摘要
感染的T细胞和巨噬细胞是感染个体中HIV-1的主要产生者。从被感染的细胞释放后，HIV-1会掺入各种细胞膜蛋白，其中一些对这些细胞具有特异性。然而，在病毒粒子中细胞编码蛋白的功能仍然很大程度上未知。我们进行了流式病毒测定，以分别使用细胞特异性标记CD36和CD27在HIV感染者的血浆中鉴定巨噬细胞和T细胞来源的HIV-1病毒体。使用四种不同方法，我们证明了病毒粒子上的CD36通过配体血小板反应蛋白1（TSP-1）结合免疫抑制性细胞因子转化生长因子β（TGF-β）。各个病毒粒子的流式病毒测定表明，CD36 +病毒粒子上存在TGF-β（平均值为28.2％±6.6％（n = 3）），但不在CD27 +病毒体上（平均1％±0.1％（n = 3））。如报道细胞系所评估，存在于捕获的CD36 +病毒粒子上的TGF-β分子具有生物活性。HIV病毒粒子上的TGF-β向HIV目标细胞的传递可能会影响它们，在病毒发病机理中起重要作用。
HIV-1通过了被感染的细胞，主要是T细胞和巨噬细胞释放的病毒体，不仅含有病毒编码的蛋白质但也有一些细胞蛋白1，2，3，4。与病毒编码分子不同，掺入病毒粒子的大多数细胞编码分子的功能大多未知。
在这里，我们研究了巨噬细胞特异性分子CD36的功能，该功能已被整合到巨噬细胞衍生的HIV-1病毒粒子中。从T细胞衍生的病毒体，其结合CD27到它们的膜这种蛋白质区分巨噬细胞衍生的病毒粒子3，4。
CD36属于质膜蛋白的B类清道夫受体家族。在细胞中，它结合各种配体，特别是血小板一个（TSP-1）5，6，7，抗炎细胞因子转化生长因子β（TGF-β）的主要活化剂8，9。TGF-β是通过在结合到潜伏相关肽（LAP）无活性形式（L-TGF-β）细胞释放，并且其活化由结合到TSP-1介导的10，11。
与CD36在细胞中的作用相反，尚未确定其在HIV-1病毒粒子中的功能。在这里，使用单病毒体分析（“流式病毒法” 12），我们发现从HIV感染者血浆中分离出的CD36 +病毒体与TSP-1相关，并带有生物活性TGF-β。
我们采用流virometry 12，13来分析HIV-1感染者血浆中细胞蛋白。我们将15-nm氧化铁磁性纳米颗粒（MNP）与两种抗Env抗体偶联：2G12，可识别gp120上的高甘露糖簇，并与gp120的单体，二聚体和三聚体结合；以及PG9，其可识别大多数的三聚体形式gp120的14，15。为了可视化MNP抗体复合物，我们用荧光山羊抗人Fab片段对其进行了染色（图 1a，b）。将标记的抗HIV MNP与HIV +血浆一起孵育。这些MNP捕获的病毒颗粒进一步用针对CD27和CD36的抗体染色。这些染色的MNP捕获的病毒粒子保留在磁柱上，从柱上洗脱下来，并用流式细胞仪进行分析（图 1a–c）。
感染者血浆中HIV-1病毒颗粒上的CD36和CD27。（a）门控策略：MNP标签Zenon Alexa 647的荧光高度的阈值触发设置。（b）由荧光高度和荧光宽度定义的单门，不包括聚集体12。（c）2G12 / PG9捕获的HIV-1的流式病毒仪。给出了CD27 +和CD36 +病毒粒子的种群。（d，e）用2G12 / PG9-MNP（白色星号）捕获的HIV-1病毒粒子上的CD27 +和CD36 +。CD27（红色箭头）（d）和CD36（绿色箭头）（e）由6 nm胶体金颗粒揭示。（f）用流式病毒分析仪评估2G12 / PG9捕获的病毒粒子中CD36 +和CD27 +的分数。显示的是平均值±sem（n = 3）。（g）总血浆病毒粒子中被2G12 / PG9-MNP，抗CD36-MNP和抗CD27-MNP捕获的病毒粒子级分中的HIV-1 RNA。显示的是平均值±sem（n = 3）。
为了评估这些病毒粒子的数量，即在血浆HIV总池中被PG9 / 2G12识别的Env的病毒粒子的数量，我们通过使用Cobas Ampliprep / Cobas Taqman HIV-1测试测量病毒RNA来对它们进行量化。我们发现携带带有被2G12 / PG9识别的构象的Env的病毒粒子 占血浆中总病毒RNA的8.3％±2.7％（n = 3）（图 1g）。
我们使用针对这些细胞分子的荧光抗体，进一步分析了用PG9 / 2G12-MNPs捕获的病毒粒子中CD27和CD36的存在。流量分析显示，在这些捕获的病毒体中 ，CD27阳性平均为2.3％±1.8％（n = 3），而所有CD36均为阴性，而CD36和CD3阳性的病毒粒子平均为80.2％±3％（n = 3）。 CD27为阴性（图 1f）。我们使用阴性染色免疫金电子显微镜确认了捕获的病毒粒子上CD27和CD36的存在（图 1d，e）。为了可视化这些细胞分子，我们使用了6 nm胶体金结合的山羊抗小鼠二抗。平均而言，捕获的病毒粒子为6.6±1.2（n ＝ 24）显示CD27的金颗粒（图 1d），和 显示CD36的22.2±2.7（n＝ 25）个颗粒，条形：50nm（图 1e）。
为了评估血浆HIV 总库中而不是PG9 / 2G12抗体识别的病毒亚群中CD36 +和CD27 +病毒级分的大小，我们用结合了抗CD36或抗CD27抗体的MNP捕获了病毒粒子。我们再次使用Cobas Ampliprep / Cobas Taqman HIV-1测试定量了每个部分的病毒数量。CD36 +病毒粒子，即被抗CD36 MNP 捕获，占总血浆病毒的5.6％±1.6％（n = 3），而CD27 +病毒体，即被抗CD27 MNPs捕获，占总血浆病毒的9.9％±4.6％（图 1g） 。
在进一步的研究中，我们调查了HIV-1上的CD36分子是否与TGF-β相关，这已经证明这种分子在巨噬细胞上表达的情况就是如此。为了实现这一目标，我们用2G12 / PG9-MNP捕获了病毒粒子，对它们进行了CD27和CD36染色，并通过用抗L-TGF-β的抗体对病毒粒子染色来评估它们是否存在TGF-β（图 2a–c）。L-TGF-β在CD36 +病毒粒子上显示（平均28.2％±6.6％（n = 3）），但在CD27 +病毒粒子上没有显示（平均1％±0.1％（n = 3））；p ＝ 0.03（图 2d）。
TGF-β在HIV-1病毒颗粒上的可视化。（a）来自感染在CD36和CD27上的被感染个体血浆的病毒粒子的流式病毒法。（b）CD36 +病毒粒子群体中的TGF-β +病毒粒子。（c）CD27 +病毒粒子的人群中缺乏TGF-β +病毒粒子。提出了三个实验中的一个代表。（d）用流式病毒分析仪评估用2G12 / PG9–MNP捕获的CD36 +和CD27 +病毒粒子上TGF-β +的分数。显示的是平均值±sem（n = 3）。（e）用2G12 / PG9-MNP捕获的病毒粒子上的L-TGF-β。负染色制剂的电子显微镜照片。MNP标有白色星号；L-TGF-β由6 nm胶体金标记的二抗显示（黄色箭头）。棒：50nm（f）染色特异性的对照。用2G12 / PG9-MNP捕获的病毒粒子，然后与6-nm胶体金标记的二级抗体一起孵育，而没有一级抗L-TGF-β抗体。MNP用白色星号标记。条形图：存在于2G12 / PG9-MNP捕获的病毒粒子中的50 nm（g）CD36，TSP和LAP蛋白。蛋白质印迹分析。提出了三个实验中的一个代表。（对于全长凝胶/印迹，请参见补充图 1）。（小时）捕获的病毒粒子中TSP和LAP的相对存在。给出了三个实验的平均值。
免疫电子显微镜进一步证实了捕获的病毒颗粒上L-TGF-β的存在。同样，我们用2G12 / PG9-MNPs捕获了病毒体，并用抗L-TGF-β抗体染色了捕获的病毒体。胶体金偶联的山羊抗小鼠第二抗体被用于揭示抗L-TGF-β抗体的结合位点。图 2e表明L-TGF-β聚集在病毒颗粒上。为了量化带有免疫金标记的L-TGF-β的病毒粒子的比例，搜索了200目EM网格的五个随机选择的网格正方形。该区域包含53个病毒体，其中17个带有L-TGF-β的免疫金标记。平均而言，有8±1.9（n ＝ 17）每个标记的病毒粒子有金颗粒。对照实验证明了L-TGF-β可视化对病毒体的特异性（图 2f）。
我们证实了使用Luminex平台和Western Blot在捕获的病毒粒子上存在LAP。为了用Luminex检测LAP，我们开发了一种使用特异性捕获和检测抗体的检测方法。通过该测定，我们揭示了2G12 / PG9-MNP捕获级分中的LAP，浓度为802.44±247.4 pg / mL（n = 3）。此外，在捕获的2G12 / PG9-MNP病毒颗粒上，Western印迹揭示了CD36和TSP-1的存在（图 2g）。这些蛋白质的量从一个血浆样品到另一个血浆样品而变化。然而，TSP-1 / CD36和LAP / CD36的比率具有相对较小的变异性：分别为9.4±4.2（n = 3）和1.4±0.6（n = 3）（图 2h），表明这些分子是相连的（相关系数r = 0.98）。
最后，为了研究捕获的病毒粒子上存在的TGF-β分子是否具有生物活性，我们将捕获的病毒与高表达TGF-β受体的报告细胞系进行了温育。TGF-β的结合激活这些细胞中的转录因子，如荧光素酶荧光16所示。从两个选定的血浆中捕获的病毒在报告细胞中诱导了萤光素酶活性，因此证明与这些病毒体相关的TGF-β分子具有生物活性。在对照实验中，我们使用IgG-MNP代替2G12 / PG9-MNP，在处理过的细胞中未观察到转录因子的激活（图 3）。因此，在受感染的个体中，有巨噬细胞衍生的HIV-1带有生物活性的TGF-β。
HIV相关TGF-β的生物活性。在用感染了个体血浆的2G12 / PG9-MNPs捕获的HIV-1病毒颗粒或用感染个体血浆孵育的非特异性IgG-MNPs处理过的HIV-1病毒颗粒处理过的TGF-β报告基因NIH / 3T3细胞中，评估了其生物活性。呈现的是处理过的细胞的发光高于对照未处理的细胞的背景荧光（n = 2）。
在这项工作中，我们集中于携带巨噬细胞特异性膜分子CD36的HIV-1病毒体。我们发现这些HIV病毒粒子可能特别重要，因为其中一些携带免疫抑制性细胞因子TGF-β。为了鉴定此类病毒体，我们使用了流式病毒分析技术，该技术使我们能够通过用偶联了特定抗体的15 nm磁性纳米颗粒（MNP）捕获单个病毒颗粒并对这些捕获的病毒颗粒进行染色来检测其他抗原的存在，从而对蛋白质进行表征12。
在这里，我们使用了两种不同的捕获病毒颗粒的策略：（i）将MNP与在病毒颗粒上识别细胞抗原，巨噬细胞特异性CD36或T细胞特异性CD27的抗体偶联；（ii）将MNP与识别Env 2G12 / PG9的抗体偶联。在第一种策略中，我们捕获了几乎所有带有CD27或CD36的病毒体17，在第二种策略中，我们仅捕获了具有特定构象的Env的那些病毒体，因为目前尚无可识别存在于其上的所有保守病毒表位的抗体病毒粒子18。具体而言，PG9与三聚体gp120结合，而2G12具有更广泛的识别能力，并且还与Env的非三聚体构象结合。因此，这两种抗体的结合捕获了携带各种构型的Env的病毒体，它们一起构成了总病毒种群的8％。
通过CD27或CD36捕获病毒粒子表明，更多的病毒粒子来自T细胞。该结果与HIV-1的主要产生者是中央记忆T细胞19的普遍观念大体一致。相比之下，在以PG9 / 2G12抗体识别的构型携带Env的病毒粒子中，巨噬细胞来源和T细胞来源的病毒粒子的分布不同。在这些被PG9 / 2G12捕获的病毒粒子中，大多数（〜80％）携带CD36。因此，尽管血浆中的大多数病毒粒子来自CD4 T细胞，而不是巨噬细胞，但带有被2G12 / PG9抗体识别的Env的病毒粒子群体富含巨噬细胞衍生的CD36 +病毒粒子。
重要的是，从两种不同的捕获策略中评估的CD36 +病毒粒子的数量总体上是一致的：2G12 / PG9-MNP捕获〜8％的总病毒粒子，其中80％是CD36 + ; 因此，根据这些数据，这些病毒体约占总数的6.4％（8％的80％），而直接用抗CD36 MNP捕获的CD36 +病毒体则占总数的5.6％。
我们进一步关注CD36 +病毒体，因为我们发现其中一些与TGF-β相关。TGF-β仅在CD36 +病毒粒子上发现，而在从感染者血浆中分离出的CD27 +病毒粒子上没有发现。我们通过四种不同的方法证明了这一点：（i）使用针对CD36和TGF-β的荧光抗体进行流式病毒测定，证明在大约三分之一的CD36 +病毒体上存在TGF-β ；（ii）免疫金EM证明捕获的病毒颗粒上存在TGF-β和CD36；（iii）蛋白质印迹分析表明存在LAP；（iv）还通过Luminex珠测定法在捕获的病毒粒子部分中显示了TGF-β。
TGF-β与TSP-1在CD-1上的结合在HIV-1病毒粒子上是否与巨噬细胞相吻合？在巨噬细胞中，已显示质膜上的CD36结合TSP-1，该TSP-1与L-TGF-β的LAP相互作用，并且这种相互作用导致构象变化，从而暴露L上的TGF-β受体结合位点。 -TGF-β。这种变化将L-TGF-β转化为能够与其受体结合的活性TGF-β。在该模型中，LAP与TSP-1 20相互作用后仍与TGF-β结合。已经提出了其他激活L-TGF-β的机制21。由于这是关于病毒粒子上存在TGF-β的第一份报告，因此应进行进一步的研究以确定细胞上激活的其他既定机制是否也对结合HIV的TGF-β起作用。在这里，通过蛋白质印迹，我们在捕获的带有CD36的病毒粒子中发现了TGF-β的主要激活物TSP-1。TGF-β结合的病毒粒子的病毒的生物合成（例如，在CD36富集含有病毒的隔室的过程中，可能会发生22，23）或从受感染的巨噬细胞释放病毒之后。无论是TGF-β与巨噬细胞来源的HIV结合的确切机制中的哪一种，在病毒粒子上，这种细胞因子仍具有生物活性，如通过捕获的病毒粒子与报告细胞的孵育所显示的。TGF-β在不同生物系统中显示出具有免疫调节强效果24，25。可以想象，这种携带在HIV-1病毒体上的生物活性细胞因子可以改变HIV靶标的免疫状态。TGF-β携带在病毒颗粒上对HIV靶细胞生理的确切影响尚待研究。
我们的研究有几个局限性：（i）与2G12和PG9抗体偶联的MNP捕获病毒体的某些子集17，而gp120可能以这些抗体无法识别的其他构象存在15；（ii）在我们的工作中，由于并非所有T细胞或巨噬细胞产生的病毒体都分别携带CD27和CD36，因此我们追踪到约16％的病毒体起源于其细胞。（iii）一些感兴趣的血浆病毒粒子可能没有被捕获，因为它们的Env分子可能已被感染过程中体内产生的免疫球蛋白所阻断；（iv）在流量分析中，我们可能低估了CD27 +病毒体，因为电子显微镜显示其中一些病毒体仅携带少量CD27分子。在这种病毒体上显示CD27可能低于流式病毒测定仪17的检测极限。
尽管存在这些局限性，我们的工作还是首次证明存在源自巨噬细胞的HIV-1病毒粒子，该病毒与一种重要的细胞因子TGF-β有关。这种与HIV-1相关的细胞因子保留了其生物学活性，并可能在影响目标细胞的病毒发病机理中发挥作用。
在麻萨诸塞州总医院（MGH）/波士顿霍华德·休斯医学研究所的HIV发病机制计划和德班的夸祖鲁-纳塔尔大学（University of KwaZulu-Natal University）的艾滋病毒发病机制计划的框架下，从三名进化枝C型感染HIV的未感染ART的个体中获取了血浆样本，南非。根据包括患者知情同意书在内的相关指导原则进行血浆收集，并经MGH IRB（＃2000P001150＆＃2007P000473）批准。血浆样品被匿名化，并且该方案已由美国国立卫生研究院人类受试者研究办公室（OHSRP＃12395）批准。
使用Taqman HIV-1测试测定（版本2.0（罗氏诊断公司））测量的病毒载量分别为174,328 C / mL，274,395 C / mL和532,400 C / mL。CD4 + T细胞计数为433、392和470（平均431.7±22.53）。
根据制造商的方案，将15 nm氧化铁纳米粒子（MNP）（Ocean Nanotech）与2G12（Polymun Scientific）或PG9（Polymun Scientific）偶联，将其重悬于2 ml洗涤/存储缓冲液中，并将悬浮液保存在4直到使用。在室温下，用山羊抗人Fab荧光片段（Zenon Invitrogen）标记与抗体偶联的MNP 30分钟。标记的抗体-MNP复合物在100 K Nanosep（Pall）色谱柱上洗涤。将标记的抗体-MNP与100 µL血浆在37°C下孵育40分钟；然后将捕获的病毒粒子用抗CD27-Alexa Fluor 750（克隆：CLB-27 / 1； Invitrogen），抗C36-Pe（5-271，Biolegend）和抗L-TGF-β-FITC染色（克隆：TW4-2F8; Biolegend）抗体再过20分钟。在捕获并染色的病毒粒子在连接至产生高磁场的磁体的磁柱上进行纯化后，用洗涤缓冲液（PBS中的0.5％BSA和2 mM EDTA）充分洗涤复合物，然后从400 µL PBS中的柱中洗脱，并固定在2％PFA中。我们通过对MNP抗体标记的荧光进行阈值分析，分析了在配备355、407、488、532和638 nm激光线的LSR II（Becton Dickinson）流式细胞仪上获得的复合物。补偿珠（BD）用于执行补偿控制。我们使用FlowJo软件V.10.4.2（三星级）分析了结果。抗体偶联的MNP捕获特定病毒粒子的效率显示为约99％，并且灵敏度足以捕获包含10种血浆的特定Env +病毒粒子 用洗涤缓冲液（0.5％BSA和PBS中的2 mM EDTA）充分洗涤复合物，从柱子中以400 µL PBS洗脱，并固定在2％PFA中。我们通过对MNP抗体标记的荧光进行阈值分析，分析了在配备355、407、488、532和638 nm激光线的LSR II（Becton Dickinson）流式细胞仪上获得的复合物。补偿珠（BD）用于执行补偿控制。我们使用FlowJo软件V.10.4.2（三星级）分析了结果。抗体偶联的MNP捕获特定病毒粒子的效率显示为约99％，并且灵敏度足以捕获包含10种血浆的特定Env +病毒粒子 用洗涤缓冲液（0.5％BSA和PBS中的2 mM EDTA）充分洗涤复合物，从柱子中以400 µL PBS洗脱，并固定在2％PFA中。我们通过对MNP抗体标记的荧光进行阈值分析，分析了在配备355、407、488、532和638 nm激光线的LSR II（Becton Dickinson）流式细胞仪上获得的复合物。补偿珠（BD）用于执行补偿控制。我们使用FlowJo软件V.10.4.2（三星级）分析了结果。抗体偶联的MNP捕获特定病毒粒子的效率显示为约99％，并且灵敏度足以捕获包含10种血浆的特定Env +病毒粒子 我们通过对MNP抗体标记的荧光进行阈值分析，分析了在配备355、407、488、532和638 nm激光线的LSR II（Becton Dickinson）流式细胞仪上获得的复合物。补偿珠（BD）用于执行补偿控制。我们使用FlowJo软件V.10.4.2（三星级）分析了结果。抗体偶联的MNP捕获特定病毒粒子的效率显示为约99％，并且灵敏度足以捕获包含10种血浆的特定Env +病毒粒子 我们通过对MNP抗体标记的荧光进行阈值分析，分析了在配备355、407、488、532和638 nm激光线的LSR II（Becton Dickinson）流式细胞仪上获得的复合物。补偿珠（BD）用于执行补偿控制。我们使用FlowJo软件V.10.4.2（三星级）分析了结果。抗体偶联的MNP捕获特定病毒粒子的效率显示为约99％，并且灵敏度足以捕获包含10种血浆的特定Env +病毒粒子4个 RNA拷贝/ mL 12，17。
我们在37°C下将100 µL血浆与2G12 / PG9-MNP的混合物孵育1小时。将混合物在磁柱上洗涤，从柱上洗脱，并重悬于100μLPBS中。对捕获的病毒粒子进行蛋白质印迹分析。我们使用RIPA裂解和提取缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）从捕获的级分中提取总蛋白。我们在4％-20％的预制聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）上加载10 µL蛋白质，用SDS-PAGE分离它们，然后将它们转移到PVDF膜上，并用抗CD36 / SRB3进行探测（1μg/ mL； R＆D系统），抗TSP-1（0.1μg/ mL； Millipore）和抗LAP（TGF-β-1）（2μg/ mL； R＆D系统）。一抗通过抗小鼠IgG二抗（Bio-Rad Laboratories）或抗山羊IgG二抗（R＆D Systems）与辣根（HRP）过氧化物酶缀合。我们使用V3 Western Workflow™（加利福尼亚州大力神市，Bio-Rad实验室）在数字图像上检测到过氧化物酶活性。我们使用Image Lab 6.00分析了图像。
我们使用Cobas Ampliprep / Cobas Taqman HIV-1 Test，Version 2.0（Roche Diagnostics）从血浆和MNP捕获的馏分中定量了HIV病毒颗粒。计算血浆中2G12 / PG9捕获的，CD36 +和CD27 +病毒粒子的百分比，作为捕获的血浆病毒粒子和总的与病毒粒子相关的HIV RNA的比例。
我们通过用PBS中的2％多聚甲醛（PFA）固定MNP纯化的HIV样品来使其失活。为了在没有免疫金标记的情况下进行阴性染色，将刚放电的辉光，formvar涂层和碳涂层的200目铜网格（Electron Microscopy Sciences，EMS）倒置在Parafilm上5 µL滴样品上1分钟。将带有粘附样品的网格转移到两滴经注射器过滤的2％醋酸铀酰（UA）水溶液（EMS）中1分钟，然后将网格用滤纸吸干，使UA薄层在网格上干燥。
将要进行免疫金标记的样品粘附到新近放电的辉光，formvar涂层和碳涂层的200目金栅格（EMS）上，并用非磁性镊子处理。粘附样品后，将网格通过20 µL过滤的PBS液滴，然后在含有2％BSA（Sigma）的PBS封闭溶液液滴中孵育30分钟，以减少非特异性抗体结合。在孵育步骤中覆盖样品以防止蒸发。
将CD36（5-271; Biolegend），CD27（克隆：CLB-27 / 1; Invitrogen）或L-TGFβ-1（克隆：TW4-2F8; Biolegend）一抗在过滤的封闭溶液中稀释至工作浓度为20 µg / mL。封闭后，将网格用滤纸轻轻吸干以除去多余的溶液，然后转移至一抗小滴中，然后孵育60分钟。然后，将网格转移至两滴封闭溶液中，以冲洗掉未结合的一抗，并孵育20分钟以封闭，然后再与二抗孵育。将二抗（6-nm胶体金结合的GtαMs IgG； EMS）在过滤的封闭溶液中以1:25稀释。在转移到第二抗体液滴之前，将网格轻轻吸干，孵育30分钟，然后在3滴PBS中漂洗。在出现负染之前，将网格快速转移到一滴蒸馏水中以除去PBS，然后再进行如上所述的阴性染色。作为用二抗进行非特异性标记的对照，在对照网格上省略了一抗。在这种情况下，很少观察到金颗粒。
我们使用在200 kV下操作的Technai T20透射电子显微镜观察样品，并使用AMT NanoSprint1200 CMOS检测器（Advanced Microscopy Techniques，Woburn MA）收集图像。
抗体和细胞因子标准品是从R＆D Systems（明尼苏达州明尼阿波利斯）购买的抗体对。根据制造商的建议，将单个Luminex磁珠组（Luminex，Riverside，CA）与细胞因子特异性捕获抗体抗L-TGF-β（MAB246）偶联。洗涤结合的珠子，并保持在4°C直至使用。生物素化的多克隆抗体的使用浓度为100 ng / mL。所有测定步骤均在含有PBS的测定缓冲液中进行，PBS补充有1％正常小鼠血清（GIBCO BRL），1％正常山羊血清（GIBCO BRL）和20 mM Tris-HCl（pH 7.4）。我们使用每孔1200个珠子进行实验，总体积为50 µL。我们向装有细胞因子捕获珠的孔中添加了2 µ12 / PG9–MNP捕获的病毒颗粒一式两份，每份50 µL，并在振荡器上孵育2小时。然后，将板在磁力清洗器上用200 µl分析缓冲液洗涤两次。然后将磁珠重悬于50 µL含有抗L-TGF-β的生物素化多克隆抗体的测定缓冲液中，并在室温下孵育1小时。我们再次用电磁洗涤器用200 µL测定缓冲液洗涤板两次，然后向每个孔中加入50 µL含有1 µg / mL链霉亲和素-PE溶液（分子探针，Eugene，OR）的测定缓冲液。将板在室温下孵育45分钟，使用电磁垫圈洗涤两次，然后将其重悬于100 µL PBS中。在Luminex-200平台上读取板。对于每个珠子，每孔收集100个珠子。记录每个珠子的珠子中值荧光强度，并通过Bio-Plex Manager软件（4.0版； Bio-Rad，Hercules，CA）使用5 P回归算法。低于检测下限（LLD）的值报告为零和LLD之间的中点（以pg / mL为单位的LLD：L-TGF-β4.7）。
为了测试TGF - β在捕获级分中的生物活性，使用稳定的SMAD /TGF-β报告基因细胞系（NIH / 3T3＃-SMAD）作为报告系统来监测由TGF-β触发的SMAD的激活。用完全生长培养基洗涤10 6个细胞/ mL，重悬于10mL完全生长培养基中，并在达到90％融合时用于生物活性测定。
洗涤胰蛋白酶消化的细胞，以每孔每孔100 µL的条件在10 4个细胞中接种于96孔白板中，一式两份，然后在37°C和5％CO 2下孵育过夜。第二天，为了除去未粘附的细胞，从孔中吸出培养基，并将在50 µl培养基中的病毒体捕获级分直接添加到细胞中，并孵育6 h / 16 h。除去培养基后，用PBS洗涤细胞并与20孵育µL裂解缓冲液在室温下放置15分钟，然后加入100 µl荧光素酶底物，并用光度计读取平板。
我们使用GraphPad Prism V7.0进行了统计分析。Shapiro-Wilk正态性检验可测试正态分布。分布被认为是正常时p ≤0.05。使用T检验以95％置信区间（CI）比较两组。差异有统计学显著当p ≤0.05。
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