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与先天性脊柱侧弯有关的新型FBN1变异

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发表时间:2019-12-11 16:50作者:武汉新启迪Xinqidibio来源:www.qidibio.com

先天性脊柱侧弯有关的新型FBN1变异

摘要

先天性脊柱侧弯(CS)是由先天性椎骨畸形引起的脊柱侧弯的一种形式。遗传易感性已在CS中得到证明。我们以前曾报道过TBX6功能丧失导致复合杂合模型中的CS。但是,此模型只能解释CS的10%。许多单基因和多基因CS基因仍有待阐明。在这项研究中,我们分析了615例中国CS的外显子测序(ES)数据,这些数据涉及脊柱侧凸和合并症(DISCO)项目。对103个家族性CS进行的族聚研究确定了FBN1中一个新的杂合性无义变异体c.2649G> A(p.Trp883Ter)然后通过提取FBN1来分析FBN1和CS 之间的关联来自574个散发CS和828个对照的ES数据的变体;确定了30种新的变体并确定了优先顺序,以进行进一步分析。突变负荷测试表明,有害的FBN1变异在CS受试者中显着丰富( 根据Fisher精确检验,OR = 3.9,P = 0.03)。在两个不相关的CS受试者中复发了一种错义变体c.2613A> C(p.Leu871Phe),该变体的体外功能实验表明FBN1可能通过上调转化生长因子β(TGF-β)信号传导来促进CS 。我们的研究扩大了FBN1的表型谱,并为CS的病因学提供了新的见解。

介绍

先天性脊柱侧弯(CS)是由先天性椎骨畸形引起的脊柱侧弯的一种形式,可能是由于形成失败,分割缺损或两者兼而有之[ 1 ]。CS的患病率为每1000例活产约0.5–1 [ 2 ]。作为导致婴幼儿和青少年残疾的主要原因,CS会在生理和心理上扰乱患者的生活和日常活动[ 3 ]。

遗传倾向已被证明在CS [ 45 ]。CS是单基因突变的结果。我们以前曾报道过杂合的16p11.2缺失或罕见的TBX6功能丧失(LoF)变体,以及由三个SNP组成的常见的亚型风险单倍型,导致反式 CS [ 6 ]。我们随后在基因编辑的小鼠中概括了这种化合物的杂合性模型[ 7 ],并定义了CS,TBX6相关CS(TACS)的单基因形式的独特且可临床操作的表型[ 8 ]。然而,该模型可以解释CS [只有约10%89]。许多其他贡献者基因仍有待阐明。

CS也是多因素基因-环境相互作用的结果[ 10 ]。在CS病例中已经说明了一些多基因缺陷的易感性,并伴有多个先天性缺陷[ 11 ]。先前的研究报道了几种与CS相关的基因,包括PAX1(MIM#167411)[ 12 ],PTK7(MIM#601890)[ 13 ],DLL1(MIM#606582)[ 14 ],DDR2(MIM#191311)[ 15 ] ,T(MIM#601397)[ 16],因此迄今为止,许多其他基因会导致涉及脊柱侧凸和椎骨畸形的表型。但是,它们对CS的潜在贡献尚未得到充分研究。

在这里,作为涉及脊柱侧凸和合并症的解密障碍(DISCO)项目的一部分,我们为CS人群进行了外显子组测序(ES)。对家族病例的基于三重分析的结果在FBN1中发现了一个新的无意义变异,该变异与Marfan综合征(MFS; MIM#154700)有关,并伴有脊柱侧凸和脊柱发育不良的许多单基因疾病。然后,我们检查了罕见的FBN1变体对散发CS 的影响,并观察到有害的错义变体在CS中显着富集。复发性FBN1错义变体的功能分析揭示了转化生长因子β(TGF-β)信号转导与CS之间的潜在关联。携带高度有害的FBN1的受试者 变异体有椎骨畸形,肋骨畸形和脊柱内缺损。

材料和方法

参加者招募

最初,2010年至2018年,作为DISCO研究的关键部分,从中国北京协和医院(PUMCH)招募了615名具有完整临床数据和ES数据的中国CS受试者(http://www.discostudy.org/) 。有103例家庭病例,可提供一级亲属的样本。TBX检查6突变和41案件分子诊断为TACS [ 68]被删除。因此,保留了574例CS病例供进一步研究。对于对照对象,确定了828名无明显脊柱畸形的无关中国人。PUMCH的伦理委员会或机构审查委员会对患者样本做出了贡献,批准了该研究。已从每个参与者或其监护人(针对16岁以下的参与者)获得书面知情同意。

外显子组测序和Sanger测序

使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)从外周血样品中提取基因组DNA。如前所述[ 17 ],使用PUMCH管道对ES数据进行了处理和分析以下公共可用数据库用于突变注释:1000基因组计划(1KG;http://www.internationalgenome.org),外显子组测序计划(ESP;http://evs.gs.washington.edu/EVS/),外显子组聚集协会(ExAC; http://exac.broadinstitute.org/)和基因组聚集数据库(gnomAD; http://gnomad-old.broadinstitute.org),单核苷酸多态性数据库(dbSNP; https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)。在计算机预测工具中,包括从容忍排序(SIFT)[ 18 ],多态性表型v2(Polyphen-2)[ 19 ],突变体测试[ 20 ]和组合注释依赖耗竭(CADD)[ 21 ]来进行预测变体的有害特性。我们还使用基于人类基因突变数据库(HGMD; www.hgmd.cf.ac.uk/)的定制数据库和Man在线孟德尔遗传(https://omim.org/)。根据经验,在进行关联分析之前,我们利用了Genome Analysis Toolkit(v2.2-3)的推荐过滤器,以确保将假阴性的风险降到最低,从而选择通过质量控制的变异体[ 22 ]。使用Applied Biosystem 3730xl DNA分析仪(美国加利福尼亚州生命技术公司)进行桑格测序,以确认通过ES鉴定的候选变体,并在家庭成员中进行分离分析。我们用于突变命名FBN1的转录本和相应蛋白同工型的RefSeq登录号分别为NM_000138.4和NP_000129.3。

突变负担分析

在574例CS病例和828例对照之间进行了FBN1的突变负担分析为了减轻归因于差异测序覆盖率的偏见因素,我们在病例和对照外显子组之间进行了协调分析。如果与具有足够位点覆盖率的对照相比,病例百分数的绝对差值相差> 10%,则将单个RefSeq编码序列位点从分析中排除。这种基于位点的修剪导致排除了4.8%的Refseq编码序列位点。我们还介绍了一种可能的基因破坏(LGD)模型[ 23]优先考虑候选变体。LGD模型是通过将LoF变体(废话,剪接位点和插入/删除)聚类定义的。损坏的错义(D-mis)模型也被用于变量优先级划分。D-mis是通过选择预测CADD得分≥20的D-mis变体来定义的。鉴于FBN1可能具有的显性特征,严格设置了纳入标准以选择大概的LGD和D-mis变体,以识别风险-将变体授予CS。目前在1KG,ESP,ExAC,dbSNP,FBN1通用突变数据库(UMD-FBN1; http://www.umd.be/FBN1/中不存在的变体[ 24]被定义为“新颖”。仅对新颖的变体进行了负担分析。我们应用了一种折叠方法[ 25 ]来检测突变负担的关联。当评估所有已知的等位基因变异时,CADD得分为20(相当于损伤的前1%)[ 26 ],被设置为创建分层崩溃的变异子组的临界值。

表达质粒的构建

我们构建了一个表达全长FBN1(GenBank:NM_000138.4)cDNA的质粒,该cDNA具有增强的绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白pEGFP-FBN1。使用KOD-Plus-Neo(日本东洋纺),对具有合适限制性酶切位点的全长FBN1 cDNA进行PCR扩增。将PCR扩增子克隆到pEGFP-N1表达载体(Clontech,Takara Bio,Japan)Nhe I和Sac II位点。Leu871Phe变体的构建体是由QuikChange Lightning定点诱变试剂盒(美国加利福尼亚州安捷伦科技公司)生成的。对所有质粒构建体进行Sanger测序以验证。

细胞培养和转染

HEK293T细胞在补充了10%FCS(Biological Industries,CT,USA)和1%青霉素/链霉素(Gibco)的Dulbecco改良Eagle Eagle培养基(DMEM)(Gibco,Waltham,MA,USA)中于37°C于5%的培养基中培养。 CO 2将细胞接种在六孔板中,并根据制造商的说明用Lipofectamine™3000转染试剂(Invitrogen,CA,美国)转染。转染6小时后,用新鲜的DMEM培养基替换培养基。将细胞进一步温育48小时。

实时定量聚合酶链反应

总RNA使用RNeasy分离®试剂盒(QIAGEN),并用RNase的DNase组(Qiagen公司)进行处理。使用PrimeScript™RT试剂盒(#RR037A,Clontech)将总RNA反转录为cDNA。靶向mRNA的相对丰度被标准化为3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。引物5'-CAAGGGCATCCTGGGCTACACT-3'和5'-CTCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3'被用于扩增GAPDH ; 使用5'-ACCTGGTTACTTCCGCATAG-3'和5'-GAGGCATCAGTTTCGTTTGT-3'来扩增EGFP-FBN1。使用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,CA,美国)在7500Fast Real-Time PCR Systems(Applied Biosystems)上测定基因表达。

蛋白质印迹分析

用修饰的RIPA(50 mM Tris-HCL,1%NP40、0.25%Na-脱氧胆酸盐,150 mM NaCl和1 mM EDTA; Complete TM蛋白酶抑制剂混合物[Roche,曼海姆,德国])裂解细胞。用Pierce TM BCA蛋白测定试剂盒(Pierce Biotechnology,Rockford,美国)测定。在8%SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离出总共5 mg的蛋白质,并将蛋白质电泳并转移到硝酸纤维素膜上。在室温(RT,25°C)下,将膜在奶粉中封闭30分钟,然后封闭一抗(Phospho-Smad2 [Ser465 / 467](138D4)Rabbit mAb#3108,Cell Signaling Technology,MA,美国; Smad2 / 3 [D7G7] XP ®Rabbit mAb#8685,细胞信号技术;将小鼠抗β肌动蛋白单克隆抗体(TA-09,ZSGB-bio,China)在4°C下孵育过夜。洗涤后,将相应的辣根过氧化物酶偶联的IRDye ® 800CW的山羊抗小鼠IgG二抗(926-32210,LI-COR,NE,USA)中在室温下孵育1个小时。用WesternBright ECL HRP底物化学发光系统(Advansta,CA,美国)观察条带。化学发光信号使用ImageJ进行量化[ 27 ]。

统计分析

使用SPSS Statistics 23.0(SPSS Inc.,Al Monk,NY,USA),使用单面Fisher精确检验或单面卡方检验进行所有突变负荷分析,并使用Student t检验进行比较qPCR和WB结果的差异。对于每个单一测定,所有细胞实验均用不同的细胞裂解物独立重复3次,数据以平均值±SEM表示。P <0.05被认为具有统计学意义。

结果

CS系列中传输的新型FBN1空变体的鉴定

我们应用ES来鉴定所有103个家族性CS中具有常染色体显性遗传的负责任变体。我们确定了一个家族中与椎体表型相关的母亲遗传的LGD变异。新型杂合的LGD变体是FBN1中的 c.2649G> A(p.Trp883Ter),它与CS在一个显性家族中共同分离(图   1a,b)。无意义的变体被认为通过触发无意义的介导的mRNA衰变机制并随后失去FBN1蛋白而发挥了显着的LoF作用。先证者III-1表现为CS,具有椎骨的结构性分割缺陷(T10-L1)和左侧形成椎骨(T10-L1)(图   1c),而母亲II-2则表现出严重的先天性后凸。具有分割缺陷(图。 1d)。尽管在先证者中发现了具有轻度二尖瓣关闭不全的二尖瓣脱垂,但在先证者及其母亲中未发现其他以MFS为特征的明显心血管或眼表型。通过超声心动图测量,先证者的主动脉根部测量结果仍然保持正常(Z评分= 1.4),并且无法根据根特标准[ 28 ] 进行MFS的诊断到目前为止,在家庭成员中还没有观察到明显的“马凡达”外观。即,III-1和II-2(补充表   1)。

图1:患有先天性脊柱侧弯和FBN1废话的家庭,c.2649G> A(p.Trp883Ter)。
图1

变种谱系和隔离。b Sanger测序的电泳图显示先证者(III-1)和他的母亲(II-2)中的杂合c.2649G> A。参考,参考序列。黑色箭头指示核苷酸取代位置。c先证者III-1整个脊柱的前后X线平片显示先天性脊柱侧弯,胸椎10腰1脊椎有节段性缺损,左侧形成脊柱。d II-2整个脊柱的X线侧片显示严重的先天性后凸畸形,并伴有节段性缺损。

此外,我们在任何家族成员中均未观察到除FBN1 p.Trp883Ter 以外的任何LoF变体

FBN1新的有害编码变体在CS患者中丰富

关于FBN1和CS 之间的潜在关联,我们进一步比较了散发性CS病例与对照之间FBN1变异的频率差异随后,我们在574例CS病例中的16例和828例内部对照中鉴定了30种新颖的变体(28个错义,1个移码和1个剪接变体)。当通过折叠法评估所有30个变体时,未观察到与CS的显着相关性(OR = 1.6,P 通过单面卡方检验= 0.15)。接下来,根据由CADD分数确定的有害性对变异进行分层。在CADD得分<20的组中,总共对19个变异进行了折叠分析,没有突变类型分层,也未发现统计学差异。基于突变类型在该组内的进一步分层在任何突变类型上均未显示任何统计学差异(表   1)。相比之下,在CADD得分≥20的组中,总共鉴定出11个错义变体。CS分别为8个和控件为3个。八种错义变体(包括一种复发变体)的CS含量显着丰富( 单面费舍尔精确检验,OR = 3.9,P = 0.03)(表   1)。补充图1显示了这8种情况的Sanger测序结果   有趣的是,我们还检查了我们研究中FBN1突变,但未发现Buchan等人报道的特发性脊柱侧凸人群有任何重叠的变异。[ 29 ]。

表1 先天性脊柱侧弯FBN1变异的突变负荷分析

携带候选变异的CS个体的遗传和表型分析

2列出了这8个变体的遗传信息和计算机毒害预测   一种错义变异:p.Leu871Phe(CADD分数= 23.9)在两名无关的CS受试者中复发。Leu871位于蛋白质的杂合2基序区域内(图   2),这是TGF-β结合蛋白样(TB)和钙结合表皮生长因子样(cbEGF样)之间的进化“杂交体”。域[ 30 ]。先前的研究表明,位于该结构域内的突变破坏了α-螺旋与β-折叠的比例,从而导致了更为紧凑的构象[ 31 ]。此外,FBN1中Leu871氨基酸残基的保守性分析指出在整个进化过程中以及在许多选定物种中它都是高度保守的,表明它是蛋白质正常功能所必需的(图   S2)。预测具有高度有害特性的其余六个错义变体位于表皮生长因子样(EGF样)域或cbEGF样域(图   2)中,在疾病中起着重要作用[ 32 ]。

表2 先天性脊柱侧弯的候选FBN1变体。
图2:先天性脊柱侧凸中鉴定出的候选FBN1变异体的分布示意图
图2

从UMD-FBN1数据库重新绘制蛋白质结构。黑点表示错义和无意义变体的位置。

携带FBN1变异体的8位受试者表现出不同类型的椎骨畸形(表   3)。在三名受试者中也发现了肋骨畸形(表   3)。值得注意的是,在五名受试者中发现了椎管内缺损(反义肌,脊髓空洞症和系绳)(表   3)。尽管XH902中出现了轻度的二尖瓣关闭不全和眼睑肉眼畸形,但主动脉根部测量仍保持正常(Z评分= 1.6),并且不存在支持MFS的眼表型。该患者将被归类为“潜在MFS”,直到主动脉达到阈值(Z评分= 3)[ 28]。其余7名受试者无心血管或眼部表现(表   3),因此未诊断为MFS。我们还重新评估了这8例患者的其他玛方形肌肉骨骼表型,并观察到除了XH902伴有肉眼食管畸形的患者以外,没有明显的表现(补充表   2)。

表3具有有害FBN1错义变异的先天性脊柱侧弯受试者的表型表现

复发性变体Leu871Phe的功能研究

我们在HEK293T细胞中过表达人类FBN1野生型或p.Leu871Phe。转染后48小时,总RNA被逆转录为cDNA。p.Leu871Phe FBN1的mRNA表达水平与WT质粒无统计学差异( Student's t检验P = 0.38 )(图   3a)。

图3:重复性错义变体c.2613A> C(p.Leu871Phe)的功能分析。
图3

a用空载体(EV),野生型(WT)或突变(p。Leu871Phe:L871F)FBN1质粒转染的HEK293T细胞FBN1 mRNA 的表达ns不重要。b蛋白裂解物的蛋白质印迹。c,d定量蛋白质印迹结果。显示磷酸化的Smad2和总的Smad2与β-肌动蛋白的比例相对于WT质粒标准化。数据以任意单位表示,表示三个独立实验的平均值±SEM。通过Student's t检验计算统计学显着性,* P  <0.05。ns不重要。

先前的研究表明,有害的FBN1突变会上调内源性TGF-β信号传导,这可以通过下游目标Smad2(p-Smad2)的磷酸化来测量[ 33 ]。与WT相比,p.Leu871Phe FBN1转染的细胞显示p-Smad2水平显着升高( Student's t检验P = 0.02 )(图   3b–d),而与WT相比,它们在总Smad2表达上没有统计学差异WT( Student's t检验P = 0.96 )。

讨论区

在本研究中,我们进行了基于家庭的ES分析和基于等位基因的突变负荷分析,并为FBN1和CS 之间的遗传关联提供了证据然后,我们对复发的FBN1变异体(p.Leu871Phe)进行了体外功能分析,并揭示了由该变异体引起的TGF-β信号转导上调。对于CS例临床特点FBN1变体显示出了扩大FBN1-相关疾病实体。

FBN1编码一种结缔组织蛋白,它是真皮成纤维细胞和骨骼肌细胞中细胞外微纤维组织必不可少的[ 34 ]。FBN1是MFS的致病基因,众所周知,它经常脊柱侧弯而没有椎骨和肋骨的结构变化。另一方面,FBN1突变也会引起各种骨骼发育异常,包括肢端发育异常(MIM#102370),凝胶体发育异常2(MIM#614185),马凡氏脂肪营养不良综合征(MIM#616914)和Weill-Marchesani综合征2(MIM#608328) )。这些单基因疾病具有广泛的椎骨表型,与MFS完全不同。在先前的研究中,一种新颖的FBN1p.Gly1796Glu的变体,在没有心脏或眼部发现的情况下共分离为一个具有CS常染色体显性遗传性椎体发育不良的家族[ 35 ],表明FBN1可能是CS单基因形式的疾病基因。我们的案例还证实,FBN1导致CS作为常染色体显性疾病特征模式。

在我们的研究中,索引病例来自一个不寻常的三代CS家族,分离的FBN1 LoF变体c.2649G> A(p.Trp883Ter),先前已报道是与MFS相关的致病性无意义突变[ 36 ],并且存放在HGMD中(登录号:CM161831)。这种无意义的取代将蛋白质截断为883号密码子,该密码子距离蛋白质末端1989个氨基酸。根据ACMG对致病变体进行分类的指南[ 37 ],基于以下证据,该无义突变是令人信服的致病性LoF等位基因:(a)PVS1:该无义变体在已知LoF FBN1基因内部被解释机制[ 38]; (b)PP1:在受影响的家庭成员中与CS表型共分离;(c)PP3:多种计算证据支持高度有害的属性(Mutation Taster预测显示有害; GERP的保守性预测得分为4.81; CADD得分为42);(d)PP5:Franken等。最近,该变异被报道为与MFS相关的致病性LoF等位基因,但尚无关于脊髓/椎骨表型的详细评估[ 36 ]。值得注意的是,已广泛报道与FBN1变异体相关的高度临床变异性例如,提出了独特的遗传机制,包括另一个基因中的第二个有害变异体或涉及修饰位点的多基因模型,以解释这种临床变异性[ 39]。]。因此,FBN1中病原体变异的发生不一定与MFS相关或不会产生MFS。与我们的发现一致,一些FBN1的无意义突变(c.284C> A,p.Ser95Ter; c.1347_1348dupTA,p.Thr450IlefsTer130)仅引起孤立的骨骼特征,没有心脏或眼睛的发现[ 40 ]。病原性FBN1体会引起MFS,但也可以在表现出明显孤立特征的患者中发现。例如,c.1453C> T,P。(Arg485Cys)在突变FBN1已经在这两个确定的常染色体显性和隐性疾病,其特征在于表型变异性[高程度4142]。因此,有理由推测,与MFS相关的c.2649G> A等位基因也可以解释我们研究中的孤立CS。

FBN1与椎骨的生长和发育有关[ 43 ]。小腿中的原纤维蛋白微纤维普遍分布在椎骨生长板中,并参与生长因子的结合,在调节骨生长中起着关键作用[ 43 ]。此外,具有Fbn1基因内复制的小鼠模型显示腰椎明显增大,肋软骨延长[ 44 ]。Fbn1 Tsk小鼠的功能性随访揭示了FBN1与Wnt信号通路的相互作用[ 45 ]及其在体发育和脊椎动物分割中的关键作用[ 4]]。由于CS是由椎体发育的局部变化引起的[ 46 ],因此我们提出扭曲脊柱正常定位过程的因素可能有助于CS的发病,例如FBN1

TGF-β在骨骼的发育和维持中起着至关重要的作用[ 47 ]。共享p.Leu871Phe变体的两名无关患者(XH73和XH579)表现为CS伴有椎骨节段缺损,肋骨异常和Diastematomyelia。我们的体外实验结果显示p.Leu871Phe变体对TGF-β信号的上调,支持突变的致病性。TGF-β信号传导在软骨和脊柱组织发育中起着至关重要的作用,椎间盘内TGF-β信号传导通路的上调可能会导致椎骨融合[ 48]]。观察结果表明,TGF-β信号通路的上调赋予了对CS的易感性。在现有报道,过量TGF-β激活和信号经常被中观察到FBN1缺陷型人类和小鼠[ 2949 ]。

对于具有复杂疾病特征的CS的突变负担测试,最重要的事情不是不成比例地专注于特定变体,而是整合所有类型的与风险相关的变体。在一些个体中,风险可以通过共同的变体和稀有变体,如TACS化合物继承模型[的不同寻常的结合引起的678 ],而在其它情况可能是由于稀有或超罕见变体的累积。在这种情况下,在通过折叠方法检测关联之前,通过突变类型和CADD C分数FBN1变体进行分层似乎是可行的[ 25]。有关CS相关变体的知识以及可变的遗传外显力将为遗传咨询和评估变体携带者的亲属开辟道路。

总之,我们的观察表明FBN1可能是CS的易感基因,将我们的知识扩展到CS表型中的易感基因和候选基因的现有列表。为何FBN1基因中的独特突变可以传达一系列连续的骨骼疾病,从重叠的特征到不一致的表型,仍是未知的可能需要进行进一步的研究,重点是研究FBN1的多效作用的潜在机制




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