学习人口
共测定了48例肺结核患者、20例结核病-DM患者和48例健康对照者血浆中代谢物浓度。与无糖尿病的肺结核患者相比，HC年龄相近，但体重较高；糖尿病结核病患者年龄较大，BMI高于非糖尿病肺结核患者(表)1)。根据性别、种族、目前的吸烟状况或胸部X光评分(CXR)的结核病严重程度，各组间无显着性差异。
首先，建立了一个主成分分析(PCA)模型，在整个数据集的基础上对疾病组间的差异进行可视化，该模型由四个分量组成，解释了总方差的54%。图中显示了前两个分量的得分图(分别解释了总方差的25%和13%)。1A...虽然疾病状态(HC、TB或TB-DM)占总变异的比例，但未观察到三组之间的完全分离。然而，性别差异也构成了相当大的数据差异来源(图一)。S1a)。这些结果得到了层次聚类分析的证实，即基于性别或疾病组状态的不完全聚类(图1)。1B)。为了校正性别的影响，建立了多层PCA模型。13将“性别内部”与“性别间”数据的差异区分开来。多层模型改进了基于疾病组的判别能力。S1B)，而性别和吸烟状况对数据差异没有影响。最后，对各疾病组进行了偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型的拟合，并在图中显示了模型预测能力(Q2)和解释方差(R2X&R2Y)的得分图和交叉验证的质量指标。1C-E...所有模型的拟合优度和预测能力均较高，R2Y和Q2评分均>0.5分，所得评分图显示出较好的聚类和基于疾病组的样本分离。综合来看，TB和TB-DM状态是导致基于整个代谢组学数据的数据差异的主要因素，调整性别差异对进一步分析具有重要意义。
图1TB/TB-DM状态导致不同的代谢状况。(A)在整个数据集上建立的PCA模型前两个主成分的得分图和用置信椭圆组编码的颜色。HC显示为红色点，TB患者显示为蓝色三角形，TB-DM患者显示为绿色方格。(B)基于欧氏距离的Ward方法的双向层次聚类分析。样本按疾病组和性别标注：HC(红色)、TB患者(蓝色)和TB-DM患者(绿色)、男性(青色)、女性(橙色)。(C–E)TB与HC的PLS-DA模型评分图(C)，TB-DM诉HC(D)和TB-DM对TB(E)。HC显示为红色点，TB患者显示为蓝色三角形，TB-DM患者显示为绿色方格。请-DA评估标准(R2X，R2Y，Q2)显示为每个模型。
结核病和tb-dm患者有不同的代谢特征。
在结核病患者中，31/53胺(58.5%)和5/21酰基肉碱(23.8%)的水平与基于线性回归模型的HC相比有显着性差异(图1)。2A)。所有测量的四分位数范围的中间值及其结果q-数值可在补充表中找到1...火山图的回归模型统计与代谢物对数2转换褶皱变化在图中描述。S2...TB与低水平的瓜氨酸和鸟氨酸密切相关，而鸟氨酸和瓜氨酸都是尿素循环中的中心氨基酸。二维空间)而精氨酸和天冬氨酸是尿素循环中的另两种重要中间体，但结核病患者中的精氨酸和天冬氨酸水平较高。此外，结核患者组氨酸水平显著降低，而苯丙氨酸水平则明显升高，这一发现与先前的代谢组学分析结果一致。7...3-甲氧基酪氨酸是左旋多巴的代谢产物，与芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)缺乏密切相关。其他显著变化包括色氨酸水平显著降低和血浆中较高浓度的金牛尿碱，这两种代谢物是免疫调节酶IDO途径的一部分。
图2TB和TB-DM对患者血浆代谢物水平有很大影响.对每一种疾病组间的比较进行了多元线性回归模型的拟合，并对其进行了对数变换。p-价值(q-数值)是在每种代谢物的回归系数估计的基础上绘制的：TB与HC(A)，TB-DM诉HC(B)，TB-DM对TB。(C每个点代表一个单独的代谢物。网点颜色表示回归系数的方向和大小。重要阈值(q=0.05)显示为水平虚线。(D)每组个体代谢物的绝对丰度显示为图基的盒形图。Hc(n=48)、TB(n=48)和TB-DM(n=20)组间的显着性差异采用Kruskal-Wallis检验和后特发邓恩试验。*p=0.05，**p=0.01，*p=0.001，*p=0.0001。
结核病-糖尿病患者的代谢物谱(图)。2B)与HC相比，其主要特征是胺含量较低，而只有两种代谢产物腐胺和甘氨酸显著升高。与结核病患者类似，TB-DM与低水平的瓜氨酸、组氨酸、鸟氨酸和色氨酸等有关.然而，最显著的差异是胆碱的平均浓度与HC相比极低。q=6.45东−19)，一种比无糖尿病的肺结核患者更强的疗效(见图)。2C)。同样，TB-DM患者血浆中丝氨酸、高丝氨酸、甘氨酸和苏氨酸水平明显低于肺结核患者和HC患者。这些结果与早期的研究一致，这些研究描述了糖尿病期间甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸水平的下降。14,15.
代谢物比率显示出结核病和TB-DM分类的潜力。
为了评估其作为TB或TB-DM代谢标志物的潜力，绘制了每种疾病组的每种代谢物的受试者操作特性(ROC)曲线，并计算出相应的AUC值(补充表)。1)。将三种AUC值最高的代谢物结合到多变量特征中，用线性支持向量机(SVM)机器学习算法对其分类效果进行检验。3A)。瓜氨酸、3-甲氧基酪氨酸和精氨酸是结核病和HC分类能力最好的个体代谢物，其在多变量标记中的作用进一步提高(AUC：0.913[0.818-0.978])。不出所料，胆碱是TB-DM与HC的最佳生物标志物(aUC：0.991[0.977-1.000])，其次是组氨酸和甘氨酸。胆碱、丝氨酸和腐胺对鉴别结核性糖尿病患者的潜力最大.在这些病例中纳入交叉验证的多变量模型导致相似的AUC值(TB-DM对HC：0.995[0.981-1.000]；TB-DM对TB：0.967[0.940-0.998])。虽然我们的一些数据证实了在亚洲队列中发表的非洲队列的发现，但这里首次报告的新的TB-DM生物标记结果将需要被验证，包括年龄匹配的队列，因为这在本分析中没有得到纠正。
图3生物标志物分析测定各组代谢物和疾病组比较的ROC曲线和AUCs：TB对HC(蓝色)、TB-DM对HC(红色)和TB-DM对TB(绿色)。(A)将三种代谢物组合成3个特征模型，用线性支持向量机算法拟合相应的多变量ROC曲线。(B–D)下列代谢物比值的ROC曲线和盒形图：苯丙氨酸/组氨酸(PHE/HIS)B)、Kynurenine/色氨酸(Kyn/Trp)(C)和瓜氨酸/精氨酸(Cit/Arg)(D)。每个点表示单个病人，由Youden的统计数据确定的最佳截断值显示为一条水平虚线。
我们先前发现苯丙氨酸与组氨酸的比值(phe/his)是一种很有希望的结核病分类和诊断的生物标志物，而不管南非患者是否患有糖尿病。7...在目前的研究中，这一发现在基因和地理上完全不同的群体中得到了独立的证实(如图所示)。3B)：PHE/HIS比值对TB和HC的分类能力优于其他代谢物(AUC：0.912[0.850~0.974])，TB-DM患者与HC的分类能力相似(AUC：0.908[0.807~1.000])。此外，多元线性回归分析显示，结核病患者的尿激酶相对增加，同时色氨酸降低。这些氨基酸之间的比值(Kyn/Trp)反映了IDO的活性，IDO催化色氨酸分解代谢的Kynurenine途径中的限速步骤。结果(图1.3C结果表明，TB和TB-DM均与Kyn/TRP比值升高有关(分别为0.838[0.755~0.922]；AUC：0.802[0.682~0.921])，提示IDO活性增高。最后发现，在结核病过程中，尿素循环中的各种氨基酸，包括瓜氨酸和精氨酸(Cit/Arg)，是NO合成酶(NOS)产生一氧化氮(NO)所必需的。与HC(AUC：0.895[0.834~0.955])相比，TB-DM与Cit/Arg比值降低有关，这可能反映了这些患者通过一氧化氮合酶产生NO的减少。
抗结核治疗使发散的代谢物正常化到健康水平。
接下来，我们试图研究抗结核治疗对结核病和结核病-糖尿病患者代谢状况的影响。对45/49 TB和18/19 TB-DM患者在开始抗生素治疗后8周和26周的血浆标本进行了检测。结核病治疗的成功与29种代谢物在结核病患者中的线性正相关(图一)。4A)，4种代谢物在抗结核治疗中被下调。在结核病患者治疗期间，许多代谢物在诊断为HC时较低，如瓜氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、组氨酸和鸟氨酸，而甘氨酸和苯丙氨酸在结核病患者血浆中被上调后由于治疗而降低。有趣的是，3-甲氧基酪氨酸在治疗期间没有恢复到HC水平。q因此，它可能是一个长期存在的结核病相关生物标记物.
图4抗结核治疗导致患者血浆代谢谱正常化至HC水平。用线性混合模型研究了抗生素治疗对结核病患者代谢物水平的影响(A)和结核病-糖尿病患者(B)分开。结果日志转换p-价值(q-数值)是根据每种代谢物的回归系数估计绘制的。每个点代表一个单独的代谢物。网点颜色表示回归系数的方向和大小。重要阈值(q=0.05)显示为水平虚线。(C代谢物回归系数的β-β图分析结核病患者抗结核治疗效果(x轴)与结核-糖尿病患者(y轴)的关系。每个点代表一个单独的代谢物。斑点颜色代表代谢物是否显着地影响结核病患者(蓝色)，结核病-糖尿病患者(红色)，两者(紫色)或根本不(灰色)抗结核治疗。回归线显示为虚线，置信区间为95%。(D)每组个体代谢物的绝对丰度显示为图基的盒形图。对于结核病和结核病-DM患者，在治疗后0、8和26周显示代谢物水平。HC(n=48)与TB(n=44)或TB-DM(n=19)患者的差异采用Kruskal-Wallis检验和后特发邓恩试验。*p=0.05，**p=0.01，*p=0.001，*p=0.0001。
结核病和TB-DM患者的代谢效应表现出很强的相似性(图一)。4B、C)代谢物回归系数的显著正相关(r2: 0.528, p=2.35东经−13)。与治疗相关的代谢物有谷氨酰胺、γ-谷氨酰谷氨酰胺、γ-谷氨酰丙氨酸、组氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、O-乙酰丝氨酸和谷氨酸。有趣的是，治疗结束时，TB-DM患者的谷氨酰胺和γ-谷氨酰胺水平显著高于HC患者(p < 0.01), while glutamate was simultaneously decreased (p < 0.0001) (Fig. 4D)。虽然治疗使结核病患者的胆碱水平达到正常水平(q=9.40 E−3)，TB-DM患者的胆碱浓度仍然很低(Q=0.756)。此外，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和高丝氨酸水平随治疗时间的延长而升高，进一步证实了它们与糖尿病的关系。
由于与前四个月相比，2 HRZE/4H3R3治疗方案在前两个月更为密集，因此可以合理地预期一组代谢物将以非线性方式对治疗作出反应。因此，两个疾病组的时间周期分别为0~8周和8~26周。S3A，B)。与一般线性治疗模型相似，结核病和TB-DM患者治疗效果在0~8周内均呈显著正相关(P<0.05)。r2: 0.739, p=1.04E−22)和8至26周(r2: 0.532, p=1.67E−13)。当比较两个时间段代谢物水平的变化时，在TB和TB-DM患者中都观察到了一些相反的关系(图1)。S3C-E)。在治疗的头8周，两种代谢物，即甲硫氨酸砜和腐胺，在治疗结束时明显下降。在结核病患者中，7种代谢物呈相反的趋势，8周时水平下降，26周后升高(图一)。S3C)，即蛋氨酸、甘氨酰脯氨酸、天冬氨酸、辛酰肉碱、赖氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸；除后者外，在结核病-DM患者中也观察到了类似的作用(图一)。S3D).
代谢物与结核病严重程度的关系
最后，我们想知道某些代谢物是否与结核病的严重程度有关，如CXR评分(轻度或晚期病变)。为了研究这一点，我们将CXR作为协变量加入到我们最初的回归模型中，该模型随后对TB和TB-DM患者的合并情况进行了拟合。11种代谢物与CXR评分有显著的相关性，但没有一种代谢物在FDR校正后存活下来，表明该数据集的统计能力不足以准确地评估这一问题。尽管如此，为了突出代谢与结核病严重程度相关的可能趋势，我们使用cxr评分作为标识符进行了经典生物标志物分析，并且只选择了单因素t检验统计量的代谢物。p-数值<0.01。这导致五种代谢物与晚期CXR病变有潜在的正相关(图一)。S4)，包括4种酰基肉碱(己基肉碱、3-甲氧基酪氨酸、十六烯基肉碱、十二烯基肉碱、十四烯基肉碱)。这些结果表明，在最初的回归分析中，虽然酰基肉碱水平与TB或TB-DM没有很强的相关性，但有些可能在患有严重疾病的个体中受到特别的影响。这些结果必须在具有更强统计能力的研究中得到验证。
