拉分析，使用Bam HI和Xho I位点将全长yNpl4和yUfd1基因克隆到pGEX-6P1表达载体中15，然后使用Bam HI和Xho I位点将Cdc48基因克隆到pET21a表达载体中。对于SPR分析，使用Nde I和Xho I位点将编码yNpl4 113-580或hNpl4 105-608的基因克隆到pET28a表达载体中，以产生N端His 6标记的蛋白。对于基于荧光各向异性的亲和力测量，将GWCCPGCC序列连接到yUfd1 288-305的C末端。使用Nde I和Xho I位点将yUfd1 288–305 -GWCCPGCC基因克隆到pCold-SUMO表达载体中，以产生N端His 6标记的SUMO融合蛋白。通过基于PCR的诱变产生突变。这项研究中使用的引物序列见补充表 1。用每种表达载体转化大肠杆菌菌株Rosetta（DE3）细胞（Invitrogen），并在LB培养基中培养，该培养基含有100 mg L -1氨苄青霉素用于pGEX-6P1或pCold表达载体或50 mg L -1卡那霉素用于pET28a表达载体在37°C下。当培养物在600 nm的光密度达到〜0.5时，异丙基-β- D加入-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）至终浓度为0.1 mM以诱导蛋白质表达，对于pGEX-6P1和pET28a表达载体，在20°C下继续培养18 h，在15°C下继续培养24 h。 pCold表达载体。用pGEX-6P1或pCold-GST表达载体转化的细胞在含1 mM二硫苏糖醇（DTT）和0.5％Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行超声处理以破坏细胞，并通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶FF柱（GE医疗保健）和资源Q阴离子交换柱（GE医疗保健）。GST-yNpl4 113–580的GST标签被HRV3C蛋白酶裂解，并通过Resource Q阴离子交换柱和HiLoad 16/60 Superdex 75柱（GE Healthcare）在含50 mM NaCl和5 mM的10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.2）中进一步纯化。 β-巯基乙醇。为了制备yNpl4 113-580 -yUfd1 288-305复杂结晶，两倍摩尔过量的GST-yUfd1的288-305在4℃下温育10分钟，yNpl4 113-580。GST-yUfd1 288–305 –yNpl4 113–580复合物在包含50 mM NaCl和5 mMβ-巯基乙醇的10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.2）中通过HiLoad 16/60 Superdex 75色谱柱纯化。GST-yUfd1 288–305 –yNpl4 113–580的GST标签被HRV3C蛋白酶切割。为了除去GST，使样品通过预先用含有50 mM NaCl和5 mMβ-巯基乙醇的10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.2）预平衡的谷胱甘肽琼脂糖凝胶FF柱。用pCold-SUMO或pET28a表达载体转化的细胞通过在含有150 mM NaCl和0.5％Triton X-100的50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中进行超声处理而破裂，并通过镍-三三乙酸镍（Ni- NTA）柱（Qiagen）和Resource Q阴离子交换柱（GE Healthcare），Cdc48除外。为了制备Cdc48，将表达Cdc48的细胞在含有300 mM NaCl，10％甘油，1 mM Tris（2-羧乙基）磷化氢盐酸盐（TCEP），5 mM的裂解缓冲液（50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0））中裂解氯化镁2，以及100μMATP）并通过超声处理破坏。加入Triton X-100（终浓度为0.1％）后，将裂解物通过29,300 xg离心30分钟进行澄清。将得到的上清液与TALON树脂（Takara）一起温育。充分洗涤后，在CDC48含有100mM NaCl的，0.3M咪唑，5毫摩尔MgCl的50mM的HEPES-NaOH缓冲液（pH 7.1）洗脱2， 100μMATP和0.5mM TCEP。为了进一步富集六聚体Cdc48，将溶液加载到Superose 6 10/300色谱柱上，该柱平衡至50 mM HEPES-NaOH缓冲液（pH 7.5），该缓冲液包含100 mM NaCl，5 mM MgCl 2和0.5 mM TCEP，流速为0.25 mL min -1。准备yUfd1–His 6 -yNpl4 113–580在用于SPR分析的复合物中，将表达GST-yUfd1的细胞和表达His 6 -yNpl4 113-580的细胞混合，并在含1 mM DTT和0.5％Triton X-100的PBS中超声处理，同时破坏细胞。将澄清的裂解物上样到谷胱甘肽琼脂糖凝胶FF柱（GE Healthcare）上。GST-yUfd1–His 6 -yNpl4 113–580的GST标签被HRV3C蛋白酶切割，样品通过Ni-NTA柱（Qiagen）和HiLoad 16/60 Superdex 75柱（GE Healthcare）进一步纯化。含有150 mM NaCl的10 mM HEPES-NaOH（pH 7.5）。
UB在被过量产生大肠杆菌菌株携带在含有50毫克的L LB培养基中的泛素基因的pET26b表达载体转化的Rosetta（DE3）细胞（Invitrogen）-1卡那霉素在20℃下。SeMet标记的Ub，Ub（P19M V26M）和Ub（I30M）在蛋氨酸营养缺陷型大肠杆菌 B834（DE3）细胞中在与LeMaster培养基等效的定制培养基（代码06780，Nacalai tesque）中过量生产用30微克毫升-1 升 -SeMet（NACALAI TESQUE）和50毫克的L -1卡那霉素在20℃下。通过在50 mM醋酸铵缓冲液（pH 4.5）中进行超声处理破坏细胞。清除的Ub和Ub变体裂解物分别在80和60°C孵育5分钟。变性和不溶通过以30,000 ×g离心60分钟使大肠杆菌蛋白质沉淀。上清液通过在含有50 mM NaCl的10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.2）中的Resource S阳离子交换柱（GE Healthcare）和HiLoad 26/60 Superdex 75尺寸排阻柱（GE Healthcare）进行纯化。用Amicon Ultra-15 10,000 MWCO过滤器（Millipore）浓缩纯化的Ub。
酶促合成K48-，K63-和M1-Ub 4以及SeMet标记的K48-Ub 2。对于K48-Ub 4合成，将E1（0.25μM），E2-25K（5μM）和Ub（2 mM）在反应缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 9.0）包含10 mM ATP，10 mM中混合） MgCl 2和0.6 mM DTT），在37°C下孵育15小时。对于SeMet标记的K48-Ub 2合成，将E1（0.25μM），E2-25K（5μM）和Ub（2 mM）在反应缓冲液中混合，并在37°C下孵育15 h。对于K63-Ub 4合成，将E1（0.25μM），Ubc13（10μM），MMS2（10μM）和Ub（2 mM）在反应缓冲液中混合，并在37°C下孵育15 h。对于M1-Ub 4合成中，将E1（0.2μM），UbcH7（5μM），HOIP（残基697–1072； 0.1μM）和Ub（2 mM）在反应缓冲液中混合，并在37°C下孵育15 h。将每种反应溶液与四倍体积的50 mM乙酸铵缓冲液（pH 4.5）混合，并加载到用50 mM乙酸铵缓冲液（pH 4.5）预平衡的Resource S阳离子交换柱（GE Healthcare）上，该缓冲液含有140 mM NaCl。合成的Ub 4物种或SeMet标记的K48-Ub 2在50 mM乙酸铵缓冲液（pH 4.5）中用140-400 mM NaCl线性梯度洗脱。包含Ub 4物种或SeMet标记的K48-Ub 2的峰馏分将其装载到装有10 mM含150 mM NaCl的HEPES-NaOH（pH 7.5）的HiLoad 16/60 Superdex 75尺寸排阻色谱柱（GE Healthcare）上。将纯化的Ub链浓缩至〜1 mM，并保存在-80°C直至使用。
为了制备Ub n -GFP底物，使用Nde I和EcoR I位点将编码Ub-sfGFP-细胞色素b 2衍生的尾巴（Ub-GFP）42的基因克隆到pET21a表达载体中。Ub n -GFP底物酶促合成，并通过柱色谱法14纯化。对于K48-Ub n -GFP合成，将10μMUb-GFP，1μME1、20μMgp78RING-Ube2g2和400μMUb在含有10 mM ATP和10 mM MgCl的20 mM HEPES-NaOH缓冲液（pH 7.4）中孵育2在37°C下过夜。对于K63-Ub n -GFP合成，使用20μMUbc13 / MMS2，而不是20μMgp78RING-Ube2g2。泛ñ将-GFP底物与Ni-NTA珠粒结合，洗涤，然后在含有100mM NaCl和0.3M咪唑的50mM HEPES-NaOH缓冲液（pH 7.5）中洗脱。将洗脱液加载到Superdex 200增量10/300色谱柱上，该色谱柱平衡至含有100 mM NaCl和10％甘油的50 mM HEPES-NaOH（pH 7.5）缓冲液。收集含有长Ub链的馏分（平均约Ub 10）用于ATPase分析。
对于yNpl4 113-580和yNpl4 113-580 –yUfd1 288-305复合物的结晶，将E123A，K124A和E125A突变引入yNpl4 113-580，以减少过量的表面构象熵27。用于结晶的yNpl4 113-580 -SeMet标记K48-UB 2（WT，P19M V26M，或I30M）络合物，yNpl4 113-580与蛋氨酸标记的K48-UB混合2摩尔比为1：1.2。使用Mosquito液体处理机器人（TTP Lab Tech）在20°C下采用坐滴式蒸汽扩散法进行初始结晶筛选。我们用Hampton Research和Qiagen提供的结晶试剂盒测试了约500种条件。最初的命中进一步优化。yNpl4 113–580的最佳晶体通过坐滴蒸汽扩散法在20°C下生长，方法是将0.5μL蛋白质溶液与等量的含4％醋酸（pH 6.0）和12％PEG3350的储液混合，并与500μL的储液。yNpl4 113–580 –yUfd1 288–305的最佳晶体通过坐滴蒸汽扩散法，通过将0.2μL蛋白质溶液与等量的含90 mM Bis-Tris-HCl缓冲液（pH 7.5），19％PEG3350和10 mM ATP的储液混合，使复合物在20°C下生长并针对50μL的储液进行平衡。yNpl4 113–580 –SeMet标记的K48-Ub 2（WT）复合物的最佳晶体在20°C下通过坐滴式蒸汽扩散法生长，方法是将0.5μL蛋白质溶液与等量的100 mM Bicine-含34％PEG3350和200 mM Li 2 SO 4的 NaOH缓冲液（pH 9.0）并与500μL含100 mM Bicine-NaOH缓冲液（pH 9.0），18％PEG3350和200 mM Li 2 SO 4的储液平衡。yNpl4 113–580 –SeMet标记的K48-Ub 2（P19M V26M）复合物的最佳晶体在20°C下通过坐滴蒸汽扩散法通过将0.5μL蛋白质溶液与等量的100 mM Bicine混合而生长-含24％PEG3350、200 mM NaCl，3％1,5-二氨基戊烷和10 mM MgCl 2的NaOH缓冲液（pH 9.0），并针对500μL含100 mM Bicine-NaOH缓冲液（pH 9.0）的储液进行平衡％PEG3350和200 mM NaCl。yNpl4 113–580 –SeMet标记的K48-Ub 2的最佳晶体（I30M）复合物通过坐滴蒸汽扩散法在20°C下生长，方法是将0.5μL蛋白溶液与等量的100 mM Bicine-NaOH缓冲液（pH 9.0）混合，其中含有23％PEG3350、200 mM Li 2 SO 4，3％1,5-二氨基戊烷和10 mM MgCl 2，并与500μL含100 mM Bicine-NaOH缓冲液（pH 9.0），12％PEG3350、200 mM Li 2 SO 4和10 mM MgCl 2的储液平衡。数据收集，将晶体转移到cryostabilizing解决方案，这是一种含有30％甘油为yNpl4各个储库溶液113-580，20％甘油为yNpl4 113-580 -yUfd1 288-305或yNpl4 113–580 –SeMet标记的K48-Ub 2（WT，P19M V26M或I30M）的饱和海藻糖。将冷冻保护的晶体在液体N 2中快速冷冻。
衍射数据集在SPring-8（日本兵库县）的SPring-8光束线BL41XU处收集。PILATUS36 M（Dectris）用于yNpl4 113–580和yNpl4 113–580 –SeMet标记的K48-Ub 的数据收集2和EIGER X 16 M（Dectris）用于yNpl4 113–580 –yUfd1 288–305的数据收集。yNpl4 113–580，yNpl4 113–580 –SeMet标记的K48-Ub 2和yNpl4 113–580 –yUfd1 288–305的数据收集波长分别为1.28260、0.97904 和1.00000Å 。使用HKL2000 43和CCP4程序套件44处理数据集。为了使用锌异常散射从SAD数据集中解决yNpl4 113–580的结构，Phenix程序用于重原子搜索，相位计算和密度修正45。yNpl4 113–580 –yUfd1 288–305和yNpl4 113–580 –SeMet标记的K48-Ub 2复合物的结构是通过分子替代方法使用程序MolRep 46确定的。yNpl4 113–580的晶体结构用作搜索模型。使用程序Ub的晶体结构MolRep（PDB 1UBQ []无法找到yNpl4-K48-Ub 2结构中Ub部分的溶液。https://doi.org/10.2210/pdb1ubq/pdb ]）28作为搜索模型。我们使用程序Coot 47手动分配了剩余密度的Ub模型。yNpl4-K48-Ub 2（P19M V26M）和yNpl4-K48-Ub 2（I30M）结构中硒原子的异常差傅里叶图证实了K48-Ub 2的位置（补充图 1c）。使用Coot 47在仔细检查的情况下校正了原子模型。使用Phenix进行细化，并进行迭代校正和原子模型的细化。yNpl4 113-580或yNpl4 113-580的不对称单元中有一个结构的副本–yUfd1 288–305晶体。另一方面，在yNpl4 113-580 –SeMet标记的K48-Ub 2晶体的不对称单元中，有两个yNpl4 113-580和两个Ub（Ub dist和Ub prox）分子。yNpl4–SeMet标记的K48-Ub 2结构的精制过程中应用了扭转角NCS约束。yNpl4 113–580，yNpl4 113–580 –yUfd1 288–305和yNpl4 113–580 –SeMet标记的K48-Ub 2的最终模型具有出色的立体化学（表 1）。所有分子图形均使用PyMOL（DeLano Scientific;http://www.pymol.org）。
使用程序ClustalW 48进行多序列比对。yNpl4和hNpl4之间的序列比对图是使用程序ESPript 3 49准备的。
使用Biacore T200（GE Healthcare）在25°C下进行SPR分析。通过胺偶联法将野生型或突变型His 6 -yNpl4 113-580，yUfd1-His 6 -yNpl4 113-580或His 6 -hNpl4 105-600固定在CM5传感器芯片上，在10 mM HEPES-NaOH中（pH 7.5）含有150 mM NaCl和0.05％Tween-20。每个实验中固定配体的量以补充图7中的响应单位（RU）表示 。Ub 2或Ub 4以两份系列稀释系列制备样品，然后将每份稀释样品以每分钟10μL的流速注入含有150 mM NaCl，0.05％Tween-20、10 mM HEPES-NaOH缓冲液（pH 7.5）的流速为60 s。和0.5g L -1 BSA。补充图7中示出 了Ub 2或Ub 4的浓度范围。使用Biacore T200软件计算平衡解离常数（K d）。数据显示为每个样品的三个独立实验的平均值±标准差。
纯化的His 6 -SUMO-yUfd1 288-305 -GWCCPGCC在室温下用等摩尔比的FlAsH-EDT2（Santa Cruz）在50 mM含0.1％β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中标记。用PD-10脱盐柱（GE Healthcare）除去未反应的FlAsH-EDT2。为了测量yNpl4 113-580与yUfd1 288-305的结合亲和力（K d），将10μL1 nM FlAsH标记的His 6 -SUMO-yUfd1 280-305分成等分于384孔黑色，小体积和圆形底板（Corning）。他的6 -yNpl4 113–580以两倍系列稀释系列制备。将每个稀释样品10微升添加到含有FlAsH标记的His 6 -SUMO-yUfd1 280-305的孔中。荧光偏振记录通过使用Envision读板器（PerkinElmer）上λ EX = 480 nm和λ EM 在25 = 535纳米℃。用程序KaleidaGraph（HULINKS）计算K d（补充图 8）。在包含100 mM NaCl，5 mMβ-巯基乙醇和0.1 g L -1 BSA的50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中，对每个样品进行了三次测量。
本研究中使用的酿酒酵母菌株列于补充表 2中。所有菌株对W303都是同基因的。除非另有说明，否则我们在低于25℃的YPD培养基（1％酵母提取物，2％蛋白ept，2％葡萄糖，400 mg L -1腺嘌呤硫酸盐和10 mg L -1尿嘧啶）中使用指数生长的酵母细胞。OD 600为0.8（在我们的培养物中，OD 600为1包含3.80×10 7个 细胞mL -1）。
收获对应于1 OD 600的细胞，并用弱碱法提取50。通过在具有MES缓冲液（Thermo Fisher Scientific）的4-12％NuPAGE Bis-Tris凝胶（Life Technologies）上通过SDS-PAGE分离蛋白质，并在XCell II印迹模块（Life Technologies）上将其转移到PVDF膜（GE Healthcare）上。使用以下抗体进行免疫印迹：抗K48链的兔单克隆抗体（Apu2；以1：1000用于免疫印迹； Millipore，目录号05-1307），抗FLAG标签的小鼠单克隆抗体（M2，HRP缀合； 1） ：2000； Sigma-Aldrich，目录号A8592），针对Cdc48的兔多克隆抗体（1：1000； Kimura博士的礼物）和针对Pgk1的小鼠单克隆抗体（22C5D8； 1：1000； Life Technologies，目录号459250）。用作二抗的HRP偶联山羊抗小鼠或兔Ig（1：10,000）购自Jackson ImmunoResearch Laboratories（Cat＃315-035-048或Cat＃111-035-144）。
酵母细胞在SC培养基（不含氨基酸的0.67％酵母氮碱基，0.5％酪氨基酸，2％葡萄糖，10 mM磷酸钾（pH 7.5），400 mg L -1腺嘌呤硫酸盐，10 mg L -1尿嘧啶，和20 mg L -1色氨酸）在25°C下。然后将过夜培养物的系列稀释液（1：5）点到SC琼脂平板上。
含有150nM的CDC48，150nM的UN异二聚体和150nM的泛素溶液（40μL）ñ -GFP衬底在反应缓冲液（50mM的HEPES-NaOH（pH7.5）中，50mM NaCl中，10毫摩尔MgCl 2，0.5mM的TCEP，0.1毫克（mL -1 BSA）在37°C下孵育15分钟。为此，添加了10μL1 mM ATP溶液和50μLBIOMOL Green。在Enspire2300（Perkin Elmer）中以5秒的间隔测量吸光度（600 nm）。曲线的初始线性部分（0至50 s）的斜率用于计算速率。将数据标准化为无底物的野生型Cdc48–UN复合物的ATP水解速率的平均值。
为了分析Cdc48复合物的形成，将GST-Npl4或GST-Ufd1（0.5μM）固定在5μL谷胱甘肽琼脂糖4B珠（GE Hearthcare）上，并在室温下与0.5μM结合伴侣（未标记的Ufd1或他的6标记的Npl4）和3μMCdc48（0.5μM六聚体）在100μL的50 mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液中，其中含有100 mM NaCl，10％甘油和0.1％Triton X-100（结合缓冲液）。为了分析Ub链结合，在100μL结合缓冲液中加入1μgpolyUb链。为了分析随着浓度增加的yUfd1进行的Ub链结合，将50μL的polyUb链和0、0.25、0.5、1、2或4μMyUfd1添加到50μL的结合缓冲液中。用结合缓冲液洗涤3次后，将结合的蛋白用NuPAGE LDS样品缓冲液（Thermo Fisher Scientific）在70°C下洗脱10分钟。洗脱的蛋白通过在4–12％NuPAGE Bis-Tris凝胶上的SDS-PAGE分离，并用Bio-Safe考马斯亮斑（Bio-Rad）可视化。如上所述用抗Ub的小鼠单克隆抗体（P4D1，HRP缀合； 1∶500； 1∶500； 1∶500； 1∶500； 1∶500； 1∶500）进行免疫印迹。
细胞裂解和免疫沉淀基本上如先前所述进行15。对于抗FLAG免疫沉淀，通过在4°C下孵育1 h，使用5μL抗DDDDK标签的mAb-磁珠（MBL M185-11）从1 mg细胞裂解物中沉淀FLAG标签的蛋白复合物。用缓冲液A（50 mM Tris-HCl（pH 7.5），100 mM NaCl，10％甘油，10μM硼替佐米（LC Laboratories），10 mM碘乙酰胺和1x完全蛋白酶抑制剂混合物（不含EDTA; Roche）洗涤3次后含有1％Triton X-100的蛋白质，将结合的蛋白质在70°C下用1X NuPAGE LDS样品缓冲液洗脱10分钟。
有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的《 自然研究报告摘要》。
yNpl4，yNpl4–K48-Ub 2和yNpl4–yUfd1 的坐标和结构因子已保存在蛋白质数据库中，登录号为6JWH [ https://doi.org/10.2210/pdb6jwh/pdb]，6JWI [ https://doi.org/10.2210/pdb6jwi/pdb ]和6JWJ [ https://doi.org/10.2210/pdb6jwj/pdb ]。图1和2的未裁剪的凝胶和印迹图像。 2 d，3 e–f和4a–b以及补充图。 1 d，3 a–d，5 a–e和6c作为源数据文件提供。根据合理的要求，其他数据可以从相应的作者处获得。
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