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瘦素诱导获得性全身性脂肪营养不良和克罗恩病合并肿瘤坏死因子α依赖性炎症

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发表时间:2019-12-10 18:54作者:武汉新启迪Xinqidibio来源:www.qidibio.com

瘦素诱导获得性全身性脂肪营养不良和克罗恩病合并肿瘤坏死因子α依赖性炎症

摘要

瘦素已经被证明可以调节小鼠的肠道炎症。然而,关于它在人类克罗恩病中的免疫刺激潜力的临床证据仍然很少.我们描述了一位患有获得性全身性脂肪营养不良症和克罗恩病(AGLCD)的患者,其特征是缺乏脂肪组织、瘦素缺乏和肠道炎症。采用质量和流式细胞术、免疫组织化学和功能代谢分析方法,将AGLCD患者与健康人和克罗恩病患者在免疫细胞组成、功能和代谢以及重组蛋白的作用等方面进行比较。N-甲硫氨酰瘦素(RLeptin)。我们提供的证据表明,rLeptin对免疫细胞的分化和功能有多种促炎作用,包括免疫细胞的代谢重排和α的诱导,最终加重了α患者的克罗恩病,抗肿瘤坏死因子α治疗可以逆转这种作用。我们的结果表明瘦素是人体免疫稳态所必需的,并以肿瘤坏死因子α依赖的方式促进自身免疫。

导言

脂肪因子瘦素调节多种免疫细胞亚群以及肠上皮细胞的分化、功能和代谢。1,2,3...同样,瘦素也参与了克罗恩病(CD)肠道炎症的发病机制,在这种疾病中,增生的肠系膜脂肪(“蠕动脂肪”)包裹着炎症的小肠段。4作为瘦素和额外脂肪因子的来源,在结肠炎动物模型中,瘦素和额外的脂肪因子既可以调节全身免疫细胞的组成,也可以调节肠上皮细胞的功能。5...以往的研究表明,瘦素缺乏和Leptin受体的药物阻断可以减轻小鼠结肠炎模型的疾病严重程度。6,7,强调瘦素在炎症性肠病中的潜在作用。因此,瘦素可以诱导CD4的增殖和极化。+自身免疫性疾病动物模型中的T辅助细胞8,9,10,11,而它抑制了调节性CD4的发展和维持。+T细胞12...此外,直肠应用瘦素通过激活上皮细胞NF-κB通路而促进小鼠肠道炎症,提示Leptin对上皮的直接作用也可能参与CD的炎症诱导。13.

最近很明显,免疫细胞的功能和代谢是紧密相连的。促炎症M的细胞因子生成等效应功能需要糖代谢的增加。1-类似巨噬细胞和T细胞,而调节性T细胞和免疫抑制M2-类巨噬细胞高度依赖于脂质的氧化代谢。14...有趣的是,最近发现瘦素在实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中促进了小鼠Th17细胞的无氧糖酵解,从而增加了IL-17的产生和神经元炎症,从而协调了免疫细胞的代谢和功能,强调了瘦素在代谢和免疫细胞功能交叉中的关键作用。15.

然而,关于瘦素免疫调节作用的人类数据仅限于极罕见的疾病,包括(I)先天性瘦素缺乏,其中T细胞低反应性,以及代谢功能障碍已被证明是可逆的瘦素替代。16,和(Ii)获得性广泛性脂肪营养不良17,全世界大约有100例已知病例。18...脂肪营养不良患者有不同程度的脂肪细胞丢失,导致低瘦素血症,严重的胰岛素抵抗,脂肪肝和肌肉变性。获得性脂肪营养不良可在不同年龄出现,脂肪组织的丢失可能是完全的,并与自身免疫有关。19...据我们所知,目前还没有其他病例报道过获得性全身性脂肪营养不良和克罗恩联合病(AGLCD)。由于上述蠕动脂肪的形成仅限于小肠CD,在小鼠模型中不能观察到。20目前尚不清楚瘦素对CD免疫细胞分化和疾病活动的影响。

在这里,我们描述了一位21岁的白人男性,他每天接受2.5mg重组体的注射。N-甲硫氨酰瘦素(RLeptin)。通过对rLeptin替代前后的临床观察,采用质量、流式细胞仪和体内外功能检测的方法进行深层免疫分析,发现rLeptin治疗对肠道炎症有明显的促炎作用,并以TNF、α-依赖性的方式加重了肠道炎症反应。

结果

AGLCD患者的临床表型分析

目前尚不清楚肠系膜脂肪和脂肪来源的瘦素是如何在CD中形成全身炎症的,很少有临床情况存在,其中应用重组脂肪因子是合理的,其免疫调节功能可以在人体病理生理学中进行研究。AGLCD患者的特征是完全缺乏内脏脂肪组织和皮下脂肪组织(如图所示)。1A),缺乏瘦素产生(图一。1B),严重的肠道炎症(见补充说明1和补充表1详细病例报告和AGLCD患者自身免疫血清标记物概述)。值得注意的是,没有一个病人的亲属表现出类似的症状。1C)并且通过外显子测序没有发现与泛发性脂肪营养不良相关的基因突变(数据未显示)。AGLCD患者最初在4岁时就出现了获得性全身性脂肪营养不良,11岁时被诊断为CD(蒙特利尔分类A1 L3B2+B3p),患有CD的攻击性变异。由于全身性脂肪营养不良,AGLCD患者随后发展为脂肪肝变性,需要在15岁时进行肝移植。图形1D总结了AGLCD患者的临床历史,并编制了与脂肪营养不良和克罗恩相关的干预措施和并发症。

图1
figure1

21岁男性表现为AGLCD,免疫表型连续改变。将AGLCD患者与克罗恩病患者(CD)和健康献血者(HD)进行比较。aMRI扫描了CD患者和AGLCD患者两种不同的序列,显示出AGLCD患者完全缺乏皮下和内脏脂肪组织。白色星表示CD患者皮下脂肪,红星显示肠系膜脂肪(“蠕动脂肪”),注射血管包裹发炎的肠段(梳征),白色箭头标记CD患者发炎的病变。单个白色箭头显示AGLCD患者出现瘘管,两个白色箭头显示皮下脓肿,单个黑色星形突出显示AGLCD患者无肠系膜脂肪,黑色箭头标记游离腹腔液。bELISA法测定AGLCD患者、CD患者血清瘦素水平(n=7)及房屋署(n=5)在生物独立样品中。cAGLCD患者家谱。dAGLCD患者临床病史的图解总结。电子-lAGLCD患者、CD患者PBMC的比较免疫分析(n=6)及房屋署(n=5)在不依赖于生物的样品中,采用大量的流式细胞术。ePBMC的t-SNE产生的单细胞数据的二维投影。对所需的亚群体(G1-G6)进行门控。每个标记的热颜色表示每个标记的表达水平,而红色表示高和蓝色的低表达。f盒状图显示不同细胞亚群(G1-G6)的频率。G-lBox图显示每个细胞子集中所选标记的平均表达水平(任意单位)。方框从第25百分位数延伸到第75百分位数。晶须图显示最小(最小)和最大(最大)值。方框中的线表示中间值。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, two-tailed unpaired t检验没有经过多次比较的校正。源数据作为源数据文件提供。

AGLCD患者免疫细胞组成的改变

为了研究脂肪组织的缺乏如何影响AGLCD患者的系统免疫细胞组成,并获得其免疫组成的基线,我们首先将AGLCD患者的外周血单个核细胞(PBMCs)与健康供者(HD)的淋巴细胞和CD患者的外周血单个核细胞(PBMCs)进行了比较,并进行了高维免疫细胞分析,使我们能够更好地鉴别脂肪营养不良相关免疫细胞的改变和CD特异性免疫细胞的改变。类似于我们之前发布的协议21,antibodies against lineage markers for T cells(CD3,CD4,CD8),monocytic cells(CD11b,CD11c,CD14,EMR1),B cells(CD19)and NK cells(CD16,CD56),as well as antibodies against functional makers(CD36,CD163,TREM2,arginase1,CD206),differentiation markers(CD33,CD40,CD45,CD64,CD95,CD115,CD116,CD135),homing markers(CD54,CD68,CD103,CCR2,CCR5,CCR7,CXCR3,MCP-1),activation markers(CD62L,CD83,CD86,CD124,CD135,HLA-DR,IL-7R),transcription factors(Tbet,细胞因子(IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF)和代谢标记物(CD 27、CD 38、PD-1、PD-1 L、adrp)用于PBMCs的深层免疫分析。2).

我们对CD 45进行了无监督的高维数据分析。+单元采用t分布随机线性嵌入(t-SNE)算法(图)。1E)并根据CD11b、CD3、CD4、CD8、CD 14、CD 19、CD 56等经典细胞系标记物的表达水平,比较细胞亚群的频率,以及CD 86、CCR 7和HLA-DR等功能、归巢和活化标记。1E,f)。然后比较健康供者、CD患者和AGLCD患者不同亚群体中所有标记物的表达水平。1g-l)。为了验证我们的大量细胞计量学数据的重复性和控制可能的批量效应,我们比较了16种重叠免疫标记的表达在我们的质量细胞分析抗体面板中的表达,揭示了这两个抗体面板之间的高度相关性,从而证实了我们的发现的可靠性(补充图)。12).

与CD患者相似,我们观察到CD8a的频率降低。+CCR 7+(G1)T细胞和CD11b增加+CD 86+(G3)细胞在AGLCD患者与健康对照组相比,突出了炎症条件下单核细胞的预激活,从而反映了CD诱导的免疫细胞组成的变化(图一)。1E,f),进一步反映在CD11b上几种分化和功能标记的类似表达模式上。+CD 86+细胞和CD 14+CD患者和AGLCD患者的单核细胞。1g,h).

相反,我们发现CD 14严重下降。+单核细胞(G6)和Tbet+CD 56+CD8+(G4)和Tbet+CD 56+CD8NK细胞(G5)在AGLCD患者,但在CD患者或健康献血者中不存在。1E,f),提示这些改变是脂肪营养不良的特异性改变,至少部分原因是瘦素缺乏,即瘦素受体缺乏。DB/db小鼠NK细胞频率也降低。22.

与CD患者和健康献血者相比,我们还检测到活化标记CD 38在CD11b上的高表达。+CD 86+、T细胞和NK细胞在AGLCD患者中的表达。1g,i-k),这与接受抗逆转录病毒治疗的HIV患者脂肪营养不良的发展有关。23人和小鼠的肠道炎症24由于dss引起的结肠炎在CD 38/小鼠25...值得注意的是,CD 38在CD8中显著上调。+CCR 7CD患者T细胞强调CD 38在CD中的潜在疾病传播作用。

此外,AGLCD患者在他的T和B细胞室中CCR 7的表达减少(如图所示)。1I,j,l),这意味着由于CCR 7的作用,淋巴细胞向脂肪组织的归巢过程中还存在一种额外的淋巴细胞转运障碍。26.

为了对AGLCD患者的淋巴细胞进行功能表征,我们用离子霉素/pma或lps刺激AGLCD患者、CD患者或健康供者的外周血单个核细胞,并通过流式细胞术测定肿瘤坏死因子α和干扰素γ的产生(补充表)。3和补充图。3)。如图所示。2A,b,我们观察到肿瘤坏死因子α和干扰素γ产生CD4的频率和平均荧光强度。+和CD8+T、NK细胞和CD 14+从AGLCD患者分离出的单核细胞与CD患者和健康供体细胞相似。同样,FOXP 3表达CD4的频率+T细胞在AGLCD患者和健康献血者中具有可比性(附图)。4).

图2
figure2

AGLCD患者免疫细胞功能和代谢的改变。采用流式细胞术对AGLCD患者、克罗恩病(CD)患者和健康献血者(HD)的PBMC进行比较。ab经PMA/离体霉素或LPS体外刺激后,(a)肿瘤坏死因子α产生和(b)测定干扰素γ产生T细胞、NK细胞和单核细胞,并分别测定细胞因子产生量的平均荧光强度(CD:n=5,HD:nT和NK细胞=6;CD:n=5,HD:n=5代表CD 14+细胞,生物独立样本)。c对未受刺激的NK细胞进行穿孔素和颗粒酶B表达与MFI表达率的关系分析(CD:n=5,HD:n=5,生物独立样本)。d用BODIPY染色法测定免疫细胞内脂滴的积聚情况(CD:n=5,HD:n=5,生物独立样本)。e储存Ca2+进入(SOCE)以CD8为单位。+AGLCD患者与HD患者T细胞的比较n=1,两者均为技术副本)。方框从第25百分位数延伸到第75百分位数。晶须图显示最小(最小)和最大(最大)值。方框中的线表示中间值。SOCE图上的错误条表示标准差(SD)。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, two-tailed unpaired T-测试,无需校正多个比较。源数据作为源数据文件提供。

AGLCD患者NK和T细胞分化受损

因为我们发现在AGLCD患者中NK细胞的频率降低了(如图所示)。1E,f)用流式细胞仪进一步对His NK细胞进行了定性和定量分析。与正常人和CD患者相比,AGLCD患者NK细胞表达细胞毒性分子穿孔素和颗粒酶B的频率较低,穿孔素表达也较低。相反,CD患者颗粒酶B的频率明显增高。+NK细胞(p < 0.001) and an increased expression level of granzyme B (p < 0.05) when compared to healthy donors, whereas perforin expression was similar in both groups (Fig. 2C)。此外,我们还观察到与健康人相比,AGLCD患者NK细胞中CD 56/CD 16的表达模式紊乱(补充图)。4)。这些数据表明,脂肪组织和脂肪组织衍生脂肪因子的缺乏导致NK细胞表型和功能的改变。

由于脂肪细胞中缺乏脂肪储存能力,导致脂肪营养不良患者出现高甘油三酯血症。19研究表明,脂滴在细胞内的积累通过代谢重排和随后颗粒酶B的下调而降低了NK细胞杀伤细胞的能力。27我们接下来测定了不同免疫细胞亚群中的脂滴含量。如图所示。二维空间,AGLCD患者在单核细胞、NK细胞和CD8中有较高的脂滴沉积。+T细胞与CD患者及健康供者比较。有趣的是,Greineisen等人。最近有报道说,脂滴的积累降低了淋巴细胞释放钙的能力。28,这是控制天真CD8的扩张所必需的。+T细胞通过组织代谢规划和诱导糖酵解29...随着脂滴积聚的增加,我们发现CD8中的钙稳态受损。+T细胞(图1.2E提示AGLCD患者脂质代谢紊乱与所观察到的功能和代谢免疫细胞功能紊乱有关。请注意,由于在AGLCD患者中NK细胞的频率很低,因此无法对NK细胞进行可靠的钙测量或功能杀伤试验。然而,葡萄糖摄取在AGLCD患者的PBMC中没有改变(补充图)。4)。观察到的AGLCD患者免疫细胞代谢的变化进一步反映在T和NK细胞中CD 38的表达增加,如CD 38,这是一种多功能酶,具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)核苷酶的活性。30,不仅是活化T细胞的标志31,但也被证明是规范NAD的+人CD4的代谢、氧化磷酸化和谷氨酰胺解+T细胞32.

rLeptin诱导的肿瘤坏死因子α的产生及免疫细胞的改变

由于AGLCD患者由于脂肪营养不良和连续的瘦素缺乏症而患上了极度胰岛素抵抗,我们决定重新启动rLeptin替代疗法,这之前曾在莱比锡大学(UniversityofLeipzig)对rLeptin的同情使用项目中启动过,但由于不遵从性,患者在入院前几个月就停止了。

患者每日皮下注射rLeptin 2.5mg。rLeptin给药4天后,AGLCD患者血清瘦素水平明显升高(图1)。3A)。因此,rLeptin替代降低了患者所需的胰岛素浓度。T、NK和单核细胞脂滴数量增加10倍,减少(图1)。3B),这也表现为一种脂滴结合蛋白adRP的表达降低(如图所示)。3C)。随着细胞内脂滴形成的减少,血清甘油三酯和总胆固醇水平在rLeptin治疗下也下降并恢复正常。5)。值得注意的是,rLeptin替代导致不同免疫细胞的促炎活性增加,其表现为NK和CD8中穿孔素的表达上调。+T细胞(图1.三维空间肿瘤坏死因子(α)表达细胞在离体刺激下的频率和MFI增加(如图1所示)。3E)。除了这些功能的改变,我们还检测到活化的CD11b的扩展。+CD 86+rLeptin应用后7天细胞(G3),而CD8a数量减少+CCR 7T细胞(G2)、CD 19+B细胞和CD8a+rLeptin治疗后发现NK细胞(G4)。3F,g).

图3
figure3

瘦素可诱导AGLCD患者的促炎免疫反应,促进创面的体外愈合。a血清瘦素水平的AGLCD患者(−)和(+)4d的rLeptin替代。B-g流式细胞术和质量细胞学分析rLeptin治疗4天和7天后对AGLCD患者PBMC的影响。bBODIPY染色法测定脂滴含量。c热图显示不同细胞亚群中不同功能标记物的平均表达(与reptin替代前相比)的相对变化(补充表中的质量流式细胞术抗体组B)2)(红色,折叠变化高于2(增加表达);黄色,折叠变化=0.1(减少表达)。d穿孔素表达测定为平均荧光强度(MFI)。e肿瘤坏死因子α-表达细胞及相应的MFI。f大量流式细胞仪数据的t-SNE生成的单细胞数据的二维投影(补充表中的抗体面板A)2)显示对(g)不同细胞亚群的频率。针对每个标记(红色、高表达度、蓝色、低表达),对t-SNE地图上所选标记的热颜色进行了缩放。hCBA法测定血清中不同免疫细胞衍生因子的水平ij健康供者外周血单核巨噬细胞耗氧率(OCR)在AGLCD患者血清(“瘦素-无”)和体内外瘦素/rLeptin替代(至少三倍,误差条显示±SEM,双向方差分析后和Holm-Sidak校正)的存在下进行评估。相应的细胞外酸化率(ECAR)在补充图中有报道。7. k用人T84肠上皮细胞在瘦素存在下进行划痕试验,评价体外伤口愈合情况。lm瘦素对TNF、α和IFNγ诱导T84细胞跨膜电阻的影响(错条显示为SD)。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, two-tailed unpaired T-测试(如适用)。源数据作为源数据文件提供。

在我们看来,观察到的NK细胞在rLeptin治疗后的表型和功能变化,包括CD 56表达模式的改变(补充图)。6)颗粒酶B和穿孔素的表达以及细胞因子的产生,表明瘦素是NK细胞分化和功能的重要调节因子。因此,瘦素受体缺乏的小鼠显示NK细胞发育和功能受损。22而瘦素对人NK细胞YT的增殖、杀伤能力和穿孔素的表达均有促进作用。33...然而,从NK细胞数量来看,即使在rleeptin替代后,NK细胞数量仍然很低,其他脂肪组织衍生因子,如脂肪因子和代谢物,很可能有助于正常NK细胞的发育,并且可能在缺乏脂肪的AGLCD患者中缺失。

流式细胞仪对PBMCs的深层免疫分析显示,在AGLCD患者的不同免疫细胞亚群中,rLeptin相关的促炎表型增加(图1)。3C和补充图。6)。例如,在CD11b中+CD 86+T细胞和NK细胞,我们发现rLeptin治疗后精氨酸酶-1降低,CD 86表达增加。3C)。精氨酸酶-1已被认为是交替激活的巨噬细胞的标记物。34是先天性淋巴样细胞2型氨基酸代谢和糖酵解的重要内在调节因子。35...此外,我们还观察到T、NK和CD11b中CD 38的表达降低。+CD 86+rLeptin给药后的细胞,支持NAD的瘦素依赖性调节。+这些细胞代谢对谷氨酰胺解和能量代谢的下游作用30,32...此外,我们还发现应用rLeptin后,血清中几种促炎单核细胞源性细胞因子(G-CSF、MIG和MIP-1β)的浓度增加(如图1所示)。3H),表明rLeptin替代导致髓系细胞活化增加。

结果表明,脂肪细胞和脂肪因子对免疫细胞的代谢重新编程会触发特定的分化程序,从而决定它们的功能。36,37...因此,促炎巨噬细胞的能量平衡高度依赖于糖酵解,而脂肪酸氧化则是具有抗炎作用的巨噬细胞的一种特征。38...因此,当我们在接受rLeptin替代后从AGLCD患者获得的血清中分化出健康供者的单核巨噬细胞时,与未接受rLeptin血清的巨噬细胞相比,细胞的线粒体呼吸减少(见图)。3I,j),而它们的细胞外酸化率(ECAR)是可比的(补充图)。7)。同样,体外扩增CD8+与不含rLeptin的AGLCD患者血清相比,T细胞的耗氧量和细胞外酸化率均发生变化。89),提示瘦素直接影响免疫细胞的生物能量学。

肠上皮细胞表达瘦素受体39瘦素对上皮细胞有直接作用。2我们希望通过观察人肠上皮细胞的创伤愈合能力和上皮抵抗,探讨瘦素是否影响肠炎症中上皮屏障的动态平衡。如图所示。3KLeptin在T84细胞划痕试验中改善了伤口的体外封闭,而不改变上皮抵抗(图一)。3L,m).

rLeptin替代下的肠道炎症

我们的AGLCD患者在rLeptin替代和以前发生的结构损伤,特别是瘘管的发展中观察到的高疾病活性导致了一个脓肿,最终导致回肠结肠切除和回肠末端造口术(无花果)。1D4A)。所有切除的肠段均检测到严重的炎症(如图所示)。4B)。免疫组化结果(补充表)4)与CD患者比较,α表达细胞在肠粘膜固有层内大量浸润(图1)。4C)。根据我们的大量流式细胞仪数据,我们进一步观察到活化的CD 86有较高的浸润。+AGLCD患者的细胞。4D,e),表明AGLCD患者在手术时肠内有肿瘤坏死因子(α)依赖性的炎症活动。考虑到我们关于rLeptin治疗对AGLCD患者PBMCs的影响的数据(如图所示)。3)因此,我们假设rLeptin治疗会在肠内引起肿瘤坏死因子α驱动的促炎免疫反应,引起CD的严重恶化。

图4
figure4

抗肿瘤坏死因子(α)α治疗可逆转rLeptin治疗过程中肿瘤坏死因子(TNF)引起的肠道炎症.aerLeptin替代下的持续炎症和先前的结构损伤(狭窄和瘘管所致脓肿)使直肠结肠切除术和回肠切除必须在rLeptin治疗开始后16天。标本(a)用H&E染色(标尺标出100μm)进行组织学分析。b),表现为严重炎症,免疫组织化学染色(IHC);ce). cAGLCD患者和克罗恩病(CD)患者肠组织中肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤坏死因子(α)和CD 206染色的显微图像(标度栏显示20m,图像用蔡司的AxioImagerZ1记录)。d不同免疫细胞标记的IHC染色的附加图片(用PerkinElmer的Vectra3系统记录,标尺显示20m)和(e)每10个高功率场的细胞染色阳性(CD 45、CD 163和adRP染色-共11个组织样本)n=7例独立的CD对照患者与AGLCD患者(n=1);对于肿瘤坏死因子α和CD 206染色,共9个样本n=6例独立CD患者,并与AGLCD患者比较(n=1);CD11b、CD 86和iNOS染色共6个样本n=3例独立的CD患者与AGLCD患者比较(n(1)对同一患者的多个标本进行分析时,从不同的解剖位置提取组织,盲分析)。方框从第25百分位数延伸到第75百分位数。晶须图显示最小(最小)和最大(最大)值。方框中的线表示中间值。fi术后,rLeptin继续治疗,病人在回肠造口术末开始出现新的炎症。临床决定启动抗肿瘤坏死因子α治疗,同时继续替代雷帕汀,从而导致克罗恩病的临床和内镜缓解。f开始抗肿瘤坏死因子α治疗前和6个月后内镜检查照片的比较。gi流式细胞术分析抗肿瘤坏死因子α治疗对.g)肿瘤坏死因子(α)和(h)体内外刺激后产生的干扰素γ,以及(I转录因子FOXP 3和RORγt(“抗肿瘤坏死因子前α”结合三个不同时间点的数据)的表达。列图表上的错误条显示标准偏差(SD)。源数据作为源数据文件提供。

肿瘤坏死因子α−阻断下AGLCD患者的稳定缓解

手术后,病人继续用rLeptin替代以改善胰岛素敏感性,随后在回肠造口术末期再次发展为黏膜炎症,进一步支持了rLeptin驱动的肠道炎症的概念。由于rLeptin替代物增加了肿瘤坏死因子α的产生,我们决定使用阿达利莫单抗进行抗肿瘤坏死因子α治疗,6个月后临床和内镜下得到稳定的缓解(如图所示)。4F)。此外,肿瘤坏死因子α阻断不仅抑制了CD4中TNFα和IFNγ的产生。+和CD8+T细胞,但也增加了FOXP 3的频率。+CD4+用流式细胞仪检测AGLCD患者的T细胞。4G-I).

讨论

总之,我们的结果揭示了脂肪组织在肠道炎症中的复杂调节作用,以及rLeptin对人体免疫细胞组成、功能和代谢的免疫刺激作用。10)。法鲁奇等人瘦素替代能促进3例先天性瘦素缺乏症患者T细胞增殖和细胞因子的产生。然而,在没有伴随的炎症疾病的情况下,没有在体内检测到炎症反应。16...同样,口头等。观察到rLeptin治疗4个月后10例全身性脂肪营养不良患者外周血单个核细胞中肿瘤坏死因子α的产生增加,但未发现共同炎症疾病的诱导或加重,因此未报告自身免疫性并发症。40...我们现在的结果表明,在预先存在的炎症状态下,瘦素治疗通过诱导产生肿瘤坏死因子α的细胞和通过代谢启动免疫细胞来促进炎症和增加自身免疫中的疾病活动。始终如一,Javor等人。先前推测rLeptin替代可能是通过诱导两例全身性脂肪营养不良患者自身免疫而导致膜增生性肾小球肾炎恶化的原因之一。研究rLeptin替代对脂营养不良患者肾功能的影响。41...值得注意的是,AGLCD患者在整个研究过程中接受了免疫抑制药物治疗,这很可能影响了他的免疫细胞组成。然而,在我们的研究过程中,药物并没有改变,尽管用霉酚酸酯(MMF)和他克莫司(他克莫司)免疫抑制,rLeptin所描述的促炎作用仍被观察到。此外,我们不能完全排除使用mff对aglcd患者的肠道炎症的影响,因为mmf治疗与慢性腹泻有关,抗TNFα治疗可以逆转慢性腹泻。42,43...然而,我们认为肉芽肿的组织学表现(补充图)。11),炎症的发炎性质(如图所示)。1A),以及mff开始前肠自身免疫的发生强烈反对aglcd患者由mmf驱动的肠道炎症,因为在mfd所致的结肠炎中没有发现这些特征。44...即使我们不认为MMF可以触发AGLCD患者的肠道炎症,抗TNF治疗对于治疗瘦素引起的炎症以及MMF引起的潜在副作用都是有益的。

因为我们的发现是基于对一个AGLCD患者的观察,其临床过程非常复杂(如图所示)。1D),我们的结果的普遍性可能是有限的,这将是重要的进一步验证我们的发现在更多的获得性广泛性脂肪营养不良和伴随的自身免疫性疾病,不幸的是,由于这些患者的极端罕见和AGLCD患者的奇异性很难执行。然而,我们相信,我们的结果仍然提供了关于瘦素在人类肠道炎症中的免疫刺激潜力的有价值的洞见,这在小鼠中被观察到为瘦素缺乏所支持。OB/ob保护小鼠免受dss所致结肠炎的影响。6Leptin受体的药物抑制减轻IL 10/小鼠结肠炎模型7...我们认为,瘦素因此不会直接引发炎症(否则,rLeptin替代物会引起各种形式的脂肪营养不良症的自身免疫,但情况并非如此),而是通过促进促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子α)的产生和调节自身反应性淋巴细胞的免疫细胞分化和细胞扩张来增强自身免疫。此外,我们的观察还支持瘦素在正常免疫细胞功能中发挥更广泛的作用,因为瘦素缺乏与glcd患者和瘦素受体缺陷患者的NK细胞减少和受损有关。DB/db小鼠22提示瘦素缺乏可能是功能性免疫缺陷的原因之一。因此,营养不良和连续低水平瘦素患者易患严重感染,包括利什曼病和阿米比病,这是由于T和NK细胞功能受损造成的。45.

我们知道,我们的研究不允许区分rLeptin替代物对免疫细胞的直接和间接作用,因为多种共同形成的代谢因素可能有助于观察到AGLCD患者瘦素的免疫刺激功能,包括瘦素介导的食欲、血脂、血糖和胰岛素敏感性的调节。然而,Reis和他的同事最近可以明确地表明,瘦素作为缺乏leptin受体的CD4,直接影响肠道自身免疫中淋巴细胞的功能和分化。+T细胞勒珀fl/fl-CD4-CRE结肠炎转移模型小鼠未能诱导肠道炎症46...因此,我们的小组观察到了一个明显的延迟性结肠炎的发病。SCID小鼠CD4转移后+瘦素受体缺陷型T细胞DB/db小鼠由于缺乏促进炎症的细胞因子,包括干扰素γ11进一步支持瘦素在炎症性肠病中的促炎作用。

我们的结果进一步有助于更好地理解肠系膜脂肪在肠道炎症中的复杂作用,因为在动物模型中很难进行研究。值得注意的是,Paul等人。以前曾描述过,瘦素在克罗恩病患者的爬行脂肪中是升高的47...因此,高脂负荷的CD患者血清瘦素水平升高,内脏脂肪含量与疾病活动密切相关。48...根据这一观察,爬行脂肪是瘦素和其他促炎细胞因子的局部来源,Coffey和他的同事最近在一项小型回顾性研究中发现,CD患者肠系膜脂肪和蠕动脂肪的根治性切除可以提高患者的无复发生存率。49...我们的研究小组曾在小鼠身上观察到,在dss治疗的野生型小鼠中,肠道炎症和随后细菌移位到肠系膜脂肪中,以tlr依赖的方式诱导脂肪细胞局部产生瘦素。MyD 88−/小鼠50.由于大量浸润的脂肪与CD8等淋巴细胞+T细胞和单核细胞51,有理由认为局部瘦素的产生会影响体内脂肪淋巴细胞的分化和功能,尤其是在T细胞表达瘦素受体和瘦素受体缺乏的T细胞不能诱发小鼠结肠炎的观察方面。11,46...然而,还需要更多的研究来解释爬行脂肪在克罗恩病发病机制中的免疫调节功能,这种作用很可能是由爬行脂肪分泌的额外脂肪因子和代谢物的累积效应组成的。

总之,我们相信我们的发现可能对接受rLeptin替代治疗的患者有重要的意义。由于获得性全身性脂肪营养不良与自身免疫性和炎症性疾病有关,约有25%的病例19,可能有更多的脂肪营养不良患者,其中rLeptin治疗伴随的炎症疾病的活动增加。因此,我们的研究提供了第一证据,在这种情况下,抗肿瘤坏死因子α治疗应该考虑控制自身免疫,同时保持rLeptin替代来控制脂肪营养不良的代谢控制。

方法

伦理规范

从所有患者和健康志愿者那里获得书面知情同意,包括同意公布临床信息、可能识别个人。所有实验都得到了柏林慈善大学机构审查委员会的批准,并进行了相应的工作。对于涉及人类参与者的研究,作者们遵守了所有相关的伦理规则。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

分别从AGLCD患者治疗前后及7例CD患者和5例健康对照者的外周血中提取血清。采用人瘦素双抗体ELISA试剂盒(R&D系统)测定血清瘦素水平。

外周血单个核细胞的分离

在瘦素重建前后的不同时间点采集AGLCD患者的肝素化血。健康献血员和CD患者的血液作为对照。用生物浓缩法(Merck)进行密度梯度离心分离PBMC。用20%胎牛血清(FBS;Sigma)和10%二甲基亚砜(Sigma)替代RPMI 1640(热Fisher科学)冷冻细胞,并直接保存在液氮中。根据我们先前公布的协议,用Smarttual缓冲液固定和冷冻细胞,然后将其保存在−80°C。21.

大规模流式细胞术细胞内条形码的研究

对AGLCD患者在rLeptin替代前后的Smarttube缓冲液固定PBMC、6例CD患者和5例HD患者的细胞进行解冻,然后用6种不同钯同位素的预组合染色:102警察,104警察,105警察,106警察,108警察,和110PD(细胞ID 20-复合PD条形码试剂盒,Fluidigm)。室温(RT)染色30 min后,用细胞染色缓冲液(0.5%牛血清白蛋白,含2mMEDTA)洗涤两次。样本汇集在一起,清洗后再用抗体染色。抗人抗体(补充表)2)要么是预共轭金属同位素(Fluidigm),要么是从商业供应商那里购买的纯化形式,并在家中使用MaxPar X8试剂盒(Fluidigm)按照制造商的协议。

表面和细胞内染色法用于质量流式细胞术

经细胞条形码、洗涤及制粒处理后,将组合样品重新悬浮于100升抗表面标记抗体鸡尾酒中(补充表)。2)在4°C下孵育30 min,用细胞染色缓冲液冲洗两次。细胞内染色用固定/渗透缓冲液(Fix/Perm缓冲液,eBioscience)在4°C下孵育60 min,然后用渗透缓冲液(EBioscience)冲洗两次。然后用针对细胞内分子的抗体鸡尾酒染色(补充表)。2)在4°C的渗透缓冲液中浸泡1h,然后用渗透缓冲液冲洗两次,在2%无甲醇甲醛溶液(热Fisher)中孵育一夜。固定细胞洗净后在1ml铱插层液(Fluidigm)中再悬浮1h。然后,用细胞染色缓冲液冲洗两次,然后用DDH洗两次。2O(Fluidigm)将细胞球团化,将其保存在4°C,直至细胞TOF测定。

细胞TOF测量

使用升级到Helios规范的CytoF 2对细胞进行分析,软件版本为6.5.236。该仪器是根据制造商的指示调优溶液(Fluidigm)和EQ四元校准珠(Fluidigm)的测量。140/142行政长官,151/153欧盟,165何和175/176鲁作为灵敏度和回收率的质量控制。直接在分析前,细胞在DDH中被重新悬浮。2O,过滤(20m celltrix,sysmx),计数并调整为3-5×105在样品体积的1:10的浓度下加入EQ四元素校准珠,使数据正常化,以补偿信号漂移和仪器灵敏度的日常变化。以300~400个事件/s的速度采集样本,将较低的卷积阈值设置为400,在事件持续时间为10-150时设置降噪模式和单元定义参数。所产生的流式细胞术标准(FCS)文件被标准化和随机化,使用CytoF软件的内部FCS处理模块对非随机(原始)数据进行处理。根据软件中的默认设置使用设置,时间间隔为正规化(100 s/至少50珠子)和护照版本2。每100 s少于50珠子的间隔被排除在FCS-文件中。细胞银行(www.cytobank.org)用于活单细胞的初始手动门控,去条形码和ViSNE生成t-SNE映射.包含t-SNE嵌入的FCS文件作为额外的两个参数从Cytobank导出,用于使用GraphPad Prism 6进行下游勘探和统计分析。

流式细胞术

为评价细胞因子的产生情况,将AGLCD患者PBMC、5例CD患者PBMCs和6例HD患者PBMCs解冻培养4h,加入10%胎牛血清,加入20 ng/ml佛波酯(PMA;Sigma-Aldrich)和1g/ml离诺霉素(Sigma-Aldrich)或100 ng/ml脂多糖(Sigma-Aldrich)。在采收前加入Bregeldin A(10g/ml;Sigma-Aldrich)2 h。然后用可固定的染料(活的/死的™aqua;热Fisher科学或僵尸紫罗兰™;BioLegend)对细胞进行染色。随后,谱系标记(补充表)3)染色,应用Foxp 3染色装置(热Fisher科学)固定,细胞内和核内染色按照制造商规程(补充表)进行。3)。样本用CantoⅡ流式细胞仪(BD生物科学)测量。用FLOWJO软件包V10.1(Flowjo,LLC)对数据进行分析。

脂滴形成

将解冻后的PBMC与0.2g/ml的BODIPY染料(热Fisher科学)孵育30 min,然后用流式细胞仪进行染色和分析。BODIPY染色与全非BODIPY染色样品(ΔMFI)的平均荧光强度差异可作为脂滴含量的测量指标。

葡萄糖内流

为了评估免疫细胞对葡萄糖的摄取,将AGLCD患者或HD患者的PBMCs在PBS中饥饿30 min。随后,将荧光葡萄糖类似物2-NBDG的100μm加入细胞内,流式细胞术检测不同免疫细胞亚群中2-NBDG的MFI。ΔMFI按BODIPY实验的描述进行计算。

钙测量

钙测定:HD患者和AGLCD患者的PBMCs解冻30 min,用钙敏感染料Fluo-4AM(2μg/ml;热Fisher科学)染色。如前所述,流式细胞术测定钙内流。52...实验在技术复制件上进行。数据用FlowjoV8.8.7进行分析。

细胞学珠阵列

采用EBioscience的Flow Cytomix复合试剂盒,测定患者rLeptin替代前后血清G-CSF、MIG、MCP-1和MIP-1β浓度。利用BD生物科学的FCAPArray™软件V3.0对数据进行分析。

海马分析

单核细胞,CD4+或CD8+用基于珠的CD 14阳性选择试剂盒从健康供者外周血单个核细胞中分离T细胞。+,CD4+,或CD8+细胞(Miltenyi Biotec)。将单核细胞极化为巨噬细胞,加入10 ng/ml GM-CSF(PeproTech);T细胞经平板结合抗CD3(来自eBioscience,克隆OKT 3)和抗CD 28(来自BD生物科学,克隆CD 28.2)刺激3天后,在含20 ng/ml IL-2(PeproTech)的培养基中扩增4天。在所有实验中,RPMI 1640培养基分别在rLeptin重建前后添加10%的血清(±rLeptin)、在体外添加1μg/ml瘦素的AGLCD血清(−reptin)或添加健康献血者血清(HD)。培养6~7天后,用细胞Mito应激试验试剂盒(Agilent)在96井的海马FX平板阅读器上测定氧耗率和细胞外酸化率。

组织病理学

取AGLCD患者肠组织石蜡切片和3~7例CD患者不同解剖部位的6-11份标本,用苏木精和伊红(H&E)或免疫组织化学染色,用补充表中所列抗体进行染色。4...抗体检测采用Opal 4-彩色手册IHC试剂盒(PerkinElmer).多光谱图像是使用Vectra 3成像系统(PerkinElmer)获取的。用PERKINEMER软件对10个高功率场(视野为×400原始放大镜)中的阳性细胞进行量化。所有评价都是以盲目的方式进行的。用于获取图中所示的免疫荧光图像。4D使用了AxioImager Z1(Zeiss)。

划痕试验

从ATCC中分离人T84结肠上皮细胞,用小管尖诱导培养24孔板和划痕。1g/ml重组人瘦素或载体(PeproTech)。每个划痕的照片是在开始和结束时(8天或直到第一次划痕被关闭),使用Axiocam 105彩色相机在蔡司普里莫弗特显微镜上拍摄。用MiTobo划痕分析仪(ImageJ)测定划痕面积,并将划痕面积(Δ面积)的变化归一化为对照组的平均Δ面积。

经皮电阻测量

将人T84细胞作为单层,放置在含DMEM高糖培养基(4.5g/l葡萄糖,来自热Fisher科学公司)、10%FBS和1%青霉素/链霉素的24孔板上。基线时,在细胞中加入1g/ml瘦素或载体(PBS)。在培养液中加入2 ng/ml重组人肿瘤坏死因子α和2 ng/ml干扰素γ(均来自PeproTech),诱导上皮渗漏。分别在24和48h后测量井内电极和跨井电极之间的电阻。经皮电阻测定为:测量的电阻减去未培养条件下的电阻(130Ω),乘以跨孔面积(0.6cm)。2)。结果在各自井的基线处被标准化为TEER。

统计分析与图表

使用GraphPad棱镜7.00版进行统计分析和图形数据表示。如果没有其他指示,则双尾未配对。T-采用不经多次比较校正的试验。在海马分析中,采用一种与“AGLCD(-rLeptin)”相比较的双向方差分析方法,并与Holm-Sidak校正进行多重比较。结果被认为具有统计学意义p < 0.05.

外显子测序

从病人以及他健康的母亲、姐姐和兄弟身上提取了血源dna。利用IDT×GENExome研究小组v1.0和2×75 bp对这4个样品进行外显子富集,并在IlluminaHiSeq 3000上进行了配对测序。这些读取被映射到人类参考基因组,使用bwa构建hg 19。53,排序,转换为bam格式,并使用Samtools进行索引。54,然后删除PCR重复,在indels周围进行局部调整,并根据GATK重新校准基础质量分数。55根据他们的最佳实践建议,然后是变异调用和变体质量评分重新校准。使用Alissa解释器(Agilent)执行变体注释和过滤。

报告摘要

有关研究设计的进一步资料,可参阅自然研究报告摘要链接到这篇文章。

数据可用性

图中的源数据。1b,1f-l,2A-E,3A-E,3G-h,3J-k,3M,4e,4G-I和附图。1A-E,2A-C,4一个,4C-E,5, 6A-C,6e,7, 89A作为源数据文件提供。所有质量和流式细胞仪数据集,以及在本研究期间产生和分析的外显子测序结果,在合理要求下可从相应作者处获得,但不包括保密的病人信息,因为AGLCD患者及其亲属不同意将其个人数据存入公共存储库。





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