一种用于高度保守序列分析的多蛋白多基因型免疫原的设计 我们的定制保护软件以两种不同的方式使用，取决于每个基因型之间共享的保守性水平，从而产生(I)变体或(Ii)嵌合体(图1)。 1 )。我们的默认方法是创建变体(如图所示)。 1A )。对于这种方法，所有基因型都通过保守算法一起使用一个15个氨基酸滑动窗口。这就识别了每个基因型(基因型内保存)中保存的窗口，使用的是程序定义的切断。然后，为每个被保存的窗口(或一组窗口)创建一个标准化的协商一致序列，称为内部共识。随后，确定了不同基因型在同一窗口位置上保守的区域(一个或多个相邻窗口)(基因型间保守)。对于每个基因型间的保守区域，使用内部一致性序列和由聚类的基因型(最终产品)创建的一致性树来创建相邻的连接树。
图1 说明HPV疫苗设计的变异和嵌合方法的原理图。( A )变异免疫原设计。( B )嵌合免疫原设计。色系代表HPV蛋白序列，颜色代表不同基因型。
由于HPV蛋白的独特的系统发育聚类，在某些情况下，基因型之间的距离是如此显著，以至于基因型之间没有适当的排列。因此，对该方法进行了修改，并在分析邻接树之前首先创建了邻接树.然后对聚类的基因型进行排列，并通过算法一起运行，并像以前一样，评估基因型内和基因型间的保守性，并达成最终共识。由此产生的碎片被称为嵌合体(如图所示)。 1B ).
对整个人乳头瘤病毒蛋白组进行分析，发现23个区域具有多个基因型之间的保守性，并能够产生59个保守片段，其中包括17个变异体和42个嵌合体。这些片段共有1283个氨基酸，平均片段长度为21个(8~54 aa)。有11个来自E1，24个来自E2，9个来自E4，3个来自E5，8个来自E6，4个来自E7。每种蛋白的氨基酸总量中，E1占免疫原的16%，E2占36%，E4占13%，E5占6%，E6占18%，E7占10%。直接结合片段，形成5 GHPV3免疫原(专利号WO2019034887)。
异源ChAdOx1-5GHPV3优质MVA-5GHPV3促进近交系小鼠T细胞反应的研究 为评价5 GHPV 3在近交系小鼠体内的免疫原性，采用不同的一级增强方案，将6只C57BL/6雌性小鼠接种DNA-5 GHPV3、MVA-5 GHPV3或ChAdOx1-5GHPV3，2周后用异源或同源载体疫苗增强5 GHPV3的免疫原性。
用DNA、MVA或ChAdOx1载体单次免疫后，我们检测到5 GHPV 3特异性T细胞反应。人乳头瘤病毒特异性T细胞数量最多的是ChAdOx1载体介导的5 GHPV3，平均(SD)27574(9506)sfu/万pBMCs。DNA和MVA-载体5 GHPV3分别诱导3451(3818)和2722(944)SFU/百万PBMC的平均(SD)反应。用MVA非亲缘、ChAdOx1无关或空DNA疫苗免疫的小鼠，其转基因特异性应答均低于100 sfu/百万PBMC。三种主要疫苗诱导的T细胞反应在同源和异源增强免疫后均有所增加。然而，CM方案在增强后两周产生最强的反应(平均(SD)总反应为84736(13022)sfu/百万PBMC)，这明显高于任何其他异源或同源方案的免疫(p<0.0001；图1)。 2A )。所有疫苗接种方案后，反应主要针对E6、≥、E7>E4/5(补充图)。 S2 )。CM免疫小鼠对E1和E2的低反应率高于接种DD、MM、CC或DM的小鼠(分别为2775 vs 295、890、659、1539 SFU/百万PBMC)。
图2 用干扰素-γELISPOT法测定不同接种方案对5-GHPV3 T细胞反应的影响。C57BL/6小鼠(6只/组)肌肉注射dna-5 GHPV3(100 G)、MVA-5 GHPV3(1×10)。 6 或ChAdOx1-5GHPV3(1×10) 8 两周后，用异源或同源疫苗促进肌肉内注射。两周后行尾静脉出血，1周和2周后行抽血。根据蛋白来源，用跨越整个免疫原序列的多肽刺激PBMC。提供的数据如下： A )所有池的响应之和。在增强免疫后3、4和6周做了进一步的尾静脉出血( B )。水平线以标准差表示平均值。单因素方差分析与图基的多重比较检验。*p≤0.05，**p≤0.01，*p≤0.001，*p≤0.0001。
除DM外，所有同源和异源的主要刺激方案均在两周后观察到HPV特异性T细胞反应高峰，这种反应发生在一周内。CM免疫小鼠6周后仍可检测到大量人乳头瘤病毒特异性T细胞(平均(SD)：33117(10764)sfu/百万pBMCs，图)。 2B )免疫优势等级在这一点上没有变化。
5 GHPV 3疫苗诱导的T细胞是多功能的，并产生与细胞毒性有关的细胞因子。 本实验采用细胞内细胞因子染色法(ICS)检测免疫后2周的小鼠脾细胞内细胞因子γ、TNF-α、IL-2和CD107a的表达。与ELISPOT数据一致，CM方案诱发的E6特异性IFN-γCD8+T细胞频率最高(平均(SD)6.2%(1.4%))，占CD8+T细胞总数的1.4%。 3A )。免疫组小鼠的α+、IL-2+、CD107a+细胞较其他治疗组明显增强(P<0.0001、0.0003和<0.0001)。 3A )。CM免疫后还检测到HPV特异性CD4+T细胞(CD3+CD8门控群)，但占免疫后2周脾脏CD4+T细胞总数的0.4%(0.4%)。 3B )。用布尔门控法计算单功能T细胞和多功能T细胞的比例。这表明，高比例的人乳头瘤病毒特异性CD8+T细胞同时表达干扰素-γ，肿瘤坏死因子-α和CD107a，这是一个细胞毒性潜力的指标(图)。 3C )。我们还比较了增强后1周和6周对E6和E7的反应：虽然IFN-γ+、TNF-α+和CD 107+CD8+T细胞在这段时间内已经收缩，但仍处于高频状态(补充图)。 S3A )。IL-2+CD8+T细胞在第6周增加，与记忆反应的发生一致(E6从1.3%增加到3.1%，E7从0.6%上升到0.8%)。用人乳头瘤病毒特异性CD8+T细胞观察到外周血中hpv特异性CD4的数量。 + 增强后1至6周，干扰素-γ+T细胞从2.6%下降到0.7%，但产生IL-2的人乳头瘤病毒特异性CD4+T细胞百分比保持不变(0.7%vs 0.6%)，表明CD4持续存在。 + T细胞帮助(附图) S3b ).
图3 5 GHPV 3特异性T细胞的功能特征。C57BL/6小鼠(6/组)分别接种MVA-5GHPV3和Boost(MM)、DNA-5GHPV3和Boost(DD)、ChAdOx1-5GHPV3和Boost(CC)、DNA-5GHPV3(DM)和ChAdOx1-5GHPV3/Boost(CM)。两周后取脾细胞，用跨越整个免疫原序列的肽刺激脾细胞，按蛋白来源聚合，用细胞内染色法检测IFN-ɣ、CD 107、TNF-α和IL-2。显示的数据是( A )E6特异性CD8+T细胞应答和( B )E6-特异性CD8 − (CD4+)T细胞反应。( C 用5 GHPV3E6和E7肽池刺激C57BL/6小鼠PBMC，每组6只，每组6只。采用PEARCH和SPICE软件检测E6/E7特异性CD8+T细胞的多功能。水平线以标准差表示平均值。单向方差分析，图基的多重比较检验。*p≤0.05，**p≤0.01，*p≤0.001，*p≤0.0001。
系统免疫后hpv特异性效应T细胞进入宫颈 由于在女性生殖道内诱导有效和持久的免疫反应是拦截hrHPV病所必需的，因此用两种异源免疫方案DM和CM接种小鼠后对此进行了评估。升压后6周，用胶原酶消化宫颈卵巢组织，分离出宫颈阴道淋巴细胞。平均(SD)为46842(13030)个CD3+淋巴细胞。CM组小鼠CD8+T细胞中E6和E7肽特异性分别为16%和18%，DM组分别为3%和5%。 4A )。CD 107+颈段CD8+T细胞也有相同的变化趋势，但无显着性差异(P>0.05)。HPV特异性CD4+T细胞在两种免疫方案后的子宫颈阴道区也被检测到，尽管频率较低(CM为0.02%，DM为0.003%)，无花果。 4A ).
图4 5GHPV3特异性CD8+T细胞在应用异源一级增强疫苗后，可在子宫颈内检测到具有效应表型的CD8+T细胞。( A C57BL/6小鼠(6/组)接种DM或CM方案。用5 GHPV3E6和E7肽刺激培养6周后的子宫颈阴道淋巴细胞，用免疫组化法检测IFN-ɣ、CD 107、TNF-α和IL-2的表达。( B )对接种CM疫苗的小鼠，分别在升压后1周和6周比较宫颈阴道淋巴细胞的反应.由于细胞数量少，老鼠被集中在一起。( C 5 GHPV3E6特异性T细胞CD49d/CD 29(α4β1，CD49d/CD 29)在C57BL/6小鼠C57BL/6小鼠升压后2周时在子宫颈淋巴细胞、脾细胞和PBMC中表达的比较 D )在CM组与DM组中接种C57BL/6小鼠。检测5 GHPV3E6或E7特异性T细胞分化/记忆标记的表达。 E )颈阴道淋巴细胞和( F C57BL/6小鼠脾细胞，每组6只，每组6只，每组6只，分别于第1周(顶板)和第3周(下板)接种CM。由于细胞数少，样品被汇集在一起。效应器(CD62L) − 、CD 127 − )，效应器存储器(CD62L) − ，CD 127+)和中央记忆(CD 62+，CD 127+)。水平线以标准差表示平均值。双向方差分析，西达克的多重比较检验。*p≤0.05，**p≤0.01，*p≤0.001，*p≤0.0001。
对HPV特异性T细胞反应动力学的进一步分析表明，CM组在升压后1~6周，HPV特异性CD8+T细胞的频率从12%增加到18%，提示HPV特异性细胞继续从外周向宫颈阴道区迁移。 4B )。与此相一致的是，与人乳头瘤病毒特异性外周血单个核细胞和脾细胞相比，疫苗特异性的宫颈阴道CD8+T细胞表达的α4β1整合素(CD49d/CD 29)明显高于人乳头瘤病毒特异性PBMC和脾细胞(p=0.0094，图1)。 4C )。此外，采用CM方案后，α4β1在各区(宫颈、血液和脾脏)的表达率均显著高于DM组(p<0.0001)。 4D )。CD4+和CD8+HPV特异性宫颈阴道淋巴细胞几乎完全是效应表型(CD62L)。 − 、CD 127 − )，在升压后一周和三周(如图所示)。 4E )。相比之下，来自脾脏的hpv特异性CD4+和CD8+细胞是一种混合效应和效应记忆表型(CD62L)。 − ，CD 127+)，后者随时间的增加而增加。 4F )。与人乳头瘤病毒特异性脾细胞和外周血单个核细胞一样，人乳头瘤病毒特异性的宫颈阴道淋巴细胞是多功能的，大多数CD8+细胞表达干扰素-ɣ、CD 107和肿瘤坏死因子α。
异源升压方案诱导的小鼠T细胞应答全5 GHPV3免疫原的靶抗原表位 由于近交系小鼠的T细胞反应倾向于少数免疫显性表位，我们免疫近交系(CD1)小鼠，以便比较CM和DM方案诱导的HPV特异性反应的广度。单独使用dna-5 GHPV3或ChAdOx1-5GHPV3诱导循环HPV特异性T细胞的低频率(平均(SD)3170(1924)和13611(5252)sfu/百万PBMC，而C57BL/6小鼠则分别为3451和27574 sfu/百万PBMC)。MVA-5 GHPV3对这些反应的促进作用分别为64734(64248)和73933(68158)sfu/百万PBMC。两周或三周后CM组与DM组的反应强度无显着性差异(图1)。 5A )。然而，与C57BL/6小鼠的免疫优势等级相比，CD1小鼠的T细胞反应在5 GHPV3免疫原中所有6种早期蛋白的序列中分布更为均匀。 5B ，补充图。 S4 ).
图5 异源优质疫苗诱导近交系小鼠T细胞反应几乎是整个5 GHPV3免疫原的靶点。CD1小鼠(10只/组)肌肉注射dna-5 GHPV3(100 G)或ChAdOx1-5GHPV3(1×10)。 8 两周后用MVA-5 GHPV3(1×10) 6 PFU)。用IFN-γELISPOT法测定刺激后2周、2周和3周的PBMC反应，并根据蛋白来源，与整个免疫原序列相结合。( A )所有池的求和响应和( B )显示每个肽池的反应。( C 用免疫CM或DM免疫小鼠3周后，检测脾细胞中5 GHPV 3特异性CD8+T细胞的频率。未配对t检验，*p≤0.05。( D )对10只CD 1小鼠的脾细胞进行5 GHPV3各节段的反应定位，并于增强后2周进行CM免疫小鼠的脾细胞定位。水平线以标准差表示平均值。
增强后3周脾细胞细胞内染色显示，CM组CD8+IFN-γ+T细胞明显高于DM组(平均(SD)0.97%(0.37)vs 0.52%(0.51)p=0.03，P=0.03)。 5C )。两种方案均检测多功能人乳头瘤病毒特异性CD8+T细胞(CD 107、TNF-α和IL 2双重或三重阳性)和CD4+T细胞(IFN-γ、CD 107和IL 2双重或三倍阳性)。两种疫苗方案在多功能T细胞百分比上差异无显着性(P>0.05)。
在我们的疫苗设计中，一个关键的考虑因素是提供至少五个hrHPV基因型的覆盖。为此，将5 GHPV 3序列对应的重叠肽按片段重新组合，并在免疫后2周收集脾细胞的IFN-γELISPOT法中进行检测。平均反应超过25 sfu/百万脾细胞(从平均+3 SD模拟刺激井值)被观察到32个在59个节段(图)。 5D )。在59个片段中的57个片段中，每组至少有一只老鼠的反应超过了这一切断(如图所示)。 5D )，说明转基因的几乎所有片段在近交系小鼠体内都具有免疫原性。例如，5GHPV3中有8个片段覆盖了5个不同的hrHPV基因型的E6区域，其中7个片段在CM注射后2周产生了阳性反应。
5 GHPV3序列特异性T细胞在接触hrhpv的妇女中可检测到。 接下来，我们希望确认编码在5 GHPV 3中的多基因型共识序列包含由天然的hrHPV启动的T细胞识别的表位。我们表演 体外 从性活跃妇女中筛选出代表终生接触hhpv谱的γelispot试验：第1组为16至24岁的妇女，被预测为偶发性感染和暂时性感染；第2组为25至55岁的妇女，她们被预测患有持续性感染。如“材料和方法”所述，对妇女进行了抽样调查。由于这项研究正在进行中，我们只报告基线数据。
在第1组中，HrHPV感染率为25%(有现有数据的妇女27人；所有非疫苗类型)，88%的妇女曾接受过预防性疫苗接种(补充表)。 S3 )。用ifn-γelispot分析的101名妇女中有22人对来自两种参考基因型：hpv 16和hpv 52的早期蛋白质序列(E1、E2、E6、E7)中的一个或多个hrhpv肽池的反应超过25 sfu/百万phpc。hpv 16和hpv 52是英国接种疫苗的妇女中最常见的一种。 33 (无花果) 6 )。这些反应表明过去或现在感染hrHPV感染，因为早期蛋白不是预防疫苗的组成部分，在采血时，14/22名妇女的hrHPV DNA呈阳性。在有E1/E2/E6/E7应答的22名妇女中，有9人(41%)也承认5 GHPV3肽。此外，三名妇女对5GHPV3作出了反应，但对HPV 16或HPV 52早期蛋白没有任何反应，这与暴露在基因遥远的hrHPV类型相一致。
图6 用IFN-γELISPOT法检测5 GHPV3特异性T细胞。收集16~24岁健康无症状妇女外周血单个核细胞(PBMC)，第1组(左)和25~55岁妇女进行宫颈细胞学异常检查，第2组(右)。25 SFU/百万PBMCs的虚线为负截止(按负井平均加3SD计算)。图中显示的研究参与者是那些对任何一组参考肽组都有可检测反应的人(>25 SFU/百万PBMC)。
在第2组中，基线hrhpv的流行率为89%(有数据的35名妇女中有31名；主要是非疫苗类型)，8%的妇女曾接受过预防接种(补充表)。 S3 )。活检证实宫颈病变25例(71%)，其中HPV改变14例，CIN 1/2 10例，CIN 3 1例。15名妇女(43%)对一个或多个E1、E2、E4、E5、E6和E7肽库的反应超过25 SFU/百万PBMC。这15名妇女中有6名(40%)对5 GHPV3有可检测的T细胞反应(图1)。 6 )。以反应性为参考的hrHPV肽库作为分母，两者对5GHPV3肽的反应比例差异无统计学意义。
