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高温高湿引起的肠道微生态失调

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发表时间：2019-12-10 18:53作者：武汉新启迪Xinqidi来源：www.qidibio.com

高温高湿引起的肠道微生态失调

摘要

高温和湿度(HTH)会因食物和饮用水污染而引起腹泻。然而，它们对肠道微生物群和胃肠道炎症的直接影响尚不清楚。本研究旨在研究HTH和益生菌对微生物群的影响。21只雄性小鼠随机分为正常对照组(NC)、HTH组和广谱益生菌组(PR).HTH组和PR组定期放置在30±0.5°C，湿度85~90%，连续8周。第50~56天给PR组小鼠注射广谱益生菌.观察临床症状，应用16S rRNA功能元组学对肠道微生物进行分析。同时检测肠道病理、防御素和促炎细胞因子的表达.HTH组和PR组小鼠的粪便逐渐变粘或疏松。HTH组在抑制环境感知的基础上，发展了一种与增强代谢和类似人类的病理生理有关的独特的微生物区系特征。病理检查显示轻度肠炎，细菌易位增加，肠道促炎细胞因子水平升高.因此，环境中的HTH直接导致肠道失调和微小肠炎，而益生菌则部分地使微生物区系正常化，并改善肠道炎症。本研究为环境相关疾病的发病机制提供了新的见解，并提供了一种潜在的治疗方法。

导言

气候对健康的影响日益受到重视。腹泻病是全世界儿童发病率和死亡率的主要原因，估计每年有17亿人感染，70万人死亡。1...以前的研究报告说，气候相关因素显著影响易感人群的季节性腹泻。平均环境温度每上升5摄氏度，每日住院治疗腹泻的人数就会增加两倍。2...据报道，较高的温度会增加细菌和寄生虫引起的腹泻，并有助于引起肠胃炎的细菌的存活，如大肠杆菌在受污染的食物中3...同样，相对湿度对腹泻相关的发病率也有很大影响，这可能是由于饮用水处理厂的效率下降和暴雨期间受污染的水分配系统所致。4,5...然而，高环境温度和湿度(HTH)是否直接影响粘膜免疫和肠道微生物，从而导致疾病，包括腹泻，尚不清楚。

华南岭南地区是研究气候对健康影响的理想地区。这个地区包括南岭山脉的南部地区，包括广东、广西和海南，是中国31个省中最热、最潮湿的地区，也是最理想的腹泻条件(高峰期)。6...正如中医所预测的，这里的居民在初夏经常会出现腹部不适和轻度腹泻。最有趣的是，他们中的大多数人拒绝摄入受污染的食物或水。尽管潜在的病理机制尚不清楚，但根据中医的说法，极端相对湿度可能接近100%，持续一个月直接导致不适。

本研究旨在研究HTH和益生菌对21只雄性小鼠的微生物群的影响，随机分为正常对照组(NC)、HTH组和广谱益生菌组(PR)。我们的研究结果可能为气候相关疾病的发病机制提供新的见解，肠道微生物群可以被认为是一个很有前途的治疗靶点。

结果

小鼠结肠的临床表现及组织学改变

在整个实验过程中，所有动物的体重逐渐增加，但各组间没有差异(图1)。1A)。对照组小鼠非常活跃，皮毛光滑，排泄固体粪便。相比之下，维持在气候室中的小鼠(HTH和PR组)逐渐表现出不愿意移动、减少喂食、蓬松和钝毛以及阴囊下垂。PR组经1周益生菌治疗后，这些体征均有明显改善。有趣的是，大多数被转移到气候室的老鼠会产生便便，其中大约一半会分泌出松散的粪便(图一)。1B)，它被定义为不粘在肛门上的糊状和半成型的凳子，称为铜。等人...已描述7...HTH组松便在前2周达到高峰，逐渐消退，6~8周后反弹。1B)。8周后NC组和PR组均未见大便松动。由于腹泻罕见，未见大出血，未进行血液潜血阳性试验，疾病活动指数未按铜的描述计算。等人.7...在我们的实验中没有发生死亡。

此外，我们还比较了NC组和HTH组结肠组织学改变。光镜下观察到HTP组结肠组织学改变包括破坏的隐窝(星号)、粘膜固有层炎性浸润(长箭头)、上皮层变薄和破坏(箭头)(图)。1C)。PR组结肠组织学改变部分减轻。然而，在右旋糖酐硫酸钠引起的结肠炎中，最典型的特征是隐窝的缩短，它是病变分级的关键参数，在我们的研究中没有观察到。因此，我们没有按描述的那样比较结肠炎的病变程度。7.

微生物区系剖面

从12个粪便样品中共获得1，491，686条高质量的读数，平均长度为252 bp。这些读数被合并成742，961个标签，平均每个样本有61，913个标签。为了评估群落间微生物群落结构的总体差异，我们根据α-多样性(ChaoI、Shannon和Simpson指数)测量了生态参数。如图所示。1AHTH组ChaoI指数和Shannon指数的平均值均增加，而益生菌治疗组(PR组)的潮I指数和Shannon指数均下降。辛普森指数的平均值一直显著下降(P < 0.05) in the HTH group, but was partially restored in the PR group. To display differences in OTU composition among different samples, PCA was used to construct a 2-D graph summarizing factors primarily responsible for this difference. Weighted UniFrac analysis revealed that the first coordinate (PC1) elucidated 34.31% of the inter-sample variance (P=0.01；图1。2A)，而未加权UniFrac分析阐明了HTH组和NC组之间15.05%的差异(P=0.01；图1。1B).

在对OTUS进行门级分组时，我们考虑了9个门(放线杆菌、细菌、蓝藻、脱铁菌、第一菌、蛋白质细菌、TM7、Tenerictuts和Verrucom分别)的相对丰度。在这三组中，细菌和头孢菌素是最丰富的细菌门(图1)。2C)。用Kruskal-Wallis试验比较了这三门的相对丰度，并确定脱铁菌是唯一有差异丰度的门。P < 0.05), increasing from 0.05% in the NC and HTH groups to 1% in the PR group. The ratio of Bacteroidetes/Firmicutes also tended to increase in the HTH group and decrease in the PR group, although the differences were not significant.

在家系水平上，经OTUS比较，HTH组中有3个科(Al杯科、弧菌科和莫氏菌科)增加，而两个科(Lachnospiraceae和Prevotellaceae)比NC组减少。在属层次上，共鉴定出11株细菌，其丰度差异显著(P < 0.01) among the three groups. The top five significantly different genera among the three groups were 双歧杆菌、白藻带、双歧杆菌、Mucispirillum和Sutterella(无花果)2E，f)。虽然这三组患者在分类学上没有显著差异，但FDR校正值为P-数值(fdr=0.116，所有5个属)，这些结果暗示候选面板解释异常的HTH组。尽管丝螺菌本研究未发现益生菌制剂，经益生菌处理后可明显诱导，提示益生菌可能通过一种与肠道定植无关的机制发挥其有益作用。

利用KEGG正交图数据库进行功能预测

在PICRUSt的基础上，通过KEGG途径预测肠道微生物群功能能力的变化。与NC组相比，HTH组代谢途径和人类疾病途径丰富，环境信息处理通路被抑制；益生菌治疗后，这一趋势部分逆转。3A)。在KEGG水平2时，共有10条预测路径受到显著差异调控。这些途径主要与促进代谢和生物合成有关(图1、2、4、5、7、8和10)。3B)，减少转录，异生物的生物降解和代谢，脂质代谢(路径3，6和9在图中。3B).

肠内轻度肠炎的LPS易位及病理表现

由于粘粪排泄是HTH治疗小鼠最显著的症状之一，提示脂质代谢异常，KO分析也预测了脂肪代谢受损，我们对HTH后小肠发生的事件进行了评估。免疫组化法检测细菌易位情况。与NC组相比，HTH组(长箭头组)在56天时，绒毛上皮上的LPS粘附量显著增加或进入别墅和腔内，而LPS染色在益生菌治疗后趋于减少(PR组；图1)。4A-C).

我们进一步研究了Paneth和杯状细胞对环境HTH的变化。如前所述，Paneth细胞对病理条件的反应可能有所不同。8...在炎症状态下，由于非特异性损伤或再生修复区域细胞数量减少，而细胞质溶菌酶染色可能是正常的、无序的、耗竭的和弥漫性的。8,9...在我们的研究中，与NC组相比，每个隐窝中氧氟沙星-蒲公英阳性的Paneth细胞数有下降的趋势(图一)。4G, PHTH组小鼠出现弥漫性或排斥性颗粒表型(箭头头)>0.05。益生菌治疗后扩散颗粒明显减少(PR组)。4D-f)。杯状细胞的数量和大小也明显减少。4H-jHTH组每绒毛Goblet细胞数明显低于NC组，而PR组(P < 0.05) (Fig. 4K).

基于H&E染色和病理检查。4L-n)，轻微的“绒毛钝化”(定义为长绒毛与地窖的长度之比为2：1：3：1)。10)可以在HTH和PR组中观察到(P < 0.01, Fig. 4O)。绒毛长度从绒毛尖端到绒毛-隐窝连接处测量，而隐窝深度定义为两个绒毛之间的内陷深度。“绒毛变钝”是评价肠道炎症病变的常用标准。10...没有证实这些结果，我们重复实验，将动物分为NC组和HTH组，并给予同样的处理。与NC组相比，HTH组绒毛与隐窝长度之比也显著降低(P < 0.01), as shown in Supplementary Fig. 1...此外，根据H&E染色和病理检查，HTH组可观察到微小的肠道炎症征象，包括上皮丢失和炎症细胞浸润固有层(附图)。2)

防御素、促炎细胞因子和全身炎症的肠道表达

考虑到Paneth细胞的异常组织学表现，我们确定这些细胞的功能受损是否导致防御素分泌受损，从而导致LPS易位。肠道mRNA水平CRS4CHTH组显著高于NC组(P < 0.05), suggesting inflammation-associated activation instead of impaired Paneth cell function (Fig. 5A)。同理，HTH组肠道防御素和隐隐素1的表达有增加的趋势，益生菌治疗后三种防御素的表达均有下降的趋势，但差异无显着性(P>0.05)。

细菌移位增加引起的局部炎症可能导致防御素在Paneth细胞中的表达上调。LPS作为TLR 2和TLR 4的激动剂，是NF-κB信号转导的有力刺激因子，可诱导MCP 1、IL-6和TNF-α等促炎细胞因子的表达。应用肠组织匀浆，HTH组与NC组相比，这三种细胞因子水平均有升高的趋势，经益生菌治疗后恢复正常，但差异无统计学意义(图二)。5B).

讨论

与气候有关的因素显著影响季节性腹泻，人们通常认为季节性腹泻是食品和水污染增加造成的。然而，温度和湿度对人体的直接影响及其与腹泻的相关性以前还不清楚。在本研究中，我们采用气候室模拟小鼠每天12小时的高温/湿度环境，并观察了粘性和松散的粪便的逐渐发展，尽管我们采取了谨慎的措施来防止食物和水中的细菌污染。此外，我们还观察到肠道失调、细菌易位增加、轻微肠炎和全身炎症细胞因子TNF-α水平升高的明显模式。我们的结果可能解释了一些病人不适，特别是轻微发烧和腹泻，通常发生在夏季的病机。据我们所知，这是第一次描述肠道失调与气候有关的因素。与这一假设一致，我们的结果阐明了益生菌对失调和肠道炎症的有益作用，这为通过改变肠道微生物来治疗与气候有关的不适提供了一种新的策略。

此外，我们还试图对HTH所致的生物失调进行表征。出乎意料的是，我们发现了肠道微生物多样性增加的明显模式，这表现为潮间带和香农指数的增加，以及HTH组的Simpson指数下降。多样性的增加与对某些人类疾病的保护作用有关。11,12...一直以来，KEGG分析表明，我们的HTH组的新陈代谢增加。微花多样性增加与临床症状之间的矛盾结果可以用高温和湿度的重叠效应来解释。在另一个初步实验中，高湿度导致微生物多样性的显著丧失，而适当的高温则使其发生逆转(数据未显示)。尽管人们还在争论小鼠模拟人类热环境的最佳居住温度，但标准条件下(21°C)的实验小鼠却处于持续的冷应激状态。13...如前所述，30摄氏度14，有人提出小鼠的热管区，而其他研究表明30°C太热了。15...因此，我们选择30°C作为实验环境，因为它是一个相对“高温”，特别是考虑到小鼠在高湿度下的耐受性。最后，我们的研究结果表明，适当地将环境温度提高到30℃左右对肠道微花多样性有潜在的好处。

从分类学上看，杯藻科、双歧杆菌科、弧菌科和莫氏菌科等科均富集，而藻科和前菌科的种类减少。在属一级，我们鉴定出11个细菌属，它们的丰度差异很大，其中最富的5个属是。离解带, 双歧杆菌, 蓝衣藻, 丝螺菌，和苏特氏菌...出乎意料的是，这些属中的大多数被认为能抵抗胰岛素抵抗。16糖尿病和结肠炎17...许多研究表明，产生丁酸的细菌是维持肠道完整性所必需的。18,19并揭示了其丰度之间的显著负相关。蓝衣藻和双歧杆菌血糖和胰岛素水平20...一些研究报告了离解带和苏特氏菌在胃肠道上。离解带21据报道，他在海湾战争疾病(GWI)中富集了一种模型，该模型显示神经异常、神经炎症、慢性疲劳和胃肠紊乱，据报道这些疾病与海湾战争中的化学接触有关。在这个模型中，一个改变的微生物组显着地减少紧密连接蛋白封堵器，伴随着claudin-2的增加，这是一个漏肠的特征。肠黏膜上皮相关的高水平苏特氏菌物种也被认为与孤独症有关，孤独症通常伴随着GI障碍。22,23.

多年来，气候相关因素对葡萄糖代谢的影响已经被观察到。实验发现，长期暴露在高温和潮湿环境下的小鼠会出现低血糖。24,25通过未知的机制。本研究利用KO分析预测了富肠微生物区系，并与多种代谢相关途径相关，从而可能解释了高温和湿度所致低血糖的原因。最重要的是，Metagenome图谱预测了膜转运和转录途径的减少，这可能有助于HTH组肠炎的发展。因此，我们的研究为气候相关疾病的发病机制提供了新的见解，并提示肠道微生物群是这些疾病的潜在治疗靶点。

材料和方法

伦理认可

动物

C57BL/6小鼠(6周龄)取自广州中医药大学实验动物研究中心(GZUCM，广州)。在本研究中，雄性小鼠被用于尽量减少发情周期的潜在混淆效应。所有试验品种都是在特定的无菌条件下繁殖和维持的。

将动物安置在24±2°C的无菌笼内，平均湿度为60±1%，光照为12/12 h，暗周期，并提供酸化水和啮齿类动物饲料。驯化1周后，21只小鼠随机分为3组，每组7只。正常对照组(NC)的小鼠维持上述状态，而HTH组和益生菌治疗组(PR组)的小鼠定期被转移到位于同一房间的灭菌气候室(模型：宁波江南仪器厂RXZ-158A)。气候室设置为：温度30±0.15℃，湿度85-90%，每天12h，连续8周。考虑到细菌的迅速增长，特别是在高温/湿度条件下，每天对食品和饮用水进行消毒和更新，以避免污染。

益生菌

生命空间宽谱益生菌，购买自进化健康Pty有限公司(国际中心，澳大利亚)，在本研究中。这是一种含有15株有益细菌的多菌株益生菌，其成分可从制造商的网站(https://www.lifespaceprobiotics.com/产品/广谱-益生菌/)第50~56天，PR组大鼠每日胃内注射50 mg/kg的益生菌液，生理盐水0.1mL，对照组给予等量生理盐水。

粪便收集

每只小鼠在第8周采集粪便样本，提取总DNA。在第8周通过腹部按压获得，并收集到一个消毒管。样品被立即冷冻并保存在−80°C，直到细菌DNA的分离和提取处理为止，这是按照以前报道的方法进行的。26...简单地说，用打浆法收集DNA，用三乙酸三乙酸(TE)缓冲液溶解，再用苯酚和氯仿萃取。

扩增文库的构建及16S rRNA序列分析

每组随机抽取4份粪便标本进行16 SrRNA测序。细菌16 SrRNA聚合酶链式反应(PCR)产物的基因扩增、克隆和序列测定在北京基因研究所-深圳华大基因研究所实验室进行。细菌16S rRNA基因V5-V4区的PCR扩增27,28采用通用引物(515 F5‘-GTCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和806 R：GGACCHVGGGTWTCTAAT 907 R5‘-CCGTCAATTCMTTTRAGT-3’)进行分析。在50-μL反应混合物中，每个基因组DNA 20 ng，TaqDNA聚合酶1.25U，10×ExTaq缓冲液5μL，TAKARA生物技术有限公司所有试剂10 mM dNTPs，引物混合40 pmol。PCR条件为：95°C初始变性5 min，95°C变性28次，55°C退火30 s，72°C延伸45 s，72°C延伸7 min。用磁珠纯化PCR产物(Axygen生物科学，UnitedCity，CA，USA)。利用2100生物分析仪系统(Agilent Technologies Inc.，WaldBronn，德国)估算了放大器库的浓度，并将每个样本的等量放大器汇集在一起。测序数据可从欧洲生物信息学研究所获得，登录代码为PRJEB27835。

测序数据分析

原始数据使用基于Mothurv 1.31.2开发的内部管道进行处理。29...去除引物，截断低质量序列(30 bp窗口的平均质量评分<20)，将每个样本的高质量读数(长度>250 bp)汇集在一起。此后，使用USEARCH(v7.0.1090)对操作分类单元(Otus)进行97%的身份分割。30...然后计算了OTUS的相对丰度。去除了相对丰度小于0.001%的OTUS，并对样品中OTUS的分布进行了分析。在OTU丰度和系统发生树的基础上进行加权和非加权UniFrac距离分析。主成分分析(PCA)是根据使用定制R(3.0.2)脚本获得的OTU丰度剖面进行的。根据OTU丰度和OTUS的分类学注释，我们在门、类、目、科、属、种的水平上得到了相对丰度谱。31...根据相对OTU丰度表进行α多样性、β多样性和稀疏曲线分析。采用Kruskal-Wallis试验，探讨了不同亚类细菌种类和功能的富集情况。错误发现率(FDR)被认为可以控制I型错误，并为多组比较找出更可靠的人选。此外，我们还使用PICRUSt对京都基因和基因组百科全书(KEGG)、同源组(COGS)进行了功能分类。32.

病理分析与形态计量学定量

实验结束时，分别对小鼠的小肠、盲肠和结肠进行安乐死，用10%福尔马林溶液浸泡48h，进行苏木精和伊红染色，潘氏细胞用苯氧嗪-茶碱染色，杯状细胞周期酸-希夫(PAS)/苏木精染色。在干透镜(20×或40×)和油浸透镜(100×)下的光学显微镜图像，用Leica DMR显微镜系统(Leica Microsystems，德国韦茨拉尔)进行分析。组织学评估由病理学家进行，对样本的一致性视而不见，并列举了每个绒毛的杯状细胞。

脂多糖(LPS)免疫染色：去蜡，用10 mm柠檬酸钠缓冲液煮取抗原，在封闭缓冲液(10 mm Tris-HCl pH7.4，0.1M MgCl 2，0.5%吐温-20，1%BSA，5%血清)中孵育1h，与抗LPS单克隆抗体(CloudClone Corp.，武汉)共同孵育。用基于聚合物的可视化系统观察染色情况(基因技术公司，上海)。

RNA提取、逆转录和实时PCR

结肠和肠切片在液氮中冷冻。组织保存在−80°C，并按标准的Trizol试剂提取的标准程序在液氮中匀浆(中国上海，上海，热费舍尔)。利用PrimeScript RT MasterMix(Takara生物医学技术有限公司，中国)逆转录技术，利用ABI 7500实时PCR系统(应用生物系统公司，CA，USA)对cDNA进行实时PCR分析。引物序列已在其他地方公布33[13]并列出如下：5‘-GGT GAT CAT CAG CCA GCA TCA-3’(前进)和5‘-AAG AGA CTA AAA CTG AGG AGC AGC-3’(反向)用于全球防御素；5‘-TCA AGA TGC AAA GGA GGA AGA GAA-3’(前向)和5‘-TGG TCT CCA TGT TCA GCG ACA GC-3’(反向)密码素-15‘-GCA TGG AAT CTG GGT CAA GAT AAC-3’(前)和5‘-AGA agg AAG AGC AAT CAA GGC TAA G-3’(反向)用于密码素相关序列(CRS4C); GAPDH作为参考。PCR一式三份，用SYBR Green(Takara生物医学技术有限公司，中国)进行。cDNA扩增40个周期使用预先设定的循环程序，其中包括生成一条融化曲线。热循环条件为：(1)50°C活化2 min，(2)95°C活化10 min，(3)95℃变性15 s，60℃1 min(退火/延伸)40次循环。用ΔΔCT方法定量测定用户公报2(应用生物系统)中的相对mRNA水平。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

定量测定促炎细胞因子的水平。原地立即将结肠切片冷冻在液氮中，保存在−80°C中，直至在含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的tris-HCl缓冲液中均匀化(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)。小鼠肿瘤坏死因子-α，干扰素-γ，IL-6和LPS ELISA试剂盒从安迪基因生物技术有限公司(北京，中国)购买，并用于测定上清液中细胞因子的水平，按照制造商的指示。采用Varioskan LUX微板阅读器(美国Thermo Fisher)进行测定，数据分析采用四参数Logistic回归分析。每个样本进行两次重复，结果平均。