摘要
供体反应性免疫在肾移植后的排斥反应中起主要作用，但是对供体反应性T细胞的分析并非常规应用。但是，已经表明，这可以帮助确定有急性排斥反应风险的患者。一个主要的障碍是所需同种异体刺激细胞的数量或质量有限，包括供体脾细胞的可获得性有限或与HLA库细胞的HLA匹配不足。为了克服这些限制，我们开发了一种新颖的测定法，称为TreaT（移植物反应性T细胞）测定法。我们从肾移植患者的尿液中培养了肾小管上皮细胞，并将其用作供体反应性T细胞的刺激物，我们通过流式细胞仪对其进行了分析。我们可以证明，使用TreaT分析对同种反应性T细胞的定量和表征优于其他刺激物。在一项初步研究中，移植前同种异体反应性T细胞的数量与移植后eGFR负相关。移植前CD161的频率与没有并发症的患者相比，早期急性排斥反应的患者中+的同种反应性CD4 + T细胞和产生颗粒酶B的同种反应性CD8 + T细胞明显更高。总之，我们建立了一种基于肾细胞评估供体反应性记忆T细胞的新颖测定方法，具有预测早期急性排斥反应和移植后eGFR的潜力。
肾脏移植是终末期肾脏疾病的标准疗法。急性（AR）或慢性排斥反应是移植医学中的最大挑战，而供体反应性免疫是抵抗同种异体移植接受的重要因素1。给予免疫抑制药物以控制或预防免疫反应；但是，这种药物有严重的副作用。许多先前的研究报告异构的风险状况相对于移植后的并发症，如AR或感染，这表明推出个性化免疫抑制治疗的方案2，3，4。对于此类个体化治疗生物标志物，需要能够区分具有不同风险特征的患者2，4，5，6。供体反应性T细胞的存在和预后肾移植已被证实与AR相关的和降低的同种异体移植物存活1，7，8。因此，T细胞同种致敏试验，已经开发并成功地作为移植结果的预测因子测试7，9，10，11，12。在这些测定中，受体抗原的外周血细胞受到呈现外源人类白细胞抗原（HLA）分子的同种抗原来源的刺激。当前，使用两种来源的刺激细胞。一个来源是除去供体肾脏的过程中收集的供体的脾细胞12，13。但是，脾细胞的可用性是有限的，并且仅可从已故的供体中获得。同种异体细胞的第二源是代表最常见的HLA-A型细胞库10，13。不幸的是，这些细胞通常缺乏足够的质量，因为供体和受体HLA类型之间的匹配常常不足。此外，由于两种来源都不都是同种异体移植来源，因此它们所呈现的肽并不完全类似于肾小管上皮细胞（TEC）（AR 14的主要靶标）所呈现的组织特异性肽。当前使用方法的另一个局限性是缺乏检测到的同种反应性细胞的广泛表型和功能表征3。这些强调了对于监测和深入表征同种异体反应性T细胞的特异性和灵敏测定的需求。因此，我们通过从受者尿液中获得的供体来源的肾细胞开发了移植物反应性T细胞（TreaT）测定法，尿液是一种方便且可再生的刺激性抗原来源。使用多参数流式细胞仪，我们表明我们的测定法有潜力预测移植后的移植物功能和AR的早期发作，因此可以作为指导肾移植患者精确免疫抑制方案的重要工具。此外，同种异体反应性T细胞的表征有可能揭示参与AR过程的新分子。
TreaT分析设置的概述可在图1中找到 。
TreaT分析的方法学概述。有关详细说明，请查阅正文的材料和方法部分。
招募了四名健康志愿者以及总共22名在Charité-Universitätsmedizin柏林移植的患者，并在横断面研究中对其进行了分析，以分析移植前后不同时间点的检测方法。没有从囚犯那里采购器官。在研究中分析的患者和样本数量与研究目标无关。因此，招募了22位患者进行TEC的培养。为了分析TEC上的HLA表达，使用了18位患者的样本。为了建立测定，收集了13名患者的样品。使用14例患者的样本进行eGFR的预测，并对12例患者进行临床随访以预测急性排斥反应。为了比较脾细胞和TEC之间的刺激能力， S1）。所有患者均签署了知情同意书，并且根据赫尔辛基的声明，该研究已获得德国柏林慈善大学伦理委员会的批准。
在包含肝素锂的Vacutainers中，从招募入研究的每个肾脏移植接受者中收集血液至少一次，最多四次（Beckton Dickinson（BD），Franklin Lakes，美国新泽西州）。通过密度梯度离心Ficoll-Paque（Biochrom，柏林，德国）分离PBMC。将细胞在Roswell Parm Memorial Institute-1640培养基（RPMI，Biochrom）中的CryoPure管（萨尔斯特（Sarstedt，Nümbrecht，德国））中冷冻，该培养基含有60％胎牛血清（FBS，Biochrom）和10％二甲基亚砜（DMSO; Sigma-Aldrich，慕尼黑） ，德国）在-80°C的冷冻箱（ThermoFisher，沃尔瑟姆，美国-马萨诸塞州）中盛有异丙醇（Sigma-Aldrich），并保存在液氮中直至进一步使用。除霜后，细胞静置24小时。
肾脏移植后第一周内，在无菌烧瓶（Corning Falcon，Corning，US-NY）中收集了多达300 ml的尿液。为确保供体尿细胞来源，在存在残留利尿剂的患者中，从单尾纤支架中收集尿液。然后根据先前发布的协议对样品进行进一步处理15。简而言之，用磷酸盐缓冲液（PBS，ThermoFisher）洗涤尿沉渣，并接种到含有1/1比率的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，ThermoFisher）和Ham's F12（Biochrom）的初级培养基中，用10％FBS，肾上皮生长培养基（REGM）SingleQuot试剂盒（Lonza Clonetics），100 U / ml青霉素/链霉素（P / S，Biochrom），2.5 µg / ml两性霉素B（Biochrom），100 µg / ml正常霉素（InvivoGene）和10 µg / ml环丙沙星（Fresenius Kabi奥地利）。三天后，将培养基替换为含有肾上皮基础培养基（REBM，Lonza，Basel，Swiss），REGM SingleQuot试剂盒，10％FBS，2.5 mM GlutaMAX（ThermoFisher），1％非必需氨基酸的增殖培养基。 （ThermoFisher）和100 U / ml / 100 µg / ml P / S。在随机样本（MycoAlert，Lonza）中监测支原体污染。
解冻冷冻的肾小管上皮细胞（TEC），将其接种在两个75平方厘米的细胞培养瓶中（Coning Falcon），并在增殖培养基中培养直至汇合。然后，将烧瓶与含有10％FBS和100 U / ml P / S的RPMI一起孵育，添加或不添加20 ng / ml干扰素γ（IFNγ）和10 ng / ml肿瘤坏死因子α（TNFα）（均为Miltenyi Biotec ，Bergisch-Gladbach，德国）以增强或诱导表面HLA-ABC和-DR表达。24小时后，收获TEC。通过流式细胞术分析一部分细胞，其余的用作同种异体抗原测定中的刺激物。
为了模拟组织损伤并促进抗原呈递细胞呈递同种异体抗原，将一部分TEC通过与4500 g离心分离，涡旋振荡并在-20°C的RPMI中反复冻融直至进一步使用，以裂解其溶解。
来自肾脏移植供体的至少6 cm的脾脏碎片用于进一步制备。用无菌镊子和手术刀（日本大阪的羽毛）去除脾结缔组织，并用PBS切碎100 µm和40 µm无菌细胞滤网（BD）。如上所述，通过Ficoll梯度分离单核细胞并冷冻。在用于同种抗原测定之前12小时，将冷冻的脾细胞在含有1％DNAse的RPMI（Roche Diagnostics，Rotkreuz，Swiss）中融化。如上所述裂解一部分脾细胞。为了在流式细胞仪中区分受体的PBMC和供者的脾细胞，在同种异体抗原测定中培养前一小时，用5 µM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE，Sigma）标记剩余的脾细胞。
将用或不用IFNγ和TNFα处理的0.25×10 6 TEC接种到24孔板（Corning Falcon）中。加入1.5×10 6个受体PBMC和0.25×10 6 TEC的裂解物（TEC∶裂解的TEC∶PBMC ＝ 1∶1∶6）。为了比较自体刺激与同种异体刺激的实验，将从两名健康志愿者中分离出的TEC与相同或不同供体的新鲜而非冷冻保存的PBMC进行孵育。PBMC接种到没有TEC和裂解TEC的孔中，作为阴性对照。阳性对照用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA，Sarstedt）和离子霉素（Iono，ThermoFisher）处理。所有孔均用1 µg / ml布雷菲德菌素A（Sigma）和1 µl / ml含有莫能菌素（BD）的蛋白质转运抑制剂孵育。0.25×10的附加标本设置6个 CFSE标记的肾脏移植供体来源的脾细胞和0.25×10 6个裂解脾细胞作为1.5×10 6受者PBMC的刺激物。温育16小时后，收获PBMC并染色以进行流式细胞术。
PBMC和脾细胞的细胞表面用抗CD161艳紫（BV）510（克隆HP-3G10，Biolegend，圣地亚哥，美国-加拿大）和活/死蓝（ThermoFisher）染色，以排除死细胞。PBMC的细胞内染色是使用FoxP3-通透缓冲液（ThermoFisher）和抗CD3亮紫外线737（克隆UCHT1，BD），抗CD4 BV650（克隆OKT4，Biolegend），抗CD8别藻蓝蛋白（APC）/ Cy7（ RPA-T8克隆，Biolegend），抗CD137藻红蛋白（PE）/ Cy5（克隆4B4-1，BD），抗CD154芹菜素-叶绿素蛋白（PerCP）/Cy5.5（克隆24-31，Biolegend）和抗粒酶B Alexa Fluor 700（克隆GB11，BD）。
用活/死蓝，抗CD13 APC（克隆WM15，Biolegend），抗CD90 PerCP / Cy5.5（克隆5E10，Biolegend），抗CD326（EpCam）FITC（9C4，Biolegend）对TEC细胞表面进行染色，抗HLA-ABC PE（克隆311506，Biolegend）和抗HLA-DR APC / Cy7（克隆L243，Biolegend）。给予抗细胞角蛋白BV421（克隆CAM5.2，BD）进行细胞内染色。抗HLA-ABC PE和抗HLA-DR APC / Cy7也用于脾细胞染色。
使用LSRFortessa（BD）测量患者样品，而使用CytoFlex LX（Beckman Coulter，Brea，US-CA）测量健康供体。选通和分析使用FlowJo版本10（FlowJo LLC，阿什兰，美国或美国）进行。通过两种不同的流式细胞仪分析患者样本和健康献血者并不重要，因为在研究中两个人群的数据没有直接进行比较。
根据标准流式细胞术指南16用未染色，未处理和足够的荧光减去一个（FMO）对照进行流式细胞术数据的门控。将TEC上的HLA表达分析为中值荧光强度（MFI）。将CD137 / CD154 + CD4 +和CD137 + CD8 + T细胞及其子集分析为每10 6个 CD4 +和CD8 +细胞分别为T细胞。每个门少于两个单元的计数被排除。为了说明特异性活化的细胞及其表型，减去了阴性对照中的相应群体，除了实验显示了检测的特异性外，其中描绘了阴性对照以更好地说明背景T细胞活性。使用Prism 7（GraphPad Software，圣地亚哥，美国-加利福尼亚）进行统计分析。使用D'Agostino＆Pearson正态性检验和Shapiro-Wilk正态性检验评估高斯分布。如所示，相应地使用了参数或非参数统计检验。详细，对于未呈正态分布的样本，使用Wilcoxon配对配对符号秩检验对HLA表达以及受体PBMC与供体UC和脾细胞的反应性进行了比较。为了测试UC刺激同种抗原反应性T细胞的能力，使用Friedman-Test和Dunn的多重比较测试进行了非参数统计。由于未假设球形度，因此应用了Greisser-Greenhouse校正。用皮尔逊相关系数计算eGFR（用CKD-EPI计算）与移植前同种反应性T细胞的相关性。
为了建立我们新颖的方法论，本研究总共包括了4名健康个体和22名肾脏移植患者。培养了所有22位患者和2位健康个体的细胞。流动细胞角蛋白，CD13，和上皮细胞粘附分子（EpCAM的）的流式细胞术的表达，这限定肾小管上皮细胞（TEC）17，18，以及CD90作为标记用于污染的成纤维细胞19进行分析。我们发现，绝大多数的培养细胞由TEC（中位数81％，IQR 69-89％）组成，主要是近端TEC（CD13 +），以及远端TEC（EpCam +）（图 2A，B）。显微镜评估证实了TEC的特征性上皮表型和穹顶形成（图 2C）。因此，在以下段落中，我们将从尿液培养的细胞称为TEC。
尿培养细胞主要由肾小管上皮细胞（TEC）组成，经IFNγ和TNFα处理后呈递HLA-ABC和-DR分子。（a）尿培养细胞的代表性流式细胞仪表征。移植后从肾移植患者中收集尿液，离心后将细胞沉淀接种到培养基中。然后将菌落在增殖培养基中扩增1-3周。收获后，对细胞进行上皮细胞标记细胞角蛋白，近端和远端肾小管细胞标记CD13和EpCam以及成纤维细胞标记CD90的染色。展示了22个个人捐助者的一个代表性例子。（b TEC的）定量（细胞角蛋白+ CD90 -）和成纤维细胞（细胞角蛋白- CD90 + 活尿培养细胞（间）ñ = 22）。培养3–6周后分析细胞。对于非正态分布的样本，使用Wilcoxon配对配对符号秩检验进行统计比较。（c）两个尿细胞培养物样品的代表性相差显微镜。上图显示了TEC（白色圆圈）的特征圆顶形成。下部图片中显示的细胞形态表示上皮细胞。放大倍率20×（左）和10×（右）。显示了22个个人捐助者的代表性示例。（d – g）HLA-ABC的中值荧光强度（MFI）表示的表达水平（d，e）和HLA-DR（（f，g）在尿液TEC上添加和不添加20 ng / mlIFNγ和10 ng / mlTNFα持续24 h（n = 18），流式分析收集的细胞直方图代表n =18。统计学分析是用Wilcoxon配对对有符号秩检验进行的，用于非正态分布的样本。
为了模拟排斥过程中的炎症环境并增强HLA表达，将TEC用IFNγ和TNFα处理24h 20。与未处理的样品相比，HLA表达的流式细胞术分析证实了TEC上HLA-ABC的增加（图 2D，E；P <0.0001，n = 20）。同样，TNFα和IFNγ处理后，TEC上的HLA-DR显着增加（图 2F，G；P <0.0001，n = 20）。总之，因为它已被证明之前TEC直接从供肾来源的21，我们的数据描绘尿源性TEC的作为非典型的抗原提呈细胞的能力。
为了检查我们是否可以诱导同种异体抗原反应性T细胞的特异性活化，我们分析了受体PBMC与各自的供体TEC共培养16小时后T细胞的活化标志物谱。将裂解的TEC加入完整的TEC中，以利于抗原呈递细胞呈递并模拟移植过程中可能发生的缺血性细胞死亡。单独使用受体PBMC定义T细胞基线激活。为了建立检测方法，从13位患者中获得了PBMC，其中一些在不同的时间点，因此总共分析了30个样品。
激活的CD4 + T细胞被定义为激活标记CD154和CD137阳性细胞（图 3A）。与未处理的对照组相比，我们观察到培养物中的活化CD4 + T细胞数量明显增加，其中TEC已被IFNγ和TNFα刺激（图 3B；P = 0.0004，n = 30）。值得注意的是，未经处理的TEC不会诱导CD4 + T细胞的特异性活化（P = 0.3934，n = 30）。
尿液来源的供体TEC可以监测同种反应性T细胞。（a）代表性的流式细胞仪图，说明了确定单个活的同种异体反应性CD3 + CD4 + CD154 + / CD137 +和CD8 + CD137 +淋巴细胞的门控策略。从左至右：PBMC的散点图，区分淋巴细胞与碎片和非淋巴细胞。双重排除 区分活CD3 + T细胞与死细胞和非T细胞；区分CD4 +和CD8 + T细胞；根据CD137和CD154表达鉴定反应性T细胞。（b – c）源自尿液的供体TEC可以引起受体CD4 +（b）和CD8 +（c）T细胞的供体反应性激活。将在不同时间点（n = 30）获得的13位接受者的PBMC 与溶解并完整的尿液来源的供体TEC或没有进一步刺激（阴性对照）共培养16 h。在用20 ng / mlIFNγ和10 ng / mlTNFα处理24小时的供体TEC或未处理的TEC之间进一步比较了特异性刺激。T细胞的活化通过流式细胞术测定CD4 + CD137 + / CD154 +和CD8 + CD137 + T细胞来评估，如（a）。使用Friedman检验和Dunn的多重比较检验对三个实验组进行统计学比较。（d – e）尿液来源的TEC不会激活自体CD4 +（d）和CD8 +（e）T细胞。培养了两个健康供体的TEC，分别用20 ng / mlIFNγ和10 ng / mlTNFα处理，部分裂解并与自体（auto）或随机选择的同种（allo）PBMC（n = 4 PBMC供体）孵育。如上所述评估T细胞活化。
关于CD8 + T细胞，我们观察到与CD4 + T细胞相比，同种异体反应细胞的比例更高。与阴性对照相比，经细胞因子处理的TEC诱导的CD137 + CD8 + T细胞数量明显增加（图 3C； P <0.0001，n = 30）。与CD4 + T细胞相反，它们也可以被未经处理的TEC激活（P = 0.0008，n = 30），尽管反应幅度较小。
为了排除观察到的反应性反映了对培养和裂解的TEC的非特异性反应，我们对随机选择的健康个体（n = 4）进行了另外的实验，其中我们使用了其中两个个体的细胞因子处理的TEC作为刺激剂，用于刺激这些PBMC。相同的供体（自身）或同种异体供体（allo）（图 3D，E）。健康志愿者是随机选择的，没有特定的HLA招募标准，如先前发表的22。尽管自体激活的CD4 +和CD8 + T细胞的频率可以忽略不计，但同种异体特异性CD4 +和CD8 + T细胞却可以检测到（CD4 +为304–502.7 CD8 +同种 反应性T细胞/ 10 6 T细胞则为703.5–1004.2 ）。总体而言，这些数据表明，可以使用基于肾脏移植患者尿液衍生的TEC的检测方法检测供体反应性T细胞。
用供体脾细胞监测同种异体反应性T细胞是一种完善且完善的方法，但仅适用于已故的捐赠。尿液来源的TEC具有直接从移植器官获得无限量细胞的优势。我们在来自相应供体的两种具有两种刺激器细胞类型的肾移植患者中进行了测定，以比较可检测到的同种异体抗原反应性T细胞的数量。分析脾细胞上的HLA-ABC和-DR表达表明两个分子均高表达。用IFNγ和TNFα处理后，表达略有下降（图 4A，上一行），这可能是由于生存能力降低（未显示）。相比之下，同一供体的TEC上HLA-DR的基础表达非常低，可通过IFNγ和TNFα处理诱导，但与脾细胞相比仍较低（图 4A–C）。为了比较TEC作为直接来自肾脏同种异体的刺激细胞的新来源与来自同一供体的脾细胞作为最常用来源的刺激能力，我们分析了各自的同种异体反应性T细胞反应。我们裂解了一部分TEC和脾细胞，并将它们与完整细胞一起孵育，以促进抗原呈递细胞的呈递，并模拟移植过程中可能发生的缺血性细胞死亡。在移植前和移植后的不同时间对四名患者进行了分析，总共获得了15个样品。与供体来源的脾细胞相比，我们用供体TEC刺激的样品中检测到的活化CD4 + T细胞的中值频率平均高出8倍（图 4D；P = 0.0001，n = 15）。因此，这些数据表明， 与脾脏抗原呈递细胞相比，TEC可以引起更强的供体特异性CD4 + T细胞应答。
与供体脾细胞刺激相比，使用尿源性供体TEC刺激评估同种反应性T细胞显示出更高的敏感性。（a）脾细胞表达的HLA-DR水平高于TEC。代表性图展示了对未经处理的以及24 hIFNγ和TNFα处理的尿源性TEC或脾细胞进行HLA-ABC和HLA-DR表达的流式细胞仪分析。两种细胞类型均来自同一死者的供体。（b，c）表达HLA-ABC（b）和HLA-DR（c）的活脾细胞和经处理的活TEC的频率通过流式细胞术测定（n = 4）。（dTEC引起的同种异体反应性高于相同供体的脾细胞。IFNγ和TNFα处理的TEC以及裂解的TEC或脾细胞和裂解的脾细胞（均来自肾脏移植供体）刺激了四个在不同时间点（n = 15）的肾移植患者的PBMC。通过流式细胞术测量活化标记CD154和CD137在CD4 + T细胞上的表达来评估特异性活化。使用Wilcoxon配对配对符号秩检验进行统计分析。
它预移植供体反应性T细胞的测定之前已经显示可以预测后移植肾功能和AR 13，23，24，25，26。为了确认我们的方法量化供体反应性T细胞和预测移植后临床过程的能力，我们在移植前收集了14位患者的PBMC。此后，在移植后对患者进行了6个月的临床随访。两名患者出现了经活检证实的早期急性排斥反应（AR组）。10名患者表现出稳定的移植物功能，无移植物功能延迟，AR或其他相关移植后并发症的迹象（对照组）。一名患者在移植后表现出多种手术和感染并发症。另一例患者最初表现出良好的移植功能，但移植后两周肾功能恶化。两名患者均进行了一次移植活检，但并未发现有关免疫并发症的结论，因此它们未包含在分析中。表中列出了10例对照患者和2例AR患者的人口统计学和临床特征 1。简而言之，八名对照患者为男性，两名为女性。他们的移植年龄为64.5（32–77）岁（中位数，范围）。9例对照患者的免疫抑制方案由他克莫司，霉酚酸酯和甲基泼尼松龙组成，一名患者接受依维莫司，环孢素和甲基泼尼松龙的治疗方案。经活检证实，在接受监测的12名患者中，有2名在移植后的早期就出现了经活检证实的细胞AR。他们都是男性，移植时的中位年龄为73.5（74-76）岁（中位数，范围）。他们的移植后治疗方案包括维持他克莫司，霉酚酸酯和甲基泼尼松龙的免疫抑制作用。
为了确定同种反应性T细胞的表型和功能亚型，我们应用了多色流式细胞仪（图 5A）。移植后6个月，同种异体反应性T细胞的移植前数量与eGFR（CKD-EPI）呈负相关。详细地说，这对于同种反应性CD4 + （r = -0.5566，P = 0.0387，n = 14）以及CD8 + （r = -0.6397，P = 0.0138，n = 14）T细胞可见（图 5B ，C）。
用TreaT测定法测量的移植前同种异体反应性T细胞与移植后结果一致。（一）代表性的门控策略，以识别同种异体反应性T细胞亚群。（b，c）移植前收集的供体反应性T细胞分析（n = 14位患者）。用相应的尿液供体TEC刺激受体的PBMC 16小时。孵育之前，将TEC用20 ng / mlIFNγ和10 ng / mlTNFα处理24小时，并裂解一部分TEC，以利于抗原呈递细胞呈递。孵育后，通过流式细胞术分析PBMC的同种反应性T细胞的频率。用皮尔森相关系数计算移植后6个月与移植前同种反应性CD4 + （b）和CD8 + （c）T细胞与eGFR（CKD-EPI）的相关性。虚线显示95％置信带。（d – e）先前描述的队列中的两名患者在临床随访中出现了活检证实的早期急性排斥（AR），并将他们的移植前同种反应性CD4 + （d）和CD8 + （e）T细胞的频率与10移植后前六个月内没有免疫并发症的患者（对照组）。晶须显示最小值和最大值。（˚F）同种异体反应性的CD4的进一步表征+ T细胞通过T H 17标记CD161和同种异体反应性CD8的表达+ T细胞通过产生粒酶B.灰点的显示控制例（Ñ = 10），大灰点将合并7个患者数据。黑色正方形表示活检证实的早期AR患者（n = 2）。
为了确认已建立的检测方法可用于预测AR早期发作，将12例移植患者分为无免疫并发症的对照组（n = 10）和经活检证实为排斥反应的AR组（n = 2），并在飞行员中进行了分析。研究。在移植前即刻获得的样品中测量同种反应性T细胞的频率。 与对照组相比，两名AR患者移植前的同种反应性CD4 + 和CD8 + T细胞数量更高。通过Mann-Whitney检验对这些结果进行比较，得出了显着差异（P 在两个子集中= 0.0152），但是由于在低样本量的实验中进行统计检验存在争议，因此我们无法描述P值（图 5B，C）。同种异体反应性CD154 +和/或CD137 + CD161 + CD4 + T细胞的数量以及产生CD137 +颗粒酶B的CD8 + T细胞的数量可以清楚地区分早期AR患者和移植后病程简单的患者（图。 5D）。CD161是TH17细胞27的标志物，TH17细胞在同种异体移植物28的T细胞反应中起重要作用。在29年前肾移植后，颗粒酶B被引入作为AR的标记。
T细胞介导的排斥反应是肾脏移植后的常见威胁1。建议参与AR发病机制的供体反应性T细胞可以在移植前产生，例如在怀孕，输血，先前的移植过程中，或在感染过程中作为交叉反应性T细胞30。他们是特别感兴趣的，因为它们可以允许即时预测移植后的临床过程8。CD4 + 和CD8 +记忆T细胞可以在没有次级淋巴器官的情况下发挥作用31，从而能够以短期刺激方式离体监测其反应性32。以前，我们和其他人可以表明，通过ELISPOT相关因素与移植后的肾小球滤过率测量预移植供体反应性IFNγ产生细胞的数量23，24，25，并预测早AR 13，26，33，34。然而，在这些测定中应用的刺激细胞具有若干限制。它们要么可用性有限（脾细胞），要么缺乏足够的匹配性（HLA库细胞）。此外，先前研究中使用ELISPOT对同种反应性细胞的功能和表型分析非常有限3。在这里，我们介绍了移植物反应性T细胞（TreaT）-化验，一种新颖的基于多参数流式细胞术的诊断工具，该工具使用易于获得的可再生尿液供体特异性刺激细胞来监测同种异体T细胞。与当前使用的资源相比，我们的模型具有大量，高可用性和高质量的优势。
栽培过程容易进行。尿液细胞的生长对于我们研究中的所有患者均有效。正如我们可以显示的，培养物中的大多数细胞都是TEC。由于尿液是从尾纤导管收集的，因此可以确保TEC的同种异体移植起源。因此，该方法提供了一种非侵入性方式来获取肾脏同种异体移植细胞。
关于质量，尿液细胞已被证明是功能完善的肾小管细胞35。在我们的环境中，最重要的是它们的刺激能力。我们可以表明，尿液衍生TEC，TEC一样从其他来源21，36，在促炎症环境上调这两种HLA-ABC和-DR分子。因此，这些细胞可以作为非典型抗原呈递细胞和活化记忆T细胞37，38。CD4 +和CD8 +的不同反应性显示了同种反应性T细胞的特异性以及促炎条件对TEC刺激能力的影响T细胞。稳态HLA-ABC表达足以触发CD8 + T细胞反应，而CD4 + T细胞仅在炎症处理的TEC上与上调的HLA-DR分子反应。此外，将自体刺激与同种异体刺激相比较，我们可以证明T细胞的激活以及TEC刺激是由于TEC的异体能力而不是由于TEC的非特异性细胞因子预处理所致。因此，健康志愿者的T细胞对自体TEC几乎没有反应，而同种异体TEC可以引起可测量的反应性。综上所述，这些实验表明，TEC具有诱导特异性T细胞同种异体反应的能力，而不会引起明显的非特异性反应。
知道我们可以特异性监测TEC诱导的供体反应性T细胞后，我们评估了与脾细胞（目前最常用的刺激源）相比，本试验的灵敏度。以前，一些作者指出存在呈现肾细胞特异性肽的HLA分子存在组织特异性同种异体反应39。因此，脾细胞将只监视一部分同种异体反应性T细胞，因为它们的HLA分子不结合肾同种异体移植物中存在的肽。在肾移植设置组织特异性T细胞的存在已经示出超过二十年前通过证明接枝浸润T细胞裂解的TEC一些克隆，而不是从脾细胞相应的供体分离39，40，41，42，43，44，45。与这些结果一致，我们观察到与供体来源的TEC相比，供体脾细胞刺激后的反应性显着降低，尽管脾细胞上HLA分子的表达较高。这强调了我们基于TEC的同种反应性测定的优越性，并表明它可能比目前使用的刺激细胞来源更准确地反映出供体和组织的特异性反应以及移植物中的情况。
为了证明建立的测定法的临床实用性，我们对通过TreaT测定法测量的移植前同种异体反应性T细胞与移植后GFR以及早期AR的相关性进行了原理验证研究。因为已经还示出了用于IFNγ-ELISPOT测定法23，24，25，预移植同种异体反应性的CD4 + 和CD8 + 6个月后移植与表皮生长因子受体逆相关T细胞。AR与IFNγ-ELISPOT预测表明不同的结果在临床试验13，23，24，25，26，33，34。在我们的分析中，将AR较早的患者与移植物功能稳定的患者进行比较，AR患者显示出同种异体反应性CD4 + 和CD8 + T细胞数量更高，当同种异体反应性CD161 +数量可以明显区分这两组比较了CD4 + T细胞和产生粒酶B的CD8 + T细胞。CD161是仅限于记忆表型和T H 17个细胞的标志和白细胞介素-17生产的标记27，46。我们的数据与众多作者的结果一致，这些结果表明TH17细胞参与了变态反应28。此外，Kim 等。证明最近在抗体介导的排斥反应患者中CD161 + CD4 + T细胞显着增加，从而证实了我们有关该细胞亚群在同种反应性中的作用的数据47。29年以前，颗粒酶B在AR中的参与也得到了深入研究和证明。综上所述，在我们报道的早期AR患者中，CD161 + CD4 +和颗粒酶B 的检测与其他离体和体内研究相关，这为所收集数据的临床相关性提供了证据。
我们的研究有一些限制。与对外周血细胞进行的其他研究类似，我们的离体分析不一定能反映出移植物中的情况。因此，在未来的研究中，需要与随访中的活检结果进行比较。但是，由于道德原因，这具有挑战性。此外，一些同种异体反应性T细胞亚群的数量相对较低。在肾移植患者的抗原特异性T细胞的非常低的数字检测已经为病毒特异性和疫苗特异性T细胞前被证明48，49，50。用于我们的研究中的数据采集和分析的质量控制（包括扣除非特异性背景和适当的荧光减一控制）可可靠地检测这些细胞。另一方面，较高细胞数的分析将促进同种异体反应性T细胞的鉴定和深入表征，尤其是在细胞因子或稀有亚群的定量方面。因此，抽取更多的血液（例如20 mL）将是有利的，并且在大多数情况下可以毫无问题地抽取。此外，在概念验证性先导研究中分析的患者数量不足以就我们测定的适用性和预后能力得出最终结论，还需要进一步的前瞻性研究来确认和扩展我们的数据。另外，到目前为止，我们还没有与使用供体脾细胞或HLA库细胞的IFNγ-ELISPOT进行的类似测定法进行直接比较。但是，我们的结果与在可比较的患者队列中测量同种异体反应性T细胞的类似测定相吻合。此外，获得第一结果所需的时间是临床环境中的关键点。为了获得足够数量的TEC，取决于尿液量和沉积物质量，最多需要两周的时间。但是，上述来源（例如脾细胞）的组合可能会桥接此诊断窗口。另一个选择是减小TEC数目以进行刺激，这也可以用于将来的研究。我们的结果与在可比较的患者队列中测量同种异体反应性T细胞的类似测定相吻合。此外，获得第一结果所需的时间是临床环境中的关键点。为了获得足够数量的TEC，取决于尿液量和沉积物质量，最多需要两周的时间。但是，上述来源（例如脾细胞）的组合可能会桥接此诊断窗口。另一个选择是减小TEC数目以进行刺激，这也可以用于将来的研究。我们的结果与在可比较的患者队列中测量同种异体反应性T细胞的类似测定相吻合。此外，获得第一结果所需的时间是临床环境中的关键点。为了获得足够数量的TEC，取决于尿液量和沉积物质量，最多需要两周的时间。但是，上述来源（例如脾细胞）的组合可能会桥接此诊断窗口。另一个选择是减小TEC数目以进行刺激，这也可以用于将来的研究。上述来源（例如脾细胞）的组合可能会桥接此诊断窗口。另一个选择是减小TEC数目以进行刺激，这也可以用于将来的研究。上述来源（例如脾细胞）的组合可能会桥接此诊断窗口。另一个选择是减小TEC数目以进行刺激，这也可以用于将来的研究。
总之，TreaT分析可提供同种异体反应性T细胞的供体特异性测量。与以前的测定相比，它具有无限可用性和卓越性能的优势。在一项前瞻性研究中，我们能够获得令人鼓舞的数据，说明该方法在早期AR患者中的适用性以及移植后GFR的预测。此外，我们的方法可对同种反应性免疫细胞的生物学及其与供体TEC的相互作用提供深入的个性化见解。因此，它可能有助于指导肾脏移植未来的个性化治疗。
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