在血液病中，急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)分别是儿童和老年人最常见的白血病。有些患者对化疗没有反应，有必要辅以免疫治疗，如嵌合抗原受体(CAR)治疗，这是治疗这些癌症和B细胞淋巴瘤的最新和更有效的治疗方法之一。虽然完全缓解的结果是有希望的，CAR T细胞治疗仍然给患者带来一些风险，包括细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性。我们提出了一种不同的免疫细胞来源的CAR治疗，可以防止这些副作用，同时有效地针对恶性细胞。不同来源的NK细胞不引起移植物抗宿主病(GvHD)，是一种很有前途的CAR治疗工具，在未预先致敏的情况下可迅速攻击癌细胞。研究成人外周血(AB)和脐带血(CB)NK细胞对不同靶细胞的杀伤作用，以确定CAR治疗的最佳来源。AB、CAR-NK细胞对CD 19呈现性靶细胞的杀伤略好，CB NK细胞易于刺激，且供者与供者的数量比较稳定。我们的结论是，这两种来源的车载NK细胞都有其优势，可作为汽车治疗的替代和更安全的选择。

B细胞性血液病，如白血病和淋巴瘤，是全世界儿童和成人癌症的常见形式。急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童最常见的癌症，发病率占所有病例的20-25%。1...最近的结果显示，整个反应接近90%。这些结果在成年人中是非常不同的，在那里5年无病生存率下降到40%。2...慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种常见的B细胞慢性淋巴增生性疾病，主要影响老年人。这些患者5年生存率为79.2%，但在许多患者中仍是一种不治之症。3...单纯化疗仅对25-45%的成人患者有效，因此在难治性患者中加入免疫治疗是提高所有治疗效果的需要。4...对血液病有不同的免疫治疗方式，如单克隆抗体、双特异性T细胞抗体、异基因造血干细胞移植(HSCT)和嵌合抗原受体(CARS)。5,6,7,8.

近年来，免疫疗法作为治疗晚期难治性癌症的一种新的常规治疗方法应运而生。事实上，最有希望的细胞疗法之一是最近在2017年10月被食品和药物管理局(Fda)批准的：治疗复发性B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)的Tisagenlecleucel(Tisagenlecleucel)。不久后，FDA批准Axicabtagene Ciloleucel治疗复发或难治性大B细胞淋巴瘤。这两种药物都是基于嵌合抗原受体(CAR)的T细胞疗法。9...最近(2018年6月)，欧洲药品管理局(EMA)在欧洲批准了这些产品。

car是由来自抗体的胞外单链可变片段(Scfv)组成的重组受体。10或者是一种全长抗体11，连接到T细胞受体的胞内T细胞信号域。这个细胞内区域是CAR的一个重要部分，因为我们根据细胞内区域的不同部分对它们进行了几代的分类。第一代CARS只有一个CD3ζ信号域，而第二代CARS与其他共刺激分子(通常是CD 28)一起具有CD3ζ信号域。12...因此，我们可以以不依赖人类白细胞抗原的方式，将T细胞特异性重新定向到肿瘤。13...CAR改良T细胞治疗在治疗血液病方面取得了令人印象深刻的成功.以CD 19为靶点的CAR T细胞治疗ALL患者的完全应答率为70%~90%。14...然而，基于CAR T细胞的治疗存在一些缺点：第一，从患者身上产生一种自体产品是很困难的；第二，产生CAR-T细胞的时间使这种治疗不适合侵袭性疾病患者；最后，有时不可能从严重预处理的淋巴细胞减少患者产生临床相关剂量的CAR-T细胞。此外，使用CAR T细胞疗法有两个主要风险：细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性。15使用同种异体源进行治疗的选择会造成严重移植物抗宿主病(Gvhd)的风险。16,17当患者无法获得T细胞时。

尽管car T-细胞很受欢迎，但NK细胞可能是汽车治疗的一个有趣的来源，因为NK细胞具有分解感染或恶性细胞的内在能力，而没有预先激活或人类白细胞抗原(Hdna)限制。18...人NK细胞在淋巴细胞群中表现为CD3、−、CD 56+细胞。19...他们还表达了克隆分布的抑制剂受体，称为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Kir)，这些受体识别HLAⅠ类等位基因所共有的同种类型决定因素(kir配体)。20...当发生单倍相合的KIR配体错配时，NK细胞作为抗白血病效应细胞发挥主要作用，与NK治疗有较好的疗效相关。21,22...NK细胞存在于外周血和脐带血中。23它们也可以从干细胞来源，脐带血造血干细胞中获得。24,25人多能干细胞(HIPS)26...它们可以扩展到临床范围，允许产生足够的细胞来进行免疫治疗。27,28...因此，同种异体NK细胞可以用作效应细胞，因为它们在增强移植物抗白血病(Gvl)的同时不诱导gvhd。29...此外，与CAR T细胞相比，car-nk细胞可能更安全，因为它们通常不会引起细胞因子风暴。30,31,32...由于NK细胞具有较短的寿命和较高的杀伤细胞活性，是一种很有吸引力的治疗方法。33...此外，脐血(CB)NK细胞在存在同种抗原或外源性细胞因子的情况下，比成人外周血(AB)NK细胞具有更好的增殖能力。34.

综上所述，本研究旨在评价不同来源的CAR-NK细胞对CD 19表达白血病细胞的疗效。我们检测了成人血(Ab)和脐带血(Cb)中的NK细胞，因为研究表明cb细胞的抗癌活性高于其他来源，这为cb衍生免疫疗法和脐血库的应用提供了理论依据。35.

用T细胞设计的CD 19 CAR可以成功地转化AB-NK细胞和CB-NK细胞。

磁性细胞分离后，以阴性选择从AB或CB PBMC中分离NK细胞。CD 56+NK细胞纯度AB为92.68±2.90，CB为91.46±5.14。用IL-2和IL-15培养NK细胞8d，再与CD 19 CAR转导。NKp 46水平在培养的第0天至第7天均显著升高。事实上，CB NK细胞比AB NK细胞有更强的刺激作用(附图)。1)。在此之后，两种来源的NK细胞在进行功能测试前再进行一周的培养(补充图)。2)。我们从CB中分离出的细胞比从AB中获得的细胞要多(见图)。1A)。我们还研究了分离一周和两周后AB和CB NK细胞的折叠扩张。在第一周，两种来源的扩张相似；然而，两周后CB NK细胞的皱襞扩张略高(见图)。1B)，虽然两种细胞来源之间没有显著差异。转染后7d，AB和CB NK细胞的存活率分别为78.85%±10.18%和76.2%±5.3%。在这两种情况下，随着时间的推移，存活率逐渐下降，直到第28天，两种细胞来源的存活率都显著下降到20%左右。然而，与两种细胞来源的模拟条件相比，CAR的存在既不影响AB NK细胞的存活，也不影响CB NK细胞的存活。1C)。ABCAR-NK转导效率平均为47.46(62.6%~20.2%，n=12)，CB CAR-NK转导效率为46.8(79.7%~18.1%，n=12)。AB和CB NK细胞的转导效率无统计学差异(图5)。2)。我们研究了CAR介导的NK细胞在转染后28天内表达的稳定性。流式细胞仪每7天检测一次，CAR表达从40%稳定下降到20%。3).

(a)从150×10开始从AB和CB PBMC分离得到的NK细胞总数6PBMC条形图代表平均值，误差条代表扫描电镜。(b)培养1周和2周后，AB(n=5)和CB(n=5)的NK细胞增殖倍数。在第一周，NK细胞尚未被转导。第2周，半数NK细胞被CD 19-CAR转导，另一半未转导(模拟)。条形图代表平均值，误差条代表扫描电镜。(c)CD 56+在转染后7天、14天、21天和28天(AB=4，CB n=4)来自AB(n=12)和CB(n=12)的非转导(模拟)(左)和转导(右)NK细胞中的存活率。条形图代表平均值，误差条代表扫描电镜。数据进行双向方差分析。p-价值：*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.001. ****p < 0.0001.

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(a流式细胞术分析显示左侧CD 56+细胞无转导(MOD)和右侧CD 19-CAR转导的百分率。AB NK细胞代表以上，CB NK细胞代表以下。(bCD 56+转导NK细胞的百分比分别为AB(n=12)和CB(n=12)。条形图代表平均值，误差条代表扫描电镜。

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转染后不同时间，AB和CB中CD 56+转染细胞的百分比。第7、14、21和28天AB(n=4)，CB(n=4)。符号表示平均值，误差条代表SEM。采用学生t测验对数据进行分析。P-值：*p<0.005，**p<0.005，**p<0.001。*p<0.0001。

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CD 19-car介导两种来源的NK细胞在遇到CD 19表达细胞后脱颗粒

用表面CD107a检测CD 19-CAR NK细胞对CD 19表达细胞的脱颗粒能力。用K 562、NALM-6靶细胞、ALL和CLL细胞刺激NK细胞。K 562靶细胞不表达CD 19作为内对照。如预期的那样，无论是否有CD 19-CAR，AB和CB NK细胞在K 562存在时都表现出类似的脱颗粒活性。一方面，当接触CD 19阳性细胞时，AB CD 19-CAR NK细胞的脱颗粒率明显高于未转染的AB NK细胞(图1)。4A)。另一方面，当接触CD 19阳性细胞时，CB CD 19-car NK细胞的脱颗粒率明显高于未转染的CB NK细胞(图1)。4B)。AB和CB NK细胞脱颗粒率无显着性差异(图5)。4C).

(aCD107a(脱颗粒标记物)在模拟(非转导)和CD 19-CAR AB NK细胞中的表达(n=12)(n=12)，NALM-6(n=12)，所有细胞(n=11)和CLL细胞(n=9)，均为CD 19阳性细胞。(bCD107a在模拟(非转导)和CD 19-CAB NK细胞中的表达(n=12)(n=12)，NALM-6(n=10)，ALL细胞(n=10)和CLL细胞(n=12)。(c)比较AB CD 19-CAR NK细胞和CB CD 19-CAR NK细胞对K 562和CD 19表达靶细胞的杀伤活性。条形图代表平均值，误差条代表扫描电镜。采用多元比较的双向方差分析方法对数据进行分析。p-价值：*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.001. ****p < 0.0001.

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CD 19-car转导的NK细胞对CD 19表达细胞的杀伤作用更强。

然后我们测试了非转导和CD 19介导的NK细胞(效应细胞)在不同靶细胞存在下的杀伤活性：靶细胞比率不同(见材料和方法)。与以往一样，K 562靶细胞作为内对照，未转染NK细胞与转导NK细胞的靶细胞裂解无明显差异。而AB和CB CD 19-CAR NK细胞对表达CD 19的靶细胞(如NALM-6、ALL细胞和CLL细胞)的杀伤效果优于未转染的NK细胞。AB CD 19-CAR NK细胞对NALM-6的杀灭率为10：1，均为10：1和5：1，CLL的杀伤率为1：1。5A)。另一方面，以10：1和5：1的比例裂解CLL细胞时，CB CD 19-CAR NK细胞明显增多(图1)。5B)。AB和CB CD 19-CAR NK细胞杀伤能力的比较，除CLL为1：1外，差异均无显着性，其中AB CD 19-CAR NK细胞表现出较强的杀伤活性(图一)。5C).

(a)模拟(非转导)和AB CD 19-CAR NK细胞在不同比例下对不同靶细胞的杀伤率。在已建立的细胞系(NALM-6，n=6)和原代细胞(ALL=4，CLL n=6)中，以K 562为对照，分离细胞图。(b)模拟(非转导)和CB CD 19-CAR NK细胞在不同比例下对不同靶细胞的杀伤率。以建立的细胞系(NALM-6n=6)和原代细胞(ALL=4，CLL n=6)和K 562作对照。(c)比较AB模拟和CD 19 CAR NK细胞、CB模拟(非转导)和CD 19 CAR NK细胞对K 562和CD 19表达靶细胞的杀伤活性。符号表示平均值，误差条代表SEM。采用多元比较的双向方差分析方法对数据进行分析。P-值：*p<0.005，**p<0.005，**p<0.001。*p<0.0001。

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CARS是一种嵌合受体，能改变免疫细胞的特异性和功能，通常是T细胞。36...CAR-T细胞治疗是治疗针对CD 19+恶性肿瘤(如ALL和CLL)的一种成功的免疫治疗方法。所有患者在接受car-T细胞治疗后，≈的完全应答率(CR)分别为单中心试验的90%和多中心试验的≈的70-80%。37,38,39...尽管治疗取得了成功，但一个重要的问题是巨大的细胞因子反应所产生的毒性，这种反应导致了所谓的细胞因子释放综合征(CRS)。40,41，以及移植物抗宿主病(GvHD)在同种异体治疗中的潜在发展。42,43...事实上，为了克服这些副作用，目前在美国进行了独特的CD 19 CB-NK细胞临床试验(NCT 03056339)。

在这项研究中，我们推测来自不同来源的NK细胞可能是汽车治疗的潜在选择，因为由于非mhc限制识别，gvhd的发展风险很低。44...此外，NK细胞在循环中的持续时间较少，因为它们的寿命较短，这可能导致病人的B细胞耗竭较轻。45...就细胞数量而言，NK细胞占AB的10%，占CB的30%。46在这两个来源，产生足够数量的NK细胞，这种免疫治疗是可行的。在这两个细胞源中CD 56明快和CD 56昏暗NK细胞，以同样的比例存在47并且含有同等水平的穿孔素和颗粒酶B，它们与NK细胞的成熟有关，在这两种情况下都会产生功能性的NK细胞。48,49...如预期50获得的CB NK细胞数高于AB NK细胞，而CB的数量变化较小。事实上，从成人外周血中提取白细胞以获得NK细胞时，可变性很大。51.

虽然先前的研究表明静息的CB NK细胞比AB NK细胞具有更小的细胞毒性。52，这些细胞被一些细胞因子刺激后，其杀伤活性提高，相当于同等处理的AB NK细胞。53...因此，我们使用IL-2和IL-15刺激这两种来源的NK细胞.IL-2增加NK细胞数量54，而IL-15则有助于存活、增殖和更高的细胞毒性。55...这两种来源的NK细胞的活性每周都有轻微的下降，直到第28天，当它被大幅度降低的时候。这可能是由于NK细胞寿命较短所致。56...虽然AB和CB NK细胞的存活率非常相似，但在每一个检查点，CB NK细胞的活性都略有增加。关于折叠扩展，众所周知，在无饲养装置的情况下，NK细胞的可接受扩展是很困难的。57...在我们的例子中，折叠扩展仍然是一个问题，因为我们没有像其他研究那样用饲养细胞来培养它们。58,59...在培养2周时，我们观察到CB NK细胞对AB NK细胞的增殖率略高于AB NK细胞，但两者之间无统计学差异。

据报道，NK细胞对感染具有挑战性，其转导效率低于10%。60...尽管如此，病毒感染方案的改进已经导致了更好的结果感染AB和CB NK细胞。ABCAR-NK转导效率平均为47.46(62.6~20.2%)，CB CAR-NK转导效率为46.8(79.7~18.1%)。一些研究小组倾向于使用NK-92细胞株而不是AB型NK细胞，以获得较好的感染率。61,62,63,64...然而，CB NK细胞已被用作CAR治疗的可靠来源，其病毒感染率与我们相似(41.6%±8.9)。60甚至更高的66.6%(范围，47.8%-87.4%)65.

比较非转导细胞和CD 19-car转导细胞的脱颗粒和细胞毒活性，我们观察到与预期的CD 19-car NK细胞相比，cd 19-car NK细胞明显增加。66,67,68...针对AB NK细胞，我们发现CD 19-CAR与所有表达CD 19的靶细胞脱颗粒有显着性差异，CAR-CD 19 NK细胞对NK细胞的杀伤效果优于未转导的NK细胞，但无显著差异。CB NK细胞在CD 19-Car与所有靶细胞的协同作用下脱颗粒效果也明显优于非转导NK细胞，但在大多数条件下，其杀伤活性明显优于非转导NK细胞。正如前面提到的，AB CD 19-car NK细胞和CB CD 19-car NK细胞在脱颗粒活性上没有显着性差异，但AB CD 19-car NK细胞在杀死表达CD 19的靶细胞方面表现稍好。由于我们使用的是一种T细胞设计的CAR，因此AB NK细胞在脱颗粒和杀伤方面的效果要好于其他使用相同CAR结构的著作。69.

虽然AB和CB NK细胞是CD 19-CAR治疗的良好候选细胞，但我们的目的是探索其他选择，以确定这种基于CAR的治疗的最佳NK细胞来源。一方面，离体cb CD 34+细胞产生的NK细胞由于其在其他研究中所表现出的良好的杀伤活性和它们更容易扩展，因此是这种治疗的好选择。70,71...此外，我们已经有自己的协议来产生这些细胞。24...另一方面，臀部的发现极大地扩大了我们的可能性。72...这就是为什么HIPS衍生的NK细胞可能是另一个细胞来源的原因。69...此外，CRISPR/Cas9技术还可以应用于CAR治疗。73.

因此，我们认为AB和CB NK细胞可能是CAR治疗的良好候选细胞。首先，AB NK细胞对CD 19表达的靶细胞反应略好；第二，cb NK细胞每单位有更稳定的细胞数，它们可以被不同的白细胞刺激，以增强离体扩张，他们的杀戮活动和生存。最后，我们认为这两种细胞来源都适合在CARNK治疗血液病的未来临床应用。

脐带血和成人血样及细胞系

脐带血(CB)和成人血液(AB)通过巴斯克生物库(Basque Biobank)采集。http://www.biobancovasco.org)根据由巴斯克伦理和临床研究委员会批准的机构审查委员会的协议。这些方法是按照批准的准则进行的。Basque Biobank符合“西班牙生物医学研究法”第14/2007号法律和第1716/2011号皇家法令规定的质量管理、可追溯性和生物安保。所有研究对象均获得书面知情同意。含有1.5×10的CB单位98×108单个核细胞被用于研究目的。24...K 562是从ATCC(CCL-243)购买的。NALM-6细胞系由巴塞罗那IDIBAPS医院免疫治疗科提供.急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞(GM 20390和GM 16726)是从Coriell公司购买的。所有细胞系均用RPMI、10%FBS、1%青霉素/链霉素、1%谷氨酸、1%NEAA和1%丙酮酸钠培养。

CLL患者样本

6例原发性慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞离体NK-汽车功能的研究。表中总结了病人的特点1.

CD-19 CAR质粒的构建及慢病毒的产生

CD 19 CAR质粒由巴塞罗那IDIBAPS医院免疫治疗科提供。抗CD19A3B1抗体(一种抗CD 19抗体)的scFv与car信号域(4-1bb和cd3z)在慢病毒载体(Pccl)的框架内克隆。74...以HEK293T为包装细胞株，通过瞬时转染HEK 293 T细胞产生慢病毒上清液。75...采集的扁豆病毒上清液保存在−80°C。

NK细胞的分离与CAR-NK细胞的产生

150×10 NK细胞6用Miltenyi Biotec公司的NK细胞分离试剂盒(分类号130-092-657)分离成年健康献血员血和脐带血PBMCs。这些细胞用RPMI、10%AB血清(创新研究公司)、1%青霉素/链霉素和1%谷氨酸进行培养。前两天，在培养基中加入500 U/ml的IL-2。从那时起，在培养基中加入20纳克/毫升的白介素-15。为检测NK细胞在培养过程中的刺激水平，采用流式细胞术检测NK细胞活化标志NKp 46在培养第0天和第7天的表达(BD生物科学，第29A1.4号)(附图)。1)。第0天，用含有上清液的载体转染NK细胞，加入6g/ml的聚丁烯和MOI 10(补充图)。2)。2 0 0 0 rpm离心1h，37°C离心，在不加入慢病毒上清液的情况下，按相同步骤进行模拟转导。第二天，NK细胞被清洗，以去除聚丁烯。当我们培养至转染后28天，含有上述细胞因子的培养基每周更换一次。用台盼蓝检测细胞活力。

流式细胞术分析

用抗CD 56 APC抗体(Biolegend，克隆MEM-188)对CB和AB的CD 56+富集细胞进行鉴定。用抗CD3 PerCP/Cy 5.5抗体(Biolegend，克隆SK7)排除残余T淋巴细胞。应用Alexa-Fluor647亲和纯化F(ab‘)2片段羊抗人IgG(H+L)抗体(CAR Ab)(Jackson免疫研究，West Grove，PA，美国)对CAR转染后6天的转染效果进行分析。此外，用抗CD56PE/Cy7和抗CD3 PerCP/Cy 5.5抗体对CAR-NK细胞进行特异性鉴定。获得了30，000至50，000项活动供分析。用FlowJo v.X.0.7(TreeStar Inc.)对种群进行了分析。

细胞毒性试验

为了检查离体来自AB和CB的CAR NK细胞对CD 19表达的靶细胞(NALM-6、ALL和CLL患者细胞)的杀伤活性我们进行了基于Calcein-AM的细胞毒性试验。24...以缺乏CD 19标记的K 562细胞为对照细胞。用15μM的Calcein-AM(生命技术C 3099)在37°C条件下培养50万个细胞30 min。这些细胞在孵育后洗过两次。用不同比例(10：1，5：1和1：1)的CB和AB的NK细胞在U底96孔板中，37°C下共培养4 h。为测定自发释放，所有靶细胞均与无NK细胞孵育。在靶细胞中加入4%的Triton™X-100(Sigma-Aldrich)即可获得总释放。每种情况下进行三重手术。孵育后，收集上清液100μ1，转移到黑色96孔板上，测定荧光素-AM释放量(激发滤光片为485±9nm；带通滤光片：530±9nm)。按[(试验释放)−(介质荧光)]−[(自发释放)−(介质荧光)]/[(总释放)−(Triton荧光)]−[(自发释放)−(介质荧光)]×10 0为计算公式。

脱颗粒试验

在37°C的24孔板中，以1：1的比例与上述靶细胞共培养4h，实验开始时加入抗CD107aBV 421(BD生物科学，克隆H4A3)，检测效应细胞对靶细胞的脱颗粒活性。高尔基停止™(BD生物科学)(Monensin)是按照制造商的协议添加的24...培养后，收集、洗涤细胞，用抗CD3-PerCP/Cy5.5、抗CD 56-APC和抗CD 19 BV 510(BD生物科学，克隆HIB 19)标记细胞。在CD 56+/CD3−细胞中检测脱颗粒NK细胞(CD107a+)。阴性选择CD 19标记，剔除与NK细胞大小相似的靶细胞(FSC-SSC)。此外，为了消除感兴趣数据中的噪声，在没有靶细胞的情况下，对NK细胞自发脱颗粒进行了测量。

数据分析

采用双向方差分析和多因素比较的方法，评价了换能型NK细胞与非转导型NK细胞之间的差异。AB和CB NK细胞的差异采用非配对t检验或双向方差分析.P-值<0.05者有显着性意义。使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software，Inc.)进行统计计算。条形图或符号表示平均值，误差条表示扫描电镜。