慢性hiv-1感染者的PBMC表现出精疲力竭的状态。 在慢性HIV-1感染过程中，除CD8+T细胞耗竭外，其他类型的免疫细胞(如B细胞、NK细胞)也存在衰竭现象。在此背景下，我们首先比较了35例慢性HIV感染者(感染6个月以上)和27例早期患者(6个月内感染)PBMC CTLA-4、Tim-3和延迟-3(称为衰竭标志物)的mRNA水平。为了比较衰竭标记物与miR-146 a基因的表达情况，本研究采用RT-qPCR代替流式细胞术检测这些基因的mRNA表达水平。与以前的报告一致，慢性组的疲劳指标Tim-3和延迟-3较高(图一)。 1A-c )。慢性HIV-1感染者PBMC CTLA-4、Tim-3和延迟-3水平也高于非感染者(健康对照组，HC)(P<0.01)。 1D-f )。CD4+T细胞计数低于或大于350细胞/l组差异无统计学意义(P>0.05)。由于RT-qPCR过程中CT值异常升高，我们未能检测到Pd-1mRNA。
图1 HIV-1感染者和未感染者PBMCs耗竭标志物和效应功能相关基因的表达。从患者PBMCs中分离RNA，定量RT-PCR检测CTLA-4、Tim-3、延迟-3、GZMB、穿孔素和CD107a mRNA水平。本研究共分析205例患者样本，其中25例为早期患者，37例为慢性期患者。 a – c , g – i )。将慢性期个体CD4+T细胞计数<350细胞/l组(n=21)和CD4+T细胞计数组(n=16)与健康对照组(n=35)进行比较。 d – f , j – l )。以GAPDH为内源对照。*p<0.05，**p<0.01，*p<0.001。NS，没什么意义。
其次，我们检测了外周血单个核细胞中GZMB、穿孔素和CD107a的mRNA水平，它们与T细胞功能密切相关。慢性HIV-1组GZMB水平低于HC组，但慢性组与早期组间差异无显着性(图1)。 1g，j )。慢性期穿孔素水平低于早期组，也低于HC组(无花果组)。 1H，k )。慢性感染组CD107a水平明显高于HC组(P<0.01)。 1L )。值得注意的是，GZMB、穿孔素和CD107a的水平在CD4+T细胞计数上没有差异(图1)。 1J-l ).
综上所述，这些结果显示来自慢性hiv-1感染者的PBMC表现出一种精疲力竭的状态.
慢性hiv-1感染者外周血miR-146 a水平较高，与免疫耗竭标志物呈正相关。 接下来，我们评估了所有hiv-1感染者PBMC中miR-146 a的水平(表)。 1 ，n=205)。结果表明，慢性HIV感染者PBMCs中miR-146 a水平明显高于早期组和健康对照组(P<0.05)。 2A，b )。CD4+细胞计数<350细胞/l组的miR-146 a水平高于CD4+细胞计数≥350细胞/l组(p<0.0 5)(P<0.0 5)。 2B ).
图2 慢性HIV-1感染者PBMC miR-146 a表达的变化。定量PCR检测HIV-1感染者早期(96例)和慢性期(109例)PBMCs中miR-146 a的相对水平。( a 将CD4+T细胞计数<350细胞/l组(n=77)与慢性期个体(n=35)和健康对照组(n=35)的CD4+T细胞计数≥350细胞/l组(n=32)进行比较。 b )，以U6为内源对照。( c 用Spearman相关检验分析miR-146 a与CD4+T细胞计数的相关性(n=109)。给出了相关系数(R)和p的值。( d 定量PCR检测HBV-HIV+(n=33)、HBV+HIV+(n=21)、HCV-HIV+(n=33)、HCV+HIV+(n=22)、TB-HIV+(n=33)、TB+HIV+(n=20)、CMV-HIV+(n=33)、CMV+HIV+(n=24)和未感染个体(n=35)的miR-146 a相对水平。*p<0.05，**p<0.01，*p<0.001。NS，没什么意义。
我们分析了mR-146 a水平与CD4+细胞计数的相关性，发现mR-146 a水平与CD4+细胞计数呈负相关(r=−0.2902，P=0.0022)。 2C )。慢性组miR-146 a与CTLA-4/Tim-3呈正相关(表1)。 2 ).
表2 PBMCs免疫耗竭标志物与miR-146 a水平的相关性。 考虑到这些慢性hiv-1感染者包括一些共同感染的患者(表) 3 )因此，我们检测了miR-146 a在HBV/HIV、HCV/HIV、TB/HIV和CMV/HIV共感染患者中的表达。我们发现，miR-146 a水平在合并感染或hiv-1单染患者中并无不同。这表明混合感染可能不会增加miR-146 a的表达。 二维空间 ).
合并来看，慢性HIV-1感染表现出较高的耗竭标记物和较高水平的miR-146 a，两者呈正相关。
HIV-1感染和TCR刺激均能诱导miR-146 a和衰竭标志物的表达。 我们观察到hiv-1感染后细胞株和原代单核巨噬细胞(Mdms)中miR-146 a的表达持续增加。 20 , 24 ...在此，艾滋病毒-1 NL4.3 感染Jurkat细胞时，miR-146 a水平在HIV-1感染过程中逐渐升高。 3A，b Pd-1和CTLA-4的mRNA水平在第3天达到高峰，然后下降。 3C，d ).
图3 MIR-146 a可诱导HIV-1感染和TCR刺激.Jurkat细胞感染了hiv-1 NL4-3 (p24 750 ng/ml)3 h，在PBS中洗3次，用新鲜RPMI 1640加10%FBS培养1、3、5、7天。每个处理组在指定的时间点收集细胞。( a – d 提取总RNA，对GAG、miR-146 a、PD-1和CTLA-4进行定量PCR分析。用PMA和离体霉素刺激Jurkat细胞。 e )miR-146 a水平，耗竭标记物( f )PD-1和( g )CTLA-4和细胞因子( h )IL-2，( i 用定量聚合酶链反应法检测不同时间点的肿瘤坏死因子-α、(J)干扰素-γ.每个实验进行三次，结果显示为相对于对照样本的平均褶皱变化。*p<0.05，**p<0.01。
然而，我们想知道如何在抑制性抗逆转录病毒治疗(ART)成功限制病毒复制的慢性患者中诱导miR-146 a。事实上，持续的免疫激活是hiv发病机制的一个核心特征，尽管早/晚启动了art。 25 ...免疫激活在非艾滋病临床事件(抗逆转录病毒治疗人群发病和死亡的主要原因)发病机制中的作用日益受到关注。 26 ...报道Mir-146 a在CD4+T细胞和CD8+T细胞活化的T细胞分化过程中表达。 15 , 27 ...因此，我们使用了Jurkat T细胞，这是一个建立良好的模型。 离体 研究TCR信号转导机制，探讨miR-146 a和T细胞基因的表达。我们首先用PMA和离体霉素处理Jurkat细胞，然后用RT-qPCR方法检测基因表达.如图所示。 3E 在PMA和离子霉素刺激下，miR-146 a水平显著升高，48h后达到平稳状态。PMA和离体霉素治疗后，Pd-1、CTLA-4、IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的mRNA水平逐渐升高。 3F-j ).
这些数据表明，不仅HIV-1感染，而且T细胞激活都有助于诱导miR-146 a和耗尽分子。
MIR-146 a抑制活化CD8+T细胞产生抗病毒细胞因子及杀伤作用 为了探讨miR-146 a对T细胞功能的潜在作用，我们接下来研究了抗HIV细胞因子的产生和人PBMC来源的原始CD8+T细胞在miR-146 a过表达中的功能状态。CD3抗体激活的CD8+T细胞经miR-146 a模拟转染后，IFN-γ、IL-2和TNF-α在mRNA和蛋白水平上均显著下降，而miR-146 a抑制剂则显著促进了这些细胞因子的表达。 4A )。我们还观察到，当miR-146 a过度表达时，GZMB和peforin的mRNA水平降低，内源性miR-146 a被抑制时，mRNA水平略有升高。 4B ).
图4 MIR-146 a可降低抗病毒细胞因子的产生，抑制T细胞的功能。用50 nmol/mlmiR-146 a模拟或miR-146 a抑制剂转染正常人CD8+T细胞，以随机化寡核苷酸为模拟物，在1mg/ml抗CD3中培养48h。 a 以γ为内源对照，检测转染miR-146 a模拟抑制剂和miR-146 a抑制剂后的IFN-α、IL-2和TNF-α的相对mRNA水平。ELISA法检测培养上清液中IFN-γ、IL-2和TNF-α的水平.( b 转染miR-146 a或miR-146 a抑制剂后，GZMB、穿孔素和CD107amRNA相对水平的定量PCR检测。数据显示为平均值±扫描电镜。*p<0.05，**p<0.01。
提示miR-146 a可能通过降低抗病毒细胞因子的产生和减轻细胞毒性而负调控CD8+T细胞的功能。
体外 中和miR-146 a可提高慢性hiv-1感染者外周血单个核细胞的抗病毒能力 鉴于miR-146 a与抑制性受体呈正相关，而T细胞功能则是负调控的，我们接下来想知道，消除miR-146 a是否能恢复慢性HIV-1感染者受损的T细胞功能。我们将miR-146 a抑制剂转染到24例慢性HIV-1感染者的PBMC中，发现IFN-γ、IL-2和α等抗病毒细胞因子水平明显升高(图一)。 5A-C )。IFN-γ和IL-2蛋白水平持续升高(P<0.0 5). 5D，e 肿瘤坏死因子-α蛋白水平无显着性差异(图二)。 5F )。同时，抑制性受体水平显着降低(图一)。 5G-j )。此外，CD107a、GZMB和穿孔素水平均有升高(图1)。 5K-m ).
图5 miR-146 a的阻断增加了慢性HIV-1感染者抗病毒基因的产生，降低了衰竭标记物。用50 nmol/ml miR-146 a抑制剂或随机寡核苷酸作为模拟物转染慢性HIV-1感染者PBMC 24例(n=24)。( a – c 以γ为内对照，用定量RT-PCR法测定慢性HIV-1患者外周血单个核细胞中IFN-α、IL-2和TNF-α的相对水平。( d – f ELISA法检测IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌.定量PCR检测pd-1、CTLA-4、Tim-3和延迟-3 mRNA的相对水平( g – j )和CD107a、GZMB和穿孔素( k – m )慢性HIV-1患者外周血单个核细胞mRNA相对水平，以GAPDH作为内部对照。数据显示为平均值±扫描电镜。
这些数据表明 体外 阻断miR-146 a可以恢复慢性HIV-1患者免疫细胞受损的功能。
慢性hiv-1感染者外周血c-fos水平下降，与miR-146 a有关。 先前的研究表明，一种不能与AP-1协同作用的基因工程nfat强烈地导致了精疲力竭。 28 强调AP-1在CD8+T细胞衰竭中的作用。c-fos的ap-1转录因子亚单位在慢性感染过程中下降。 28 , 29 ...因此，我们评估了慢性HIV-1感染者和健康对照者PBMC中c-Fos的水平.慢性HIV-1感染者外周血单个核细胞c-Fos mRNA水平低于早期组(P<0.05)。 6A 与健康对照组比较，差异有显着性(P<0.05)。 6B )。随机抽取5例健康献血员、5例早期组和5例慢性期患者外周血单个核细胞标本，检测c-Fos蛋白水平，发现慢性组c-Fos表达下调(图一)。 6C )。我们进一步发现，慢性HIV-1感染者外周血单个核细胞c-FosmRNA水平与miR-146 a呈负相关(r=−0.2555；P=0.0416)。 6d ).
图6 慢性HIV-1感染者外周血单个核细胞c-Fos表达下降.( a )定量PCR检测早期(48例)和慢性期(64例)HIV-1感染者PBMC c-Fos mRNA的相对水平。( b CD4+T细胞计数<350细胞/μ1组(n=40)和CD4+T细胞计数≥350细胞/μ1组(n=24)与健康对照组(n=35)比较，c-FosmRNA水平均低于正常对照组(n=35)。( c 健康对照组(n=5)、早期(n=5)和慢性期(n=5)PBMC c-Fos蛋白水平的Westernblotting分析。( d 用Spearman相关检验(n=64)分析c-Fos mRNA与miR-146 a表达的相关性。给出了相关系数(R)和p的值。( e )用50 nmol/ml miR-146 a模拟物或miR-146 a抑制剂转染正常人CD8+T细胞48 hc-Fos表达。( f 将50 nmol/ml miR-146 a抑制剂或随机寡核苷酸作为模拟载体转染24例慢性HIV-1感染者PBMCs，定量RT-PCR法检测c-Fos mRNA水平。*p<0.05，**p<0.01。
这表明c-Fos是miR-146a的潜在靶点.我们观察到原代CD8+T细胞经miR-146 a模拟转染后c-Fos蛋白水平略有下降，miR-146 a抑制剂转染后c-Fos略有升高。 6E )。然后我们怀疑miR-146 a的中和是否能恢复c-Fos在病人中的表达.用miR-146 a抑制剂转染慢性HIV-1感染者外周血单个核细胞后，c-FosmRNA表达明显增加(图一)。 6f )，但蛋白质水平无明显变化(补充图)。 1 ).
这些数据表明miR-146 a可能部分通过抑制c-Fos而导致免疫衰竭，这可能是间接的。
