宫颈癌是全世界癌症女性死亡的主要原因。在这里，我们对TCGA的Illumina HumanMethylation450K和RNA-seq数据进行了综合分析，以鉴定宫颈癌特异性DNA甲基化标记。我们首先鉴定了差异甲基化和表达的基因，并研究了DNA甲基化与基因表达之间的相关性。使用包括宫颈癌在内的12种癌症的DNA甲基化图谱生成候选集，并采用机器学习技术来定义候选集中最终的宫颈癌特异性标志物。然后，我们通过使用包含93例人类宫颈鳞状细胞癌样品和癌旁正常组织的组织阵列，通过免疫组织化学评估了标记基因的蛋白质水平。启动子甲基化与基因表达的局部调节负相关。在远距离调控基因表达中，高甲基化基因的甲基化更可能与基因表达负相关，而低甲基化基因的甲基化更可能与基因表达正相关。此外，我们通过使用TCGA的十倍交叉验证，鉴定了四种宫颈癌特异性甲基化标记，分别为cg07211381（RAB3C），cg12205729（GABRA2），cg20708961（ZNF257）和cg26490054（SLC5A8），其敏感性分别为96.2％和95.2％。数据。这四个标记可以在GEO数据库的四个独立验证集中以94.2、100、100和100％的AUC区分肿瘤与正常组织。总体，

宫颈癌是最常被诊断的癌症之一，也是女性癌症死亡的主要原因，全世界每年有500,000例病例和300,000例死亡。1尽管在过去的几十年中，北美，欧洲，澳大利亚和新西兰的一些人群中子宫颈癌的死亡率有所下降，但东欧，中亚和非洲的人群中子宫颈癌的死亡率却迅速上升。缺乏有效的筛查和较低的疫苗接种率。2大多数子宫颈癌是由人乳头瘤病毒（HPV）引起的，但也有免疫抑制，吸烟，妊娠史和长期使用口服避孕药的报道，这也是子宫颈癌的危险因素。3下一代测序等新策略正在为揭示宫颈癌发生的遗传病因提供公正的机会。遗传4，5，6和后生7，8，9点的变化可以改变在宫颈癌癌基因或肿瘤抑制基因的表达。10早期发现的宫颈癌患者的5年生存率为92％。2但是，如果癌细胞扩散到周围组织或身体其他部位，则存活率会急剧下降。因此，宫颈癌的早期发现是医生迫切需要改善治疗和治疗效果，并加强对患者的早期干预和咨询以改善他们的生活质量。

子宫颈抹片检查，也称为子宫颈抹片检查，是一种已在临床上广泛用于检查子宫颈癌前或癌细胞存在的检查。但是，子宫颈抹片检查显示出较低的灵敏度和较高的假阴性率。11 HPV检测也是推荐的宫颈癌筛查工具，不仅可以检测HPV的存在，还可以确定亚型。虽然许多研究12，13，14，15研究表明，HPV筛查在检测高级别宫颈癌方面比Pap检测更为敏感，HPV检测无法区分真正的触发因素和相关因素以提供准确的预测，因为并非所有HPV感染亚型都可能导致子宫颈癌 已经鉴定出分子标记以提高对子宫颈癌的风险预测，早期发现和预后预测的能力。鳞状上皮细胞癌抗原（SCC-Ag）的，16癌抗原125（CA-125），17癌抗原19-9（CA19-9），18和细胞角蛋白19片段抗原21-1（CYFRA 21-1）19，20是临床上可用于宫颈癌诊断和预后的肿瘤标志物。尽管有越来越多的标记物，如角蛋白4（KRT4），角蛋白17（KRT17），CD28，PTEN，的miR-29a和miR-21的，和HPV E4，正在不断研究的21，22，23的实际使用情况这些标记物在临床实践中的发生率很低。因此，寻找新的肿瘤标记物以提高宫颈癌诊断的敏感性和特异性非常重要。

DNA甲基化是一种主要的表观遗传机制，涉及将甲基转移到胞嘧啶的C5碳残基（5mC）上，这是由DNA甲基转移酶家族介导的。24 DNA甲基化在各种生物学过程中起重要作用，其中25包括基因表达的调节，26基因组印迹，27细胞分化，28发育，29和炎症。30据报道，异常甲基化与多种疾病有关，包括癌症。31CpG岛中的大多数CpG在正常细胞中通常未甲基化。这些CpGs的甲基化过高是肿瘤细胞中常见的变化之一，可能导致肿瘤抑制基因沉默。32例如，已发现在结肠癌中p14ARF启动子是高甲基化的。33 BRCA1和TMS1启动子在乳腺癌细胞中被高甲基化，34和DAPK和RASSF1A在肺癌细胞中被高甲基化。35个多项研究36，37报道，甲基化标记比蛋白质标志物更敏感，因此，癌症特异性甲基化标记有很大的潜力，在诊所用来准确地诊断癌症。

在这项研究中，我们整合了来自癌症基因组图谱（TCGA）的Illumina HumanMethylation450K甲基化数据和RNA-seq基因表达数据，以鉴定宫颈癌特异性DNA甲基化标记。通过使用系统性筛选方法和机器学习方法，我们通过TCGA数据的十倍交叉验证，鉴定了四种宫颈癌特异性甲基化标记物，其敏感性为96.2％，特异性为95.2％。这四个标记可以通过来自基因表达综合（GEO）数据库的四个独立验证集中的曲线（AUC）值下的94.2、100、100和100％区域来区分肿瘤与正常组织。

宫颈癌DNA甲基化的无监督聚类分析

在307份TCGA宫颈肿瘤样本中，将178份具有良好临床信息的样本（表S1）用于聚类分析。与以前的研究一致，对591个最易变的DNA甲基化探针进行了1个共识聚类，确定了三个簇，分别被称为CIMP高（CpG岛甲基化子表型），CIMP中级和CIMP低（图1a）。二十个样本（11％），69个样本（39％）和89个样本（50％）被聚类为CIMP高，CIMP中级和CIMP低。在变化最大的CpG中，平均甲基化水平差异显着（p值<0.0001），CIMP高组显示最高甲基化水平，CIMP低组显示最低甲基化水平（图1b）。发现三个临床特征，包括组织学（p值= 3.794e–09），HPV状态（p值= 0.007229）和HPV种类（p值= 7.954e–06）与这三个簇相关。 （图1a）。在这些肿瘤样本中，有31个（17％）腺癌，144个（81％）鳞状细胞癌和3个（2％）腺鳞癌。就HPV感染而言，有169例（95％）被HPV感染的肿瘤，包括120例被A9种类感染，45例被A7种类感染以及9例（5％）未被HPV感染的肿瘤。大多数腺癌富含CIMP高簇，而CIMP低和CIMP中间组则有更多的鳞状细胞癌（图1c）。腺鳞癌仅在低CIMP组中发现。CIMP高和CIMP中级组的所有患者均被人乳头瘤病毒（HPV）感染，而未感染HPV的患者则分布在CIMP低组中（图1d）。HPV A7类型富集于低CIMP簇中，而高CIMP高组中的大多数样品均被HPV A9感染（图1e）。

宫颈癌的DNA甲基化景观。宫颈癌中甲基化水平的无监督聚类。列中显示了样本，行中显示了591个变化最大的CpG位点（ 正常样本中的平均甲基化水平β <0.05  ，肿瘤样本中的标准偏差σ > 0.20）。确定的三个簇分别表示为CIMP高（n  = 20，CpG岛甲基化子表型），CIMP中级（n  = 69）和CIMP低（n  = 89）。在热图的顶部显示了在三个簇之间显着相关的原发性肿瘤特征（Fisher的精确检验p值<0.001）。b差异（在三个共有簇的甲基化水平中p值<0.0001）。与其他组相比，CIMP高组显示出明显的高甲基化。c – e在c – e中分别显示了三个聚类中关于HPV状态，组织学和HPV进化枝的样本分布。

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差异甲基化和表达分析

在113个正常肿瘤样本和307个肿瘤样本之间，共有46,040个CpGs被甲基化。宫颈癌中有29,730个高甲基化的CpG和16,235个低甲基化的CpG。然后，我们检查了差异甲基化CpG（DMC）在各种功能基因组区域中的分布，例如启动子，CpG岛（CGI）和CGI启动子（图2a）。在评估整个基因组中，有65％的CpGs被高甲基化，而35％的CpGs被低甲基化。在启动子，CGI和CGI启动子（分别为7851、17,515和4539）中观察到了更高的甲基化程度。通过考虑CpG内容和邻近上下文（图2b），CpG岛的甲基化率最高（95％），其次是N-Shore（72％），S-Shore（70％），N-Shelf（27％）和S-货架（23％）。检查基因周围的位点显示，在3'UTR中低甲基化率很高，而在转录起始位点（TSS）附近的区域，例如TSS200，TSS1500、5'UTR，第一外显子和基因，高甲基化率很高。身体。然后，我们将DMC映射到基因，鉴定出3939个高甲基化基因和5197个低甲基化基因。在整个基因组中，低甲基化基因的数量高于高甲基化基因的数量，而在功能基因组区域观察到高甲基化基因的数量增加（图2d）。）。在69个正常和304个肿瘤样品之间进行了差异表达分析。共检测到4949个差异表达基因（DEG），其中3096个上调基因和1853个下调基因。

低甲基化和高甲基化的CpG和基因的数量。DMC在不同基因组位置的分布，包括启动子（TSS上游1500 bp），CpG岛（CGI），CpG岛内的启动子（CGI启动子）和整个基因组区域（全部）。b DMC在与CGI相关的不同区域中的分布，包括CpG岛，CpG海岸和CpG架子。c DMC在整个基因区域（TSS1500，TSS200、5'UTR，第一个外显子，基因体和3'UTR）的分布。d DEG在不同基因组位置的分布

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DNA甲基化对子宫颈癌基因调控的影响

通过确定差异甲基化基因（DMG）和DEG之间的交点，进行DNA甲基化和基因表达的综合分析。大量研究表明，启动子甲基化可导致抑癌基因失活，因此是癌症发展的重要机制。33，34，35我们注意到，DMG是根据其启动子甲基化状态定义的。如果一个基因的启动子区域中至少有一个DMC，则认为该基因被差异甲基化。根据DMG与DEG之间的交集将基因分为四类：高甲基化上调（hyper-up），高甲基化下调（hyper-down），低甲基化上调（hypo-up）和低甲基化下调（hypohy） -down）基因（图3a）。在2096个高甲基化基因中，有123个基因被上调，而601个基因被下调。在1800个低甲基化基因中，有165个基因被上调，而203个基因被下调（图3b））。对于下游标记物识别过程，我们集中于hyper-down基因，因为启动子异常甲基化导致肿瘤抑制基因的转录沉默是癌症中最常见的变化之一。GO对hyper-down基因的分析表明，与化学突触传递，通过质膜粘附分子的同性细胞粘附，神经系统发育，谷氨酸受体信号通路和钾离子跨膜转运有关的基因大量富集（图3c）。KEGG分析表明，五个途径显着丰富：神经活性配体-受体相互作用，昼夜节律夹带，钙信号传导，细胞粘附分子和逆行内源性大麻素信号传导（图3c）。，表S2）。在各种癌症类型的基因表达研究中，丰富了类似的途径。38，39重要的是，昼夜节律的破坏已被报道与几个病理状况，包括癌症进展相关。40，41两者的钙信号传导和细胞粘附分子途径是癌症相关的途径，可能导致细胞增殖或细胞凋亡。

DNA甲基化和基因表达的综合分析。平均甲基化差异与log2表达变化的散点图。每个点代表一个CpG基因对。b Venn图总结了高甲基化基因与DEG之间的交集（顶部）以及低甲基化基因与DEG之间的交集（底部）。如果一个基因的启动子区域中至少有一个DMC，则认为该基因被差异甲基化。c代表性基因本体论（GO）术语和《京都议定书》的基因和基因组百科全书（KEGG）途径富含高表达基因。使用DAVID进行功能注释分析，并用p值和Benjamini-Hochberg值报告了前五个生物学过程和途径。dDNA甲基化与基因表达之间的相关性（局部调控）。计算所有基因，DEG，DMG以及差异表达和甲基化基因的皮尔逊相关系数。显着相关的临界值为 | > 0.3，调整后的p值<0.05。e DNA甲基化与基因表达之间的相关性（远距离调控）。计算了差异表达和甲基化基因中的1092个CpG与4949个DEG之间的Pearson相关性| γ$|\gamma$

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相关分析已被广泛用于检查甲基化和基因表达之间的关系。42，43我们研究了DNA甲基化对本地（在由该基因的启动子甲基化调控的基因的表达）的影响和遥远调控基因表达的（通过其它基因的启动子甲基化调控的基因的表达）进行皮尔逊相关分析。在本地调控的93,262个CpG基因对中，有323个（10％）基因显示出显着的正相关，2973个（88％）基因显示出显着的负相关，而83个（2％）基因显示出正相关和负相关（图3d）。我们注意到，一个基因可以与CpG正反相关，因为一个基因在启动子区域可以包含多个CpG。在DMG，DEG，差异表达和甲基化基因的相关分析中也观察到了很大比例的负相关（图3d）。然后，我们研究了DNA甲基化对基因表达的远距离调节的影响。计算了差异表达和甲基化基因中的1092个CpG与4949个DEG之间的Pearson相关性。高甲基化基因的启动子甲基化更可能与基因表达负相关，而低甲基化基因的启动子甲基化更可能与基因表达正相关（图3e）。

宫颈癌特异性甲基化标志物的鉴定和验证

为了确定可靠的宫颈癌特异性甲基化标记，我们通过使用其他癌症的TCGA甲基化数据和机器学习技术严格筛选了标记（图4a）。在601个下调基因的启动子区域中的2582个高甲基化CpG中，我们排除了在其他11种类型的癌症中鉴定出的2194个DMC，包括膀胱癌（BLCA），子宫内膜样癌（UCEC），甲状腺癌（THCA），胰腺癌（ PAAD），肺腺癌（LUAD），肝癌（LIHC），透明细胞癌（KIRC），头颈癌（HNSC），食道癌（ESCA），结肠癌（COAD）和乳腺癌（BRCA）。然后，我们对来自TCGA，GSE38266，GSE46306和GSE68339的样本中其余388 CpG进行了层次聚类（图4b））。正常样品聚集在一起，并在验证集中的TCGA样品和其他肿瘤样品中很好地区分。采用基于信息增益和顺序后向特征选择（SBFS）的混合特征选择方法来进一步过滤候选标记。最后，我们鉴定了四种宫颈癌特异性标记，即cg07211381，cg12205729，cg20708961和cg26490054。这些CpG被定位到四个不同的基因：RAB3C（cg07211381），GABRA2（cg12205729），ZNF257（cg20708961）和SLC5A8（cg26490054）。四种标记物在宫颈肿瘤，正常组织和其他癌症中甲基化水平的分布清楚地表明，四种已鉴定的CpGs是宫颈癌特异性标记物，在其他癌症中没有差异甲基化（图4d）。）。

宫颈癌特异性生物标志物的鉴定。a用于识别宫颈癌特异性甲基化标志物的工作流程（GDC：Genomic Data Commons； CESC：宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌）。b TCGA，GSE38266，GSE46306和GSE68339中的388个候选CpG的层次聚类。c具有十倍交叉验证的TCGA数据的接收器工作特性（ROC）曲线和AUC值。d子宫颈癌，正常组织和其他癌症的TCGA数据中四个最终选定标记的甲基化水平分布

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然后，我们通过使用TCGA样本作为训练集建立了逻辑回归模型，并进行了十倍交叉验证以实现可靠的预测性测量。在十倍交叉验证中，数据被随机分为十组。9套用于训练，其余套用于验证。曲线下面积（AUC）为0.989，表明这四个标记物在区分TCGA宫颈癌和正常样品方面可以表现出出色的性能（图4c）。为了验证独立集中的标记，我们在GSE38266，GSE46306，GSE68339_121和GSE68339_149上测试了模型的性能。请注意，我们选择了GSE46306中的正常样本作为GSE68339和GSE38266的对照，因为这些数据仅包含肿瘤样本。我们根据真阳性（TP）率，假阳性（FP）率，精度，F测度和AUC总结了验证集的分类性能（表1a–d）。这四个标记可以从GSE38266，GSE68339_121和GSE68339_149的对照中完美分类肿瘤。相反，对于GSE46306真阳性率明显高于对其他数据集相对较低由于有限数目（Ñ = 6）肿瘤样本，这使得难以确定准确的决策边界。

接下来，我们在分类准确性和AUC方面比较了四种标记物与已知的宫颈癌特异性标记物（表2）。根据Wang等人的研究，我们通过使用映射到NOL4和LHFPL4的11个CpG训练了逻辑回归模型。根据Verlaat等[ 44]，将36个CpGs映射到GHSR，SST和ZIC1。如图8所示，根据Lai等人的研究，有60个CpG映射到SOX1，PAX1，LMX1A，NKX6-1，WT1和ONECUT1。根据Clarke等人的文章，分别将45和37个CpG映射到DCC，EPB41L3和SOX1。图46（表S3）。不同标记集的分类性能相当，并且在本研究中确定的四个标记对于大多数验证数据集可以实现更好的性能。

GABRA2，ZNF257和SLC5A8在人CSCC中弱表达

为了进一步研究四种新鉴定的高甲基化子宫颈癌特异性标记物在人CSCC标本中的表达，我们使用包含93个人CSCC样品并配对的组织阵列，通过免疫组化（IHC）评估了GABRA2，ZNF257，SLC5A8和RAB3C的蛋白质水平癌旁正常组织。我们用结合了染色强度和阳性细胞百分比的评分量表（H评分）量化了CSCC标本中的IHC染色。我们发现CSCC细胞中GABRA2，ZNF257和SLC5A8的染色水平显着低于相邻正常细胞，而RAB3C的水平在CSCC和正常细胞之间无差异（图5）。）。这些结果强烈表明，GABRA2，ZNF257和SLC5A8的超甲基化与这些基因在人CSCC细胞中表达的降低有关，证实GABRA2，ZNF257和SLC5A8可能是人CSCC的新诊断标记。我们注意到，RAB3C的验证结果与TCGA数据集的验证结果不一致，因此需要进一步检查RAB3C的甲基化状态和mRNA表达水平。

GABRA2，SLC5A8和ZNF257在人宫颈鳞状细胞癌（CSCC）中弱表达。在包含93个完整的癌组织和成对的正常相邻组织的人CSCC组织阵列中，对指定蛋白质进行了IHC染色。代表性图像显示在左侧面板中。放大的图像显示在红色框中。基于H分数的定量结果显示在右面板中。** p  <0.01，*** p  <0.001，学生t检验

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在这项研究中，我们分析了来自TCGA的宫颈癌样品中的DNA甲基化和基因表达谱。DNA甲基化图谱的无监督聚类分析确定了宫颈癌的三种甲基化亚型，包括CIMP高，CIMP中级和CIMP低。CIMP最初在大肠癌中发现，据报道与不同类型的癌症（如胃癌和肝细胞癌）预后不良有关。47然而，我们的生存分析结果（图S1）表明CIMP与宫颈癌的预后无关（p-值= 0.75）。这是合理的，因为高CIMP组中的大多数样本都是腺癌，而且没有证据表明与其他组织学亚型相比，腺癌的预后较差。相关分析结果表明，启动子甲基化与基因表达的局部调控呈负相关。该观察结果与先前的研究一致，该研究表明启动子高甲基化与基因的转录沉默有关。有趣的是，在高甲基化的基因中观察到启动子甲基化与远处的基因表达之间负相关，而在低甲基化的基因中发现正相关。对基因表达的远距离调控的详细机制仍知之甚少，需要进一步研究。

特征选择是一种数据预处理技术，已在许多生物信息学应用程序中广泛使用。48，49，50在这里，我们将标记物发现建模为选择最佳特征子集进行宫颈肿瘤和正常组织分类的问题。由于Illumina HumanMethylation450K数据的高维度，因此选择可靠的特征子集并非易事。在DNA甲基化研究中使用包装器进行标记发现是不切实际的，因为计算成本太高，无法测试450-K CpG的所有可能组合。将过滤器应用于选择标记是另一个挑战，因为过滤器可能会导致局部最优集，但不会导致最佳区分子集，这可能使得不可能找到具有高灵敏度和特异性的诊断标记。因此，我们设计了一种基于信息增益和SBFS的混合特征选择方案，以选择可靠的甲基化标记。

我们最终确定了四个甲基化标记，分别为cg07211381（RAB3C），cg12205729（GABRA2），cg20708961（ZNF257）和cg26490054（SLC5A8）。通过使用这四个标记，我们在TCGA数据的十倍交叉验证中获得了96.2％的灵敏度和95.2％的特异性。此外，我们从GEO数据库中获得了四个独立验证集的94.2、100、100和100％AUC。先前发现一种标记基因SLC5A8是一种肿瘤抑制基因，在结肠肿瘤中被高度甲基化51，并且在乳腺癌细胞中观察到由异常DNA甲基化引起的SLC5A8的下调。52尚未报告其余三个基因RAB3C，GABRA2和ZNF257与癌症有关，需要进一步研究其生物学功能。

总之，DNA甲基化是一种主要的表观遗传机制，在致癌过程中起着至关重要的作用。我们鉴定了四种宫颈癌特异性甲基化标记，包括cg07211381（RAB3C），cg12205729（GABRA2），cg20708961（ZNF257）和cg26490054（SLC5A8），并在CSCC中进一步证实了GABRA2，ZNF257和SLC5A8的表达明显降低。通过IHC进行人CSCC组织。实验结果表明，这些标记物在区分宫颈肿瘤和正常组织方面具有极高的敏感性和特异性。需要进一步的生物学验证和临床试验来评估这些甲基化标记物的临床意义。此外，

资料准备

从TCGA获得了来自307个宫颈肿瘤和3个相关正常组织的Illumina HumanMethylation450K阵列数据，并将甲基化水平量化为β值（β），β值是甲基化和未甲基化等位基因强度的比值。我们通过从每个项目中随机选择十个样本，从其他11个癌症项目的110个正常样本中提取了HumanMethylation450K阵列数据，如参考资料所述。1个11种癌症类型包括BLCA，UCEC，THCA，PAAD，LUAD，LIHC，KIRC，HNSC，ESCA，COAD和BRCA。最后，将113个正常样品的甲基化谱图用作差异甲基化分析的对照。使用带有人基因组装配体GRCh37（hg19）的Bioconductor软件包对探针进行注释。另外，从GEO数据库获得了四个Illumina 450K甲基化数据集。GSE38266 53包含来自21个HPV阳性和21个HPV阴性肿瘤的甲基化数据，GSE46306 37包含来自20个正常宫颈样本（HPV阴性）和6个宫颈癌组织（HPV阳性）的数据，以及GSE68339 54包含来自149个宫颈癌患者的发现队列（GSE68339_149）和121个癌症患者的验证队列（GSE68339_121）的甲基化谱。来自子宫颈癌的RNA-seq表达谱也从TCGA获得。该研究包括来自304个肿瘤和69个正常组织的符合甲基化数据的原始读取计数。

共识聚类分析

根据K-means算法和欧几里得距离，对CpG岛（CGI）启动子区域中的591个变化最大的探针进行了无监督共识聚类。为了确定变化最大的CpG，我们选择了307个宫颈癌样本中的CpG，β值的标准偏差大于0.2，如果113个正常组织的平均甲基化水平大于0.05，则去除CpG，如之前的学习。55，56的共识群集盒外加R包57用于聚类分析。Fisher精确检验用于检验整个簇之间临床特征的重要性，并进行单向ANOVA来比较不同簇之间CpG的甲基化水平。

差异甲基化分析

在113个正常和307个肿瘤样本之间进行了差异甲基化分析。分析中排除了包含SNP的探针，X染色体上的探针以及缺失值超过10％的探针（其他文件1）。所选的CpG的缺失值是通过使用imputeTS R软件包估算的。使用Wilcoxon秩和检验确定差异甲基化的CpG（DMC），并使用FDR方法调整p值。如果平均甲基化差异> 0.2，FDR为5％，则报告DMC。

差异表达分析和DAVID分析

在用于甲基化分析的113个正常和307个肿瘤样品中，差异表达分析中包括69个具有RNA-seq表达谱的正常和304个肿瘤样品。使用M值的修正均值（TMM）方法对原始RNA-seq读数计数进行归一化，并使用负二项式广义对数线性模型拟合归一化计数。如果对数倍数变化> 1.5，且调整后的p值小于0.05，则报告差异表达基因（DEG）。使用注释，可视化和集成发现数据库（DAVID）进行功能注释聚类分析。58报告了前五个基因本体论（GO）的生物过程和《京都议定书》的基因与基因组百科全书（KEGG）途径及其p- 值和Benjamini-Hochberg 59个值。

CpG与基因的相关性分析

为了检查DNA甲基化对基因表达的局部调节的影响，计算了位于启动子区域的CpGs 的β值与相应基因的标准化表达值之间的皮尔森相关性（r）。请注意，一个基因可以通过其启动子中的多个CpG连接，因此，对每个CpG基因对都计算了相关性。  > 0.3和调整后的p值<0.05设置为具有显着相关性的临界值。60为研究基因表达的远距离调控，计算了β之间的r| r |$|r|$ 甲基化和表达差异基因的CpGs值以及差异表达基因的标准化表达值。

混合功能选择

特征选择是机器学习中用于减少数据维数的预处理技术。功能选择的目的是识别功能最丰富的功能子集，以提高学习效果。特征选择方法大致可分为三类：过滤器，包装器和混合器。61在过滤方法中，按从统计量度计算得出的分数对特征进行排名，并提供一个临界值以确定是否应选择特征。包装器方法生成功能的不同组合，并使用机器学习算法对其进行评估。混合方法首先通过使用过滤器消除某些功能，然后应用包装器确定最终子集。混合方法不仅可以利用过滤器的计算效率，而且可以达到与包装器相当的精度。

为了鉴定宫颈癌的可靠甲基化标记物，我们将标记物发现视为鉴定可以最精确地区分宫颈癌和正常组织的特征（CpG）子集的问题。我们基于信息增益和顺序向后特征选择（SBFS）设计了一种混合特征选择方案。首先，所有候选CpG的信息增益计算如下：

其中H（X）表示CpG X的熵，H（X / Y）表示观察Y类后CpG X的熵。然后，根据所有CpG的信息增益，按降序对它们进行排序，并建立一个阈值以删除无关的CpG。如果CpG的信息增益> 0.3，则选择CpG进行进一步处理；如果没有，则消除了CpG。接下来，通过使用SBFS生成CpGs的不同组合，并使用逻辑回归模型评估这些组合。选择分类精度最高的子集作为最终子集。

免疫组织化学

从包含93个完整子宫颈癌组织和成对的正常相邻子宫颈组织的三个人宫颈鳞状细胞癌组织阵列的连续切片购自上海Outdo Biotech Co.，Ltd.（OD-CT-RpUtr03-004，OD-CT-RpUtr03-005 ，以及OD-CT-RpUtr03-006）。将切片用1：100稀释的抗GABRA2抗体（Thermo-Fisher，＃PA5-26305），1：100稀释的抗ZNF257抗体（Thermo-Fisher，＃PA5-36012），抗SLC5A8染色抗体（Proteintech，＃21433-1-AP）的稀释度为1：100，抗RAB3C抗体（Proteintech，＃10788-1-AP）的稀释度为1：200。清洗后，将切片与生物素偶联的二抗孵育，然后与链霉亲和素–HRP孵育。最后，通过与3,3'-二氨基联苯胺（DAB）底物孵育，将切片可视化。使用Mantra系统（美国马萨诸塞州PerkinElmer）以相同的曝光时间获得图像。的H分数用于量化正常和肿瘤组织中GABRA2，ZNF257，SLC5A8和RAB3C的蛋白质水平，该分数通过将染色面积（以差异染色面积的百分比计）和染色强度（根据颜色密度，将弱，中和强分为1、2和3）。进行了学生t检验以进行统计分析。