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结核病合并2型糖尿病患者的血浆代谢组学在诊断和抗生素治疗中的应用

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发表时间:2019-12-10 18:55作者:武汉新启迪Xinqidibio来源:www.qidibio.com

结核病合并2型糖尿病患者的血浆代谢组学在诊断和抗生素治疗中的应用

摘要

结核病(TB)和2型糖尿病(DM)是结核病的主要危险因素,两者都伴随着代谢过程的显著改变。通过代谢组学方法对疾病引起的具体代谢变化进行解剖,可以提高我们对疾病相关病理生理机制的认识,从而提高治疗水平。采用定点串联液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)方法,比较了印度尼西亚结核病或TB-DM患者在诊断和抗生素治疗期间血浆中胺类和酰基肉碱的含量。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)显示患者组分离良好.与健康对照组相比,两种疾病组的胺水平都有很大的变化,包括低浓度的瓜氨酸和鸟氨酸。几种氨基酸比值可区分TB与对照组(苯丙氨酸/组氨酸;瓜氨酸/精氨酸;苦参碱/色氨酸),可能反映了吲哚胺-吡咯2,3-双加氧酶(IDO)和一氧化氮合酶(NOS)活性的变化。TB-DM患者血清胆碱、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸水平低于结核,与其他分析相比,抗生素治疗期间未达到健康对照水平。我们的结果不仅为以前的研究提供了重要的验证,而且还发现了新的生物标记物,并大大提高了我们对人类TB和TB-DM代谢变化的理解。

导言

结核病(TB)是一种严重的传染病,主要影响肺部,是由结核分枝杆菌...2016年,1,040万人被新诊断为结核病,170万人死于结核病,结核病排在10位TH全球主要死因1...近年来,2型糖尿病(Dm)已被认为是结核病发展的重要危险因素,降低了结核病治疗的成功率。2,3,4...据目前估计,全球15%的结核病病例可归因于并发结核病-dm。5...据估计,全球糖尿病患者的人数在2045年将增加48%,特别是在肺结核流行的低收入和中等收入国家,原因是与经济发展和城市化相关的生活方式的改变。6...因此,在糖尿病共病的背景下更好地了解结核病的特点对于破译它们的联合病理生理学并最终改善治疗至关重要。

TB和DM都伴随着明显的代谢变化:TB的进展与消瘦综合征的发展有关,在这种营养状态下,对抗感染所必需的能量增加和食物摄入的减少会导致严重的体重减轻和肌肉组织的浪费,而高血糖和高脂血症是DM的主要特征。我们最近发现,tb-dm患者表现出这两种疾病的代谢特征。1核磁共振(NMR)血浆脂质谱7...代谢组学是对构成代谢体的生物系统中的小分子代谢中间体的综合分析,已发展成为研究疾病引起的代谢动态平衡的潜在扰动的有力途径。代谢组学的使用使人们成功地发现了各种疾病的小分子代谢物生物标志物,包括阿尔茨海默病。8,各种形式的癌症9,糖尿病10...许多研究已经使用代谢组学来识别血清和尿液中结核病的生物标志物。11...最近,一种具有良好预测结核病进展能力的预测代谢生物信号被开发出来。12...然而,在独立研究或临床相关疾病(如DM)存在的情况下,还没有对许多这些生物标记物进行进一步的验证。

在这里,我们进行了目标代谢组学研究,以研究血浆中的胺和酰基肉碱水平的结核病患者是否有糖尿病和健康的地方病对照。酰基肉碱是脂肪酸和氨基酸氧化的中间产物,可能参与早期胰岛素抵抗。10...此外,在结核病治疗期间,对TB和TB-DM患者的代谢谱进行了纵向跟踪,以分析抗生素TB治疗对代谢物生物标志物的可能影响。我们发现TB和TB-DM对患者血浆代谢状况有共同和独特的影响,包括与尿素循环有关的代谢物的显著变化、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)信号和肝功能,其中大多数在抗生素治疗过程中恢复到健康对照水平。本研究的结果不仅证实和验证了以前在地理和遗传上不同的人群中结核病代谢组学研究的关键发现,而且还提出了结核病和结核病-DM的新的生物标记物候选物。

结果

学习人口

共测定了48例肺结核患者、20例结核病-DM患者和48例健康对照者血浆中代谢物浓度。与无糖尿病的肺结核患者相比,HC年龄相近,但体重较高;糖尿病结核病患者年龄较大,BMI高于非糖尿病肺结核患者(表)1)。根据性别、种族、目前的吸烟状况或胸部X光评分(CXR)的结核病严重程度,各组间无显着性差异。

表1按疾病组的临床特点(n=116)。

首先,建立了一个主成分分析(PCA)模型,在整个数据集的基础上对疾病组间的差异进行可视化,该模型由四个分量组成,解释了总方差的54%。图中显示了前两个分量的得分图(分别解释了总方差的25%和13%)。1A...虽然疾病状态(HC、TB或TB-DM)占总变异的比例,但未观察到三组之间的完全分离。然而,性别差异也构成了相当大的数据差异来源(图一)。S1a)。这些结果得到了层次聚类分析的证实,即基于性别或疾病组状态的不完全聚类(图1)。1B)。为了校正性别的影响,建立了多层PCA模型。13将“性别内部”与“性别间”数据的差异区分开来。多层模型改进了基于疾病组的判别能力。S1B),而性别和吸烟状况对数据差异没有影响。最后,对各疾病组进行了偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型的拟合,并在图中显示了模型预测能力(Q2)和解释方差(R2X&R2Y)的得分图和交叉验证的质量指标。1C-E...所有模型的拟合优度和预测能力均较高,R2Y和Q2评分均>0.5分,所得评分图显示出较好的聚类和基于疾病组的样本分离。综合来看,TB和TB-DM状态是导致基于整个代谢组学数据的数据差异的主要因素,调整性别差异对进一步分析具有重要意义。

图1
figure1

TB/TB-DM状态导致不同的代谢状况。(A)在整个数据集上建立的PCA模型前两个主成分的得分图和用置信椭圆组编码的颜色。HC显示为红色点,TB患者显示为蓝色三角形,TB-DM患者显示为绿色方格。(B)基于欧氏距离的Ward方法的双向层次聚类分析。样本按疾病组和性别标注:HC(红色)、TB患者(蓝色)和TB-DM患者(绿色)、男性(青色)、女性(橙色)。(CE)TB与HC的PLS-DA模型评分图(C),TB-DM诉HC(D)和TB-DM对TB(E)。HC显示为红色点,TB患者显示为蓝色三角形,TB-DM患者显示为绿色方格。请-DA评估标准(R2X,R2Y,Q2)显示为每个模型。

结核病和tb-dm患者有不同的代谢特征。

在结核病患者中,31/53胺(58.5%)和5/21酰基肉碱(23.8%)的水平与基于线性回归模型的HC相比有显着性差异(图1)。2A)。所有测量的四分位数范围的中间值及其结果q-数值可在补充表中找到1...火山图的回归模型统计与代谢物对数2转换褶皱变化在图中描述。S2...TB与低水平的瓜氨酸和鸟氨酸密切相关,而鸟氨酸和瓜氨酸都是尿素循环中的中心氨基酸。二维空间)而精氨酸和天冬氨酸是尿素循环中的另两种重要中间体,但结核病患者中的精氨酸和天冬氨酸水平较高。此外,结核患者组氨酸水平显著降低,而苯丙氨酸水平则明显升高,这一发现与先前的代谢组学分析结果一致。7...3-甲氧基酪氨酸是左旋多巴的代谢产物,与芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)缺乏密切相关。其他显著变化包括色氨酸水平显著降低和血浆中较高浓度的金牛尿碱,这两种代谢物是免疫调节酶IDO途径的一部分。

图2
figure2

TB和TB-DM对患者血浆代谢物水平有很大影响.对每一种疾病组间的比较进行了多元线性回归模型的拟合,并对其进行了对数变换。p-价值(q-数值)是在每种代谢物的回归系数估计的基础上绘制的:TB与HC(A),TB-DM诉HC(B),TB-DM对TB。(C每个点代表一个单独的代谢物。网点颜色表示回归系数的方向和大小。重要阈值(q=0.05)显示为水平虚线。(D)每组个体代谢物的绝对丰度显示为图基的盒形图。Hc(n=48)、TB(n=48)和TB-DM(n=20)组间的显着性差异采用Kruskal-Wallis检验和后特发邓恩试验。*p=0.05,**p=0.01,*p=0.001,*p=0.0001。

结核病-糖尿病患者的代谢物谱(图)。2B)与HC相比,其主要特征是胺含量较低,而只有两种代谢产物腐胺和甘氨酸显著升高。与结核病患者类似,TB-DM与低水平的瓜氨酸、组氨酸、鸟氨酸和色氨酸等有关.然而,最显著的差异是胆碱的平均浓度与HC相比极低。q=6.45东−19),一种比无糖尿病的肺结核患者更强的疗效(见图)。2C)。同样,TB-DM患者血浆中丝氨酸、高丝氨酸、甘氨酸和苏氨酸水平明显低于肺结核患者和HC患者。这些结果与早期的研究一致,这些研究描述了糖尿病期间甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸水平的下降。14,15.

代谢物比率显示出结核病和TB-DM分类的潜力。

为了评估其作为TB或TB-DM代谢标志物的潜力,绘制了每种疾病组的每种代谢物的受试者操作特性(ROC)曲线,并计算出相应的AUC值(补充表)。1)。将三种AUC值最高的代谢物结合到多变量特征中,用线性支持向量机(SVM)机器学习算法对其分类效果进行检验。3A)。瓜氨酸、3-甲氧基酪氨酸和精氨酸是结核病和HC分类能力最好的个体代谢物,其在多变量标记中的作用进一步提高(AUC:0.913[0.818-0.978])。不出所料,胆碱是TB-DM与HC的最佳生物标志物(aUC:0.991[0.977-1.000]),其次是组氨酸和甘氨酸。胆碱、丝氨酸和腐胺对鉴别结核性糖尿病患者的潜力最大.在这些病例中纳入交叉验证的多变量模型导致相似的AUC值(TB-DM对HC:0.995[0.981-1.000];TB-DM对TB:0.967[0.940-0.998])。虽然我们的一些数据证实了在亚洲队列中发表的非洲队列的发现,但这里首次报告的新的TB-DM生物标记结果将需要被验证,包括年龄匹配的队列,因为这在本分析中没有得到纠正。

图3
figure3

生物标志物分析测定各组代谢物和疾病组比较的ROC曲线和AUCs:TB对HC(蓝色)、TB-DM对HC(红色)和TB-DM对TB(绿色)。(A)将三种代谢物组合成3个特征模型,用线性支持向量机算法拟合相应的多变量ROC曲线。(BD)下列代谢物比值的ROC曲线和盒形图:苯丙氨酸/组氨酸(PHE/HIS)B)、Kynurenine/色氨酸(Kyn/Trp)(C)和瓜氨酸/精氨酸(Cit/Arg)(D)。每个点表示单个病人,由Youden的统计数据确定的最佳截断值显示为一条水平虚线。

我们先前发现苯丙氨酸与组氨酸的比值(phe/his)是一种很有希望的结核病分类和诊断的生物标志物,而不管南非患者是否患有糖尿病。7...在目前的研究中,这一发现在基因和地理上完全不同的群体中得到了独立的证实(如图所示)。3B):PHE/HIS比值对TB和HC的分类能力优于其他代谢物(AUC:0.912[0.850~0.974]),TB-DM患者与HC的分类能力相似(AUC:0.908[0.807~1.000])。此外,多元线性回归分析显示,结核病患者的尿激酶相对增加,同时色氨酸降低。这些氨基酸之间的比值(Kyn/Trp)反映了IDO的活性,IDO催化色氨酸分解代谢的Kynurenine途径中的限速步骤。结果(图1.3C结果表明,TB和TB-DM均与Kyn/TRP比值升高有关(分别为0.838[0.755~0.922];AUC:0.802[0.682~0.921]),提示IDO活性增高。最后发现,在结核病过程中,尿素循环中的各种氨基酸,包括瓜氨酸和精氨酸(Cit/Arg),是NO合成酶(NOS)产生一氧化氮(NO)所必需的。与HC(AUC:0.895[0.834~0.955])相比,TB-DM与Cit/Arg比值降低有关,这可能反映了这些患者通过一氧化氮合酶产生NO的减少。

抗结核治疗使发散的代谢物正常化到健康水平。

接下来,我们试图研究抗结核治疗对结核病和结核病-糖尿病患者代谢状况的影响。对45/49 TB和18/19 TB-DM患者在开始抗生素治疗后8周和26周的血浆标本进行了检测。结核病治疗的成功与29种代谢物在结核病患者中的线性正相关(图一)。4A),4种代谢物在抗结核治疗中被下调。在结核病患者治疗期间,许多代谢物在诊断为HC时较低,如瓜氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、组氨酸和鸟氨酸,而甘氨酸和苯丙氨酸在结核病患者血浆中被上调后由于治疗而降低。有趣的是,3-甲氧基酪氨酸在治疗期间没有恢复到HC水平。q因此,它可能是一个长期存在的结核病相关生物标记物.

图4
figure4

抗结核治疗导致患者血浆代谢谱正常化至HC水平。用线性混合模型研究了抗生素治疗对结核病患者代谢物水平的影响(A)和结核病-糖尿病患者(B)分开。结果日志转换p-价值(q-数值)是根据每种代谢物的回归系数估计绘制的。每个点代表一个单独的代谢物。网点颜色表示回归系数的方向和大小。重要阈值(q=0.05)显示为水平虚线。(C代谢物回归系数的β-β图分析结核病患者抗结核治疗效果(x轴)与结核-糖尿病患者(y轴)的关系。每个点代表一个单独的代谢物。斑点颜色代表代谢物是否显着地影响结核病患者(蓝色),结核病-糖尿病患者(红色),两者(紫色)或根本不(灰色)抗结核治疗。回归线显示为虚线,置信区间为95%。(D)每组个体代谢物的绝对丰度显示为图基的盒形图。对于结核病和结核病-DM患者,在治疗后0、8和26周显示代谢物水平。HC(n=48)与TB(n=44)或TB-DM(n=19)患者的差异采用Kruskal-Wallis检验和后特发邓恩试验。*p=0.05,**p=0.01,*p=0.001,*p=0.0001。

结核病和TB-DM患者的代谢效应表现出很强的相似性(图一)。4B、C)代谢物回归系数的显著正相关(r2: 0.528, p=2.35东经−13)。与治疗相关的代谢物有谷氨酰胺、γ-谷氨酰谷氨酰胺、γ-谷氨酰丙氨酸、组氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、O-乙酰丝氨酸和谷氨酸。有趣的是,治疗结束时,TB-DM患者的谷氨酰胺和γ-谷氨酰胺水平显著高于HC患者(p < 0.01), while glutamate was simultaneously decreased (p < 0.0001) (Fig. 4D)。虽然治疗使结核病患者的胆碱水平达到正常水平(q=9.40 E−3),TB-DM患者的胆碱浓度仍然很低(Q=0.756)。此外,甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸水平随治疗时间的延长而升高,进一步证实了它们与糖尿病的关系。

由于与前四个月相比,2 HRZE/4H3R3治疗方案在前两个月更为密集,因此可以合理地预期一组代谢物将以非线性方式对治疗作出反应。因此,两个疾病组的时间周期分别为0~8周和8~26周。S3A,B)。与一般线性治疗模型相似,结核病和TB-DM患者治疗效果在0~8周内均呈显著正相关(P<0.05)。r2: 0.739, p=1.04E−22)和8至26周(r2: 0.532, p=1.67E−13)。当比较两个时间段代谢物水平的变化时,在TB和TB-DM患者中都观察到了一些相反的关系(图1)。S3C-E)。在治疗的头8周,两种代谢物,即甲硫氨酸砜和腐胺,在治疗结束时明显下降。在结核病患者中,7种代谢物呈相反的趋势,8周时水平下降,26周后升高(图一)。S3C),即蛋氨酸、甘氨酰脯氨酸、天冬氨酸、辛酰肉碱、赖氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸;除后者外,在结核病-DM患者中也观察到了类似的作用(图一)。S3D).

代谢物与结核病严重程度的关系

最后,我们想知道某些代谢物是否与结核病的严重程度有关,如CXR评分(轻度或晚期病变)。为了研究这一点,我们将CXR作为协变量加入到我们最初的回归模型中,该模型随后对TB和TB-DM患者的合并情况进行了拟合。11种代谢物与CXR评分有显著的相关性,但没有一种代谢物在FDR校正后存活下来,表明该数据集的统计能力不足以准确地评估这一问题。尽管如此,为了突出代谢与结核病严重程度相关的可能趋势,我们使用cxr评分作为标识符进行了经典生物标志物分析,并且只选择了单因素t检验统计量的代谢物。p-数值<0.01。这导致五种代谢物与晚期CXR病变有潜在的正相关(图一)。S4),包括4种酰基肉碱(己基肉碱、3-甲氧基酪氨酸、十六烯基肉碱、十二烯基肉碱、十四烯基肉碱)。这些结果表明,在最初的回归分析中,虽然酰基肉碱水平与TB或TB-DM没有很强的相关性,但有些可能在患有严重疾病的个体中受到特别的影响。这些结果必须在具有更强统计能力的研究中得到验证。

讨论

在这里,我们应用血浆代谢组学来确定与TB或TB-DM相关的胺和酰基肉碱水平在诊断时和抗生素治疗过程中的纵向随访中的差异。我们确定了几种具有高AUC值的潜在生物标志物,包括瓜氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和组氨酸等。总体而言,与HC相比,结核病和结核病-DM患者的多胺类药物水平均有所下降,而相对较少的酰基肉碱受到影响。结核病患者的另一个特点是较高水平的几种代谢物,包括L-DOPA代谢物3-甲氧基酪氨酸,而只有腐胺,一种多胺与糖尿病有关。16,在TB-DM中被发现是特别升高的。结核病-糖尿病组缺乏正相关代谢物,这在某种程度上是令人惊讶的,因为糖尿病往往与营养过剩有关,我们先前的研究结果表明,南非人群中的结核病-糖尿病患者表现出糖尿病的主要特征,e.g...高血糖、血脂异常和支链氨基酸升高7...与结核病患者相比,TB-DM患者的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸水平更低,而后者同样不受结核病治疗的影响。这些氨基酸是同一生物合成途径的一部分,参与了非酒精性脂肪肝的发展。17,18,这是一种与糖尿病和胰岛素抵抗有关的肝脏疾病。19.

重要的是,大多数与结核病相关的代谢物在抗生素治疗过程中都向HC水平靠拢,从而证实了它们与活动性疾病的联系。这方面的例外包括胆碱,与HC和TB患者相比,TB-DM患者血浆中胆碱含量显著降低,并且在治疗过程中没有变化。我们认为,这种效应不太可能是在测量或采血过程中引入的伪影,因为所有样本在技术分析之前都是随机和盲目的,而且结果在多个独立的时间点上是非常一致的。由于摄入减少或肠道微生物体失调而导致的胆碱生物利用度降低,已与NAFLD有关。20,21因此,与检测到的低水平甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸水平相一致,所有这些水平在治疗期间都没有恢复到HC水平。然而,这一结果应该被解释为类似水平的胆碱缺乏在结核病或糖尿病之前并没有报告,据我们所知。

我们的研究结果与早期结核病代谢生物标志物研究是一致的,而且是独立验证的,目前他们来自印度尼西亚。我们以前发现南非结核病患者组氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸和缬草碱浓度降低,同时伴有高水平的苯丙氨酸。7所描述的Phe/HIS比值作为结核病生物标志物的高预测能力,无论DM-状态如何,在目前的队列中都得到了证实。同样,Weiner等人...报告活动性肺结核患者血清组氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、γ-谷氨酰胺、丙氨酸和苏氨酸水平较低,而苯丙氨酸、3-甲氧基酪氨酸和天冬氨酸升高。12,22...两位结核病患者的血清中都显示了低水平的色氨酸和(或)高浓度的辛纽氨酸。22,23,24和胸腔积液25...Kyn/Trp比值的增加是对免疫调节酶IDO活性增强的一种估计,它对免疫调节酶IDO的活性有好处。MTB两种感染离体体内26,并在我们的分析中显示出作为结核病诊断的生物标志物的潜力。在使用不同技术平台进行的结核病代谢组学研究以及来自不同地理区域的患者群体之间,这一惊人的一致证实并突出了这些平台和由此产生的数据的稳健性,以及它对结核病诊断和预后的潜力。12.

结核病患者血清瓜氨酸和鸟氨酸水平下降,而精氨酸和天冬氨酸浓度升高。此外,Cit/Arg比值对结核病和HC有较好的预测能力,但对TB-DM对HC的预测能力不明显。瓜氨酸、鸟氨酸、精氨酸和天冬氨酸是尿素循环的重要中间产物,主要通过肝脏中有毒氨转化为尿素排出大部分氮。27...在循环开始时,瓜氨酸由鸟氨酸和氨形成,然后与天冬氨酸反应,通过精氨酸琥珀酸生成精氨酸。精氨酸可被精氨酸酶水解生成尿素和鸟氨酸,或由一氧化氮合酶(NOS)产生NO和瓜氨酸,这一平衡在结核病患者中已发生变化,反映在其相对较低的Cit/Arg比值上。在小鼠结核病模型中,结核肉芽肿髓系细胞中精氨酸酶1(Arg 1)的表达通过与一氧化氮合酶(NOS)底物竞争而加重疾病。28,29...然而,瓜氨酸被证明可以促进小鼠巨噬细胞的抗细菌机制。30,31和T细胞32作为细胞内精氨酸的替代来源,这意味着降低瓜氨酸水平可能对结核病患者有害。尽管精氨酸酶和NO对人类抗细菌反应的重要性仍然存在争议,ARG 1在结核病患者肉芽肿组织中表达。33,34因此可以在结核病的病理生理学中发挥作用。观察到的精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸的变化是否是由这些酶的表达或活性变化引起的,无法从这些结果中确定,必须在今后的研究中加以讨论。

抗生素治疗导致结核病和结核病-DM患者(包括瓜氨酸、鸟氨酸、组氨酸和苯丙氨酸)大多数结核病相关代谢物的HC水平正常化。相反,在前2个月的强化治疗中,代谢物的子集发生了特别的变化,其中蛋氨酸砜和腐胺的浓度明显增加。蛋氨酸易受到活性氧(Ros)的氧化修饰,因此高水平的氧化蛋氨酸被认为是氧化应激的标志。35...当甲硫氨酸的初始氧化导致甲硫氨酸亚砜的可逆生成时,第二步氧化生成甲硫氨酸砜是有效的不可逆的。甲硫氨酸氧化与药物性肝损伤有关。36,这可能是在强化抗生素治疗期间观察到的蛋氨酸砜升高的原因。令人惊讶的是,尽管血浆蛋氨酸浓度适当降低,但无论是结核病患者还是TB-DM患者,都没有受到抗生素治疗对蛋氨酸亚砜水平的影响。除氧化蛋氨酸外,作者还报告了不同类型肝损伤过程中γ-谷氨酰二肽水平的升高。36...γ-谷氨酰二肽是由γ-谷氨酰转移酶(GGT)作为抗氧化谷胱甘肽合成的副产物,反映氧化应激。GGT被广泛用作肝病和饮酒的诊断指标。37,高的循环GGT水平是DM发展的一个危险因素。38...相应地,我们发现γ-谷氨酰丙氨酸和γ-谷氨酰谷氨酰胺随着抗生素治疗而升高,甚至在治疗后高于HC水平,这可能表明治疗后GGT活性有所提高。此外,高水平的腐胺同样与动物模型中的肝毒性和抗生素治疗有关。39,40...综合考虑,抗结核治疗与肝损伤和氧化应激相关的代谢生物标志物水平增加,特别是在早期强化抗生素治疗期间,强调在这一时期监测肝功能的必要性。由于最后的血样是在治疗结束时采集的,因此在治疗结束后测量这些代谢物的丰富程度可能有助于研究肝功能的恢复。

由于病人抽样调查的局限性,需要讨论研究中的几个可能的混淆因素。首先,与HC和TB患者相比,TB-DM患者的年龄要大得多.虽然我们试图在回归分析中将年龄作为协变量加以修正,但不能完全排除年龄差异可以解释tb-dm患者数据差异的比例,例如苏氨酸、组氨酸、甘氨酸和丝氨酸的水平随着年龄的增长而降低。41...第二,三组患者的平均BMI差异有显着性,这可能与代谢物水平的变化有关。然而,在我们的分析中,我们有意不调整BMI,因为它与TB和DM的病理生理学有内在联系,因此它可能对患者的代谢状况产生影响。同样,我们无法控制营养和微生物组成等因素的差异,这些因素也可能导致某些特定代谢物的改变。第三,由于这些测量是在历史患者队列中进行的,因此不能包括额外的对照组。为了证实所报告的代谢变化对疾病的特异性,今后的研究应包括无结核的糖尿病患者,并将结核与其他呼吸道或传染病进行比较。最近的一篇文章将肺癌患者的循环胺和酰基肉碱水平与健康对照组进行了比较,结果显示血浆精氨酸水平升高,而瓜氨酸和甘氨酸水平下降,这与我们观察到的结核病相似,表明这可能是一般肺病理的一种反映。42...相反,没有观察到其他结核病相关的胺,如组氨酸和苯丙氨酸,我们发现一致的变化。此外,一项关于慢性阻塞性肺疾病(COPD)的代谢组学研究显示,与我们的观察结果几乎没有重叠。43,支持这些结果对结核病的特异性。最后,使用抗糖尿病药物可能会影响TB-DM组代谢物的浓度。

总之,TB和TB-DM与血浆胺代谢物水平的显著变化有关,在抗结核治疗过程中,胺代谢物水平已趋于正常。Tb-DM特异性变化的存在表明,这种共病需要被考虑用于发展基于代谢中间体水平的结核病诊断测试。本研究支持利用相关代谢物比值作为结核病潜在的生物标志物,并在今后的研究中探讨其与结核病病情进展、严重程度及治疗结果的可能关系。

材料和方法

研究对象

本研究中所包括的病人血浆样本是根据样本的可用性,从先前描述的印度尼西亚队列中随机抽取的。44...简而言之,2002年1月至2004年12月,在雅加达的一个结核病门诊治疗中心招募了新诊断的活动性肺结核患者。结核病诊断依据世界卫生组织(世卫组织)标准,根据临床表现和胸部X线片(Cxr),并经镜检证实的耐酸杆菌在Ziehl-nielsen染色痰涂片和阳性培养。MTB...人类免疫缺陷病毒(HIV)-血清阳性患者、心脏病患者和数据记录不完整的患者被排除在外。根据CXR病变的程度,结核病患者被归类为轻中度结核病或晚期结核病。CXR结果分为下、中、上肺区、左、右肺区,异常分为“轻度”(6个区域中的1个)、“中度”(6个区域中有2个或3个)或进展期(3个以上)。45...如果空腹血糖(Fbg)>126 mg/dl,按照世卫组织招募时的标准或自行报告的糖尿病诊断为糖尿病。在同一时期,与性别和年龄匹配的健康个体(±10%)和生活在同一Rukun teTangga(由15-30个家庭组成)的健康个体作为对照。排除糖尿病、体征、症状和CXR结果提示活动性结核病、抗结核治疗史或数据输入不完整的对照组。对照组未检测艾滋病毒状况,但在招募研究对象时,印度尼西亚被列为艾滋病毒感染率较低的国家,≤感染率为0.1%。根据印度尼西亚国家结核病计划指南,向所有患者提供免费抗结核药物治疗,包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇(2 HRZE/4H3R3)标准方案。对一组患者进行纵向随访,在治疗开始后的两个月和六个月采集血样。这项研究得到雅加达印度尼西亚大学医学院伦理委员会和雅加达埃里克曼研究所研究伦理委员会的批准,所有患者和对照者自愿签署书面知情同意。所有研究都是根据征聘时的有关准则和条例进行的。

LC-MS/MS

用两种靶向的LC-MS/MS平台分别测定了单个复制人血浆中代谢物的含量。被试编号随机分为5批,包括校准线、质控样品和空白。每10个样本分析一次QC样品,用于评估数据质量和校正仪器响应。空白用于检查空白效果。

胺类平台包括氨基酸和生物胺,采用了根据Waters提供的协议改编的Accq-tag衍生策略。46...每个样本的5.0L加入一个内部标准溶液。然后加入MeOH沉淀蛋白质。上清液在快速箱里变干了。用AQC试剂在硼酸盐缓冲液(pH8.5)中对残渣进行重组。将反应混合物的1.0μL注入UPLC-MS/MS系统。在Accq-标签超柱(Waters)上,用Agilent 1290无限II LC系统实现了色谱分离.UPLC与三重四极质谱(AB SCIEX QTRAP 6500)上的电喷雾电离耦合。用正离子模式检测分析物,多反应监测(MRM)用标称质量分辨法进行监测。用多重定量定量分析软件(ABSCIEX,3.0.2版)对获得的数据进行评价。

酰基肉碱平台包括酰基肉碱以及三甲胺-N-氧化物、胆碱、甜菜碱、脱氧肉碱和肉碱.每样10升加内标液。然后加入MeOH沉淀蛋白质。将反应混合物的1.0μL注入UPLC-MS/MS系统。色谱分离由美国加利福尼亚州圣何塞的UPLC(Agilent 1290)在Accq-Tag超柱(Waters)上实现.UPLC与三重四极质谱仪(美国加利福尼亚州圣何塞,Agilent 6460)上的电喷雾电离相耦合。用正离子模式检测分析物,多反应监测(MRM)用标称质量分辨法进行监测。用Agilent MassHunter定量分析软件(Agilent,B.05.01版)对获得的数据进行评价。

数据使用适当的内部标准表示为相对响应比(目标区域/ISTD区域;单位自由)。用于氨基酸分析13C15用N标记的类似物。对于其他代谢物,采用最接近洗脱的内标。所有内部标准都列在补充表中2...内部开发的算法被应用于使用集合的QC样本来补偿质谱仪在批次上的灵敏度的变化。经质量控制校正后,代谢物指标符合RSDqc<15%的验收标准。

统计分析

在多变量分析中,代谢物的测量被转化为对数,以均值为中心,并以标准差为单位。预处理后,采用主成分分析(PCA)和层次聚类的方法对与疾病或性别相关的数据进行方差分析。通过拟合三组分偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型对各疾病组进行比较,进一步显示各疾病组间的差异。请-DA模型评价标准(Q2,R2X,R2Y)在休假一次交叉验证后确定.

为明确诊断时三组代谢物水平在校正年龄和性别时的显着性差异,对每种代谢物分别进行两水平疾病组比较(TB对HC、TB-DM vs HC和TB-DM vs TB),拟合以下多元线性回归模型:

Metabolite=β0+β1Disease+β2Age+β3Sex+ε

哪里=疾病组(HC、TB或TB-DM),年龄=年龄(年龄)和=性别(男性/女性)。

因此,CXR评分作为协变量添加到模型中,以研究可能的代谢物与结核病严重程度之间的关系。

为了分析和比较抗结核治疗对结核病和结核-糖尿病患者代谢物水平的影响,对每个研究参与者采用以下具有随机截距的线性混合效应模型(u0学科)分别适用于结核病组和结核病-DM组:

Metabolite=(β0+u0Subject)+β1Treatment+β2Age+β3Sex+ε

哪里治疗=治疗时间(周),年龄=年龄(年龄)和=性别(男性/女性)。

结果p-数值被错误发现率(Fdr)校正,使用benamini-hochberg程序获得q-值,这些值随后被转换并绘制成相对于回归系数估计值(β1)生成代谢物火山图。或者,两种比较的回归系数估计是互相作图的(β-β图)。

在单因素生物标志物分析中,根据Youden‘s J统计量计算的最优截尾值,生成各疾病组的代谢物受体操作特性(ROC)图和曲线下面积(AUCS)。47,定义为到对角线的距离最大的值。用2000份分层自举样本计算AUC 95%可信区间(CI)。此外,在每一组的比较中,三种代谢产物与单变量最高的AUCs结合在一起,形成三个参数的代谢特征。使用MetaboAnalystR软件包中包含的线性支持向量机算法(版本1.01)计算了多元ROC曲线和AUCs。48经过100倍重复的随机次抽样交叉验证,其中2/3的样本用于模型训练,其余的1/3用于模型测试。




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