从多能干细胞中产生胰岛素产生细胞(IPC)可能是治疗1型糖尿病的突破性方法。然而，需要开发新的技术来排除未成熟细胞以供临床应用。用双硫腙染色法检测锌，评价IPC。我们假设锌离子(锌)2+)动态反映IPC成熟状态。我们采用二维或三维培养方法，将人脂肪源性干细胞分化为IPC。培养第21天2D和3D细胞的刺激指数分别为1.21和3.64。P < 0.05), respectively. The 3D-cultured IPCs were stained with dithizone during culture, and its intensity calculated by ImageJ reached the peak on day 17 (P < 0.05). Blood glucose levels of streptozotocin-induced diabetic nude mice were normalised (4/4,100%) after transplantation of 96 3D-cultured IPCs. Zn2+三维培养物的浓度变化在早期为负值，后期为较大的正值。这项研究表明锌2+以锌转运体的观察和染色为基础的动力学研究在IPCs的分化中起着至关重要的作用，它们的测定可能有助于评估IPC作为一种无损方法的成熟程度。

从多能干细胞(PSCs)中产生胰岛素产生细胞(IPC)有可能解决一些国家胰岛移植供体短缺的问题。1...许多研究已经研究了pSCs对ipc的诱导作用，如胚胎干细胞、诱导的多能干细胞和其他器官来源的细胞。2,3,4,5,6,7,8,9,10,11...特别是，与某些类型的pscs相比，脂肪源性干细胞(Adscs)可以获得更少的侵袭性和无伦理问题。12...ADSCs的一个优点是从同样数量的骨髓抽吸中可以获得多达300倍的干细胞。13...此外，它们在临床上可能很容易应用，因为这种细胞移植被认为是不需要免疫抑制的自动移植。因此，我们把ADSCs作为ipc的一个新的细胞来源。12,14,15...我们以前报道过一种新的两步分化协议。16并将其修改为一种更有效的无异种和三维培养协议。17从ADSCs中生成功能性IPC。对于临床应用来说，排除不成熟的IPCs是很重要的。此外，IPC已被诱导成熟。体内移植后几个月3,18...因此，IPC移植的最佳时机尚不清楚。

锌离子的作用2+在胰腺β中，细胞对细胞的基本结构和酶具有重要作用。哺乳动物胰腺β-细胞内锌含量较高2+比其他器官19...在β-细胞中，胰岛素与锌结合2+并被转化为分泌颗粒中的hexamer。20...那么，Zn2+被胰岛素释放并再次被β-细胞吸收。因此，成熟的β-细胞既能吸收锌，又能吸收锌。2+分泌物21,22...双硫腙染色法检测高密度锌对胰岛的影响2+，可用于评价ipc。8,16,20...然而，在此过程中，双硫腙的毒性会对细胞造成破坏，由于双硫腙的致癌性，因此在临床上使用双硫腙是危险的。8,20.

锌2+是一种重要的金属离子，与多种代谢功能有关。例如，dna和rna聚合酶是细胞增殖、基因表达和基质金属蛋白酶在细胞迁移和侵袭过程中所必需的。2+依赖酶23,24,25.

据推测，锌2+细胞在分化成熟过程中可能被吸收，成熟时分泌胰岛素。因此，锌2+分化细胞动力学被认为是新生IPC成熟的新标志。

在这里，我们确定了锌2+培养基中的浓度是IPC分化成熟的一种简便、有用的标志，并证明了Zn的作用机制。2+IPC的动态。

三维培养中的ipc比传统的2D培养更容易形成细胞簇。

在两步分化过程中，由于培养时间的延长，传统的二维培养与三维培养存在一定的形态学差异。详细地说，在三维培养中，ADSCs和RCP片段在培养24小时内收集并进行球状形成(图1)。1A)。随后，在三维培养中产生的iPC在21天前呈球状形成，而常规2D培养在第21天左右形成了细胞团簇(图1)。1B)。免疫荧光染色检测人胰岛素在3d培养的IPC细胞质中的第21天。1C)。与培养方法相关的差异表明，在培养的第21天，3D培养的IPCs的刺激指数(SI)显著高于常规的2D培养(3.64±0.86)和1.21±0.11(P<0.05)。P < 0.05, Welch’s test, Fig. 1D)。测量的胰岛素浓度，包括在每个培养系统的非刺激(基础)条件下的浓度，如表所示。1.

(A添加RCPγ片段后24h内，ADSCs形成细胞团簇。原始放大倍数x40。(B与3D培养(下行、原放大率x40)相比，常规2D培养(上行、原放大率x 100)中细胞团样形成所需时间更长。(C)在培养的第21天，培养的iPCs的刺激指数显著高于2D培养的iPCs(*)。P=0.004，韦尔奇试验)。(D)免疫荧光染色显示成熟的IPCs强烈表达胰岛素。第21天，3D培养的IPC。(E)链脲佐菌素诱导的糖尿病裸鼠移植后血糖水平变化为正常血糖水平(蓝系，n=4)，而假手术组(OCHRE系，n=4)血糖水平未达到正常范围。灰色线显示裸鼠血糖水平(n=4)。(F)电镜显示致密的囊性微结构(左、上列)。鳞片条，5μm)和分泌颗粒样结构(左，下排。第21天，培养的ipc细胞质中有鳞状条状细胞(0.2μm)，类似于人幼稚β-细胞中的分泌颗粒。25(右)白色箭头：成熟颗粒；黑色箭头：clathrin包裹的分泌囊泡；箭头：将分泌物质浓缩在覆有clathrin的高尔基池中。(G)SOX 17、NGN 3和MAFA在第0、7、17天表达的RT-PCR分析(*)P < 0.01, **P < 0.001, Bonferroni’s test). (H)免疫组化结果显示，培养的IPC在第21天表现出较强的胰岛素表达(箭头)。r，rcpγ片。刻度棒，25μm。

全尺寸图像

三维培养iPCs降低糖尿病小鼠移植后血糖水平的实验研究

作为体内功能测定：将96只培养的IPC移植到STZ诱导的DM裸鼠肠系膜(n=4)后，血糖水平逐渐下降至200 mg/dl以下。移植后第6天，4只小鼠血糖降至200 mg/dl以下，至移植后30d仍低于此水平(4/4，100%)，而假手术组(n=4)不能将高血糖状态转为正常血糖水平(图1)。1E).

培养的ipc含有分泌颗粒和分泌胰岛素。

电镜显示胰岛素分泌颗粒样结构和致密结构在第21天培养的胰岛素分泌颗粒样结构，以人幼稚β-细胞为对照(见图)。1F).

分化标记基因在三维培养IPC中的mRNA表达

SOX 17作为内胚层发育标志，NGN 3作为内分泌细胞分化标志，MAFA作为成熟胰腺β-细胞的指标，在第17天的表达显著高于0天(SOX 17，P < 0.01; NGN3 and MAFA, P < 0.001, Bonferroni’s test, Fig. 1g)和第7天(SOX 17，P < 0.01; NGN3 and MAFA, P < 0.001, Bonferroni’s test, Fig. 1g).

免疫组化显示胰岛素的强表达

用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达。胰岛素在第21天培养时胞浆呈强染色(尤其是颗粒样结构)。氢).

二硫腙染色ipc随着时间的推移

在三维文化中，球状构造的整体外观逐渐被二硫腙染色(图1)。2A，每点观察到8个IPC)。四个独立实验的代表性图像如图所示。2A...应用ImageJ对培养细胞图像的定量研究26染色强度逐渐增加至180，并在第17天达到高峰。P < 0.01, Bonferroni’s test) Based on three random points of eight IPCs, the average value is shown in Fig. 2B...第17天后，双硫腙染色强度无显着性差异(P>0.05)。作为参考，我们评估了离体人胰岛图像的强度。2A，右下角)，为244。

(A含ADSCs的球状细胞在培养过程中每2天逐渐被二硫腙染色。有代表性的胞状构造(n=8个时间点)。新鲜分离的人胰岛作为阳性对照(右下角)。(B)图像J分析Dithizone染色细胞，染色强度逐渐增加，第17天达到高峰，平均3个独立实验。*P < 0.01, Bonferroni’s test. Error bars represent the standard deviation. (C)锌形态2+三维培养条件下培养上清液浓度的变化。ΔZn2+=锌2+(上清液)−Zn2+(新鲜培养基)。三个独立的实验显示为蓝线。平均SI在第6天，第13天和第21天显示。误差条表示标准差。灰度虚线显示细胞培养因培养条件而不能正常分化和成熟。第21天平均SI。误差条表示标准差。

全尺寸图像

锌2+在适当的IPC分化过程中，培养基中的浓度由阴性变为阳性。

锌2+培养上清液中浓度的变化[ΔZn]2+*计算为Zn2+(上清液)-锌2+(新鲜培养基)对培养的IPCs进行测量和作图。在第3天和第6天的早期，ΔZn2+有负值。然而，ΔZn2+因为从第6天到第9天是阳性的，在第13-17天达到高峰(如图所示)。2C3个独立试验，每个试验的SIS分别为2.64、4.05和4.22，平均SI在第21天为3.64，第6天为0.86，第13天为1.02)。但是，如果由于缺乏补充剂而不能分化成熟细胞，Δ锌的含量就会增加。2+很低(灰色虚线，图1)。2C，平均SI在第21天为0.92)。

锌转运蛋白在IPC分化早期的表达

ZIP 4在整个治疗方案中均有表达，但在第7天达到高峰，然后逐渐下降(P<0.05)，与第21天相比，Fisher‘s最小差异无显着性。3A，B)。而ZnT 8在第7天时表达较强，随后显著下降(P<0.01)。P<0.05，与第17天比较，Fisher‘s差异最小，无显着性差异。3C，D).

(A)免疫组织化学检测ZIP 4在第0、7、17和21天。给出了三个独立实验的代表性结果。(B)图像染色强度用ImageJ测量。(C)ZnT 8在第0、7、17、21天免疫组化染色。给出了三个独立实验的代表性结果。(D)图像染色强度用ImageJ测量。分析了三个随机场。r：rcp花瓣状μ-片段，*P < 0.05, **P < 0.01, Fisher’s least significant difference. Error bars represent the standard deviation.

全尺寸图像

锌的正变化规律2+浓度可能是特定的，但从ADSCs分化而来的细胞可能具有负的变化模式。

ΔZn2+如上文所述，培养的IPC在第13-17天达到高峰。然而，ΔZn2+传统的二维培养与三维培养有明显的不同，特别是在正曲线区域(图1)。4A)。在三维培养中，ΔZn含量增加2+第7~21天与双硫腙染色的定量强度相关(r=0.798，Spearman的秩相关系数)。估计负曲线面积的意义2+在分化培养基中测定肝细胞样细胞(HLCs)上清液中浓度的变化。有趣的是，锌2+HLC分化早期培养上清液浓度变化也为负值，正曲线模式与3D和2D培养的IPC不同(图1)。4B).

(a)锌形态的比较2+在三维培养和2D培养条件下，IPCs培养上清液浓度的变化(n=8)，(B)或肝细胞样细胞(HLC，每点8例)分化。进行了三个独立的实验。误差条表示标准差。

全尺寸图像

胰岛移植是一种β细胞替代疗法，有可能使1型糖尿病(T1DM)患者不用注射胰岛素。然而，由于一些问题，胰岛移植还没有得到广泛的应用。其中之一是日本等一些国家的捐助者严重短缺。1,27...此外，重复移植往往需要达到无胰岛素状态，这加速了供者的短缺.为了解决这一问题，需要建立更加稳定和安全的细胞来源。因此，来源于间充质干细胞的胰岛素产生细胞有望成为替代的、非身体治疗的细胞来源。

对于IPCs的临床应用，移植前应采用无损程序对细胞功能进行评估.以往采用双硫腙染色、RT-PCR、免疫荧光染色和Western blotting等方法，必须大量处死IPC。众所周知，锌2+在胰岛素释放代谢中起关键作用，葡萄糖刺激诱导锌。2+胰岛细胞释放28...因此，我们重点研究了锌2+浓度是因为培养上清液的评价是一种非侵入性的细胞培养方法。在本研究中，我们发现双硫腙的染色强度在第17天达到峰值，分化标记物表达增加。有趣的是，产生的IPC的染色强度接近人胰岛的染色强度。然而，正如SI所指出的，所生成的IPC尚未完全实现人类胰岛的相同功能。值得注意的是，ΔZn2+第17天后未达到统计学意义。因此，IPC的成熟时间可能比第21天更早。此外，由于培养基条件的限制，如果不能很好地分化和成熟ipc，则ΔZn。2+没有足够高的正值，无法达到足够的SI值。这些发现表明，ΔZn2+锌离子动力学作为锌离子在培养基中的一种指标，反映了IPC功能的成熟状态。因此，IPC移植在第17天可能会产生有趣的结果。

然而，SI的每周增加似乎与步骤2中锌离子浓度的增加不同。这一观察表明胰岛素分泌颗粒的产生与胰岛素释放能力(检测葡萄糖浓度变化的能力)之间存在差异，这种感觉能力可能在IPC分化后期获得。

最近，锌2+由于锌在细胞中的作用，转运蛋白已成为人们关注的焦点。2+是许多细胞蛋白质和酶中的一个功能成分，在细胞的生长发育中起着关键的作用。29,30,31...锌2+转运体包括锌转运蛋白(ZNT)/溶质载体30A(SLC30A)家族和Zrt，irt样蛋白(ZIP)/SLC39A家族。许多报道表明ZNT家族携带锌2+从细胞质到细胞器或胞外区域，而ZIP家族携带锌。2+逆向21,30,31,32...其中，ZnT 8主要在胰岛素分泌颗粒中表达。33,34,35...有些T1DM患者是由一种抗ZnT 8的自身免疫性疾病引起的。36,37,38,39,40,41...在最近的一项研究中，ZnT 8的表达与胰岛素分泌有关。42...此外，也有报道说ZIP 4的表达与锌的摄入有关。2+胰岛β细胞43以及它们的分化和成熟44,45...在以前的报道中，干细胞已经吸收了锌。2+在分化过程中的细胞核46,47...在ADSCs衍生的hlcs中，我们发现ΔZn2+分化早期值为负值。这表明ADSCs需要大量的锌。2+在分化的早期阶段，至少可以分化为内胚层细胞，这种细胞可能被用来产生细胞器和合成rna。47,48...此外，锌2+胚胎干细胞在内胚层过渡过程中出现吸收现象。46,48...因此，在前人研究成果的基础上，我们对锌的作用机理进行了预测。2+IPC分化过程中的变化(图1.5)。在诱导内胚层和细胞命运决定后，ADSCs开始产生胰岛素分泌颗粒。为了达到这些目的，需要大量的RNA合成。因此，zp 4对细胞的发育起着至关重要的作用。44,45，我们将其命名为“RNA合成和细胞器生成阶段”。5左)。然后，随着分泌颗粒的增加，这些颗粒中含有两种锌的胰岛素。2+和ZnT834,35双硫腙染色强度增加。成熟后，许多含有胰岛素和锌的分泌颗粒2+从IPC中逐渐释放，导致Zn的增加2+我们称之为“分泌期”。

ADSC在诱导内胚层细胞产生胰岛素分泌颗粒并决定其命运后，开始产生胰岛素分泌颗粒。为了达到这些目的，需要大量的RNA合成。因此，人们认为ZIP 4在细胞发育过程中表达并发挥了重要作用(RNA合成和细胞器生成阶段)。然后，随着含胰岛素的分泌颗粒的增加，含有两种锌的胰岛素检查员也随之增加。2+ZnT 8的表达增强了双硫腙的染色强度。成熟后，许多含有胰岛素和锌的分泌颗粒2+逐渐从IPC中释放出来。这种释放导致锌的增加2+集中(“分泌阶段”，右)。

全尺寸图像

关于本研究的局限性，还存在一些有待进一步研究的问题。首先，对于IPC的分化和成熟，本质上没有固定的评价方法。因此，目前尚不清楚这些IPC是否有足够的分化和成熟。其次，在我们的研究中，标记基因的表达仅用RT-PCR来评估.因此，标记基因的表达应通过免疫印迹和免疫染色来确定。同样，仅用免疫组织化学方法检测锌转运蛋白的表达。通过进一步的实验，本研究的结果可以证实我们的假设。5)。第三，在干细胞分化过程中，需要进一步分析以了解锌离子动力学。根据hlcs作为另一种细胞类型的结果，adSCs至少需要大量的锌。2+转化成其他胚层的细胞，如内胚层，产生细胞器。锌是细胞分化所必需的。44,45...因此，锌离子动力学可以反映细胞的命运决定。因此，评价锌2+其他生殖层细胞分化的动力学可能支持我们的假设(如图所示)。5)。第四，IPC的精确显微结构尚不清楚。我们通过电子显微镜观察到在3D产生的IPC中有一些未定义的“空颗粒”；然而，还需要进一步的研究来确定这些结构是特殊的IPC结构，还是由于细胞的制备、储存或细胞损伤而产生的。

总之，锌2+培养上清液浓度变化可能是IPC成熟的标志。这一新见解可能有助于确认可移植的IPC的功能，不包括用于移植的IPC不足，或监测生产。

ADSC制备

本研究采用STEMPRO™人脂肪源性干细胞(Invitrogen，Grand Island，NY)。ADSCs在由MesenPROTM RS(吉布科，Carlsbad，CA)和GlutaMAXTM-I(吉布科)组成的ADSC基础培养基中培养。

IPC区分协议

如以前报告的那样生成了ipc16,17...简单地说，经过充分的传代后，ADSCs与重组肽微片段(rcpμ片段；Fujifilm，日本东京)混合，转移到Nunchlon Sphera 96U底板(Thermo Science，Waltham，MA)进行三维培养。常规2D培养中，不含rcpμ-片段的ADSCs接种于低蒸发盖子的Falcon™6井底组织培养板中(Corning Co.，Corning，NY)。关于IPC归纳的协议以前已经报道过。18...然而，分化鸡尾酒的含量变化为重组人激活素-A、肝细胞生长因子和白蛋白。ADSCs用Dulbecco改良Eagle‘s培养基/F12(吉布科)和1%重组人白蛋白(日本大阪，Wako)、10 NM exendin-4(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)、1%N2补充剂(吉布co)、1%B27补充剂(吉布co)和50 ng/mL重组人活化素A(Peprotech，Rocky Hill，NJ)组成的步骤-1(第0天至第7天)培养。步骤2(第8~21天)与步骤1培养基相同，加50 ng/mL重组人肝细胞生长因子(PeproTech)、丙戊酸(WAKO)和10 mm烟酰胺(Sigma-Aldrich)。改变培养基，每2天收集一次上清液。

肝细胞样细胞分化方案

肝细胞样细胞(Hlcs)已如先前报道的那样分化。49...简单地说，ADSCs在2D培养条件下使用20d的分化方案进行培养.分化方案采用2μM Chir 99021(MedChemExpress，MonmouthJ连接处，NJ，美国)，1%ITS(Sigma-Aldrich)，20 ng/mL BMP 2(PeproTech)，30 ng/mL FGF4(PeproTech)，20 ng/mL HGF(PeproTech)，10 ng/mL onseatin M(PeproTech)，10μM地塞米松(Sigma-Aldrich)。每个时间点对8个高放细胞进行调查。进行了三个独立的细胞分析实验。

葡萄糖刺激胰岛素分泌试验

根据以前的报道，进行了葡萄糖刺激的胰岛素分泌试验。50,51,52...在Krebs-Ringer‘s液中，用2.2或22 mm葡萄糖刺激分化细胞1小时，用5%CO在37°C下刺激分化细胞。2孵化器。Krebs-Ringer‘s溶液由129 mm NaCl，1.2 mm MgSO组成4，1.2毫米KH2阿宝4、4.7毫米氯化钾、5毫米NaHCO3，2.5毫米CaCl2、10 mm HEPES和1%牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)。刺激后，采集各样本的上清液，用人/犬/猪胰岛素定量ELISA试剂盒(R&D系统，明尼阿波利斯，MN)测定人胰岛素浓度。用分子器件谱I_3(分子器件，Sun Jose，CA)和SoftMax Pro 7(分子器件)测量了光学吸光度。刺激指数(SI)计算为22 mm葡萄糖刺激后胰岛素测量的比值除以2.2mm葡萄糖刺激后胰岛素测量值。采用3个独立的实验对GSIS进行评价(n=3)。

电子显微镜

如以前所报告的那样准备了细胞17...第21天，将培养的IPC置于0.1M磷酸盐缓冲液中，加入2%多聚甲醛和2%戊二醛，隔夜放置4°C。在梯度乙醇溶液中脱水后，用环氧丙烷和树脂(日产EM，日本东京)浸润IPC样品1小时。将IPC样品转移到100%的新鲜树脂上，在60°C下聚合48小时，然后在70 nm的厚度下用超微切片进行切片(奥地利维也纳莱卡)。切片在室温下用2%醋酸铀酰染色15 min。样品经蒸馏水洗涤后，在室温下用铅染色液(Sigma-Aldrich)二次染色3分钟。电子显微镜在托凯电子显微镜公司进行。(日本名古屋)。在日本东京JEOL有限公司(JEOL有限公司)100 kV的加速电压下，在JEM-1400 Plus透射电子显微镜下观察到截面。图像由EM-14830RUBY2CCD相机(JEOL有限公司)拍摄。作为对照，我们已经包括了一个人的β细胞图像获得的电子显微镜(图)。1F，对，这张照片是在这项研究中重复使用的，这是与埃尔塞维尔达成的协议。25).

双硫腙染色

培养细胞(n=8，每天)用双硫腙溶液染色。双硫腙溶液由双硫腙50 mg/5mL二甲基亚砜(瓦科)组成。IPC在37℃和5%CO的双硫腙溶液中孵育。2用PBS洗涤三次后。用BZ-X710型多功能显微镜(日本东京Keyence工程公司)和BZ-X分析仪(日本Keyence软件公司)对染色样品进行鉴定。

锌2+浓度测定

培养上清液在培养基变化过程中收集。锌2+每个IPC样品中的浓度用金属分析试剂盒锌LS(日本千叶金属有限公司)根据制造商的协议进行评估。将2 3 0μl缓冲液、12μl样品和5μ1螯合色溶液混合后，转移到96孔平底板(Corning Co.)。样品板在560 nm吸收波长处进行分析。锌2+根据标准样品(200 mg/dl)和空白样品(去离子水)的吸光度测定浓度。用分子器件谱图I3和分子器件SoftMaxPro 7测量吸光度。每一种Zn2+浓度的变化计算为：ΔZn2+=锌2+(上清液)−Zn2+(新鲜培养基)。每个时间点调查8个IPC。对该方法进行了3个独立的实验(n=3)。

免疫组织化学染色

IPC标本用福尔马林固定一夜，用IPGell包埋后用石蜡包埋(日本东京热那亚公司)。制备了4微米厚的IPC标本和人肾、胰腺(肾小管细胞和胰岛分别为阴性和阳性对照)。这些标本经德岛大学医院批准使用(德岛临床试验管理系统2900-1，2017年12月25日)。标本收集是按照有关准则/条例进行的。所有患者均提供书面知情同意。部分去蜡，离开二甲苯(瓦科)，并通过一系列分级酒精溶液再水化。用0.3%过氧化氢酶(Wako)阻断内源性过氧化物酶20 min。抗原提取用乙二胺四乙酸缓冲液(pH6.0)于1400 W微波加热15 min，700 W下加热10 min，在无蛋白血清(美国达科，伯灵顿，加拿大)中孵育10分钟，以防止非特异性抗原结合。在室温下与原抗体孵育1.5h。主要抗体为：抗胰岛素(aa 287-299，LS-B 129；1：100，LSBio，西雅图，WA)，抗人ZnT 8(16169-1-AP，1：50，蛋白质，IL)和抗人ZIP 4(20625-1-AP，1：200，蛋白质).然后在室温下用二次抗体(Envision双链系统-HRP，DAKO)孵育1小时。切片用二氨基联苯胺(WAKO)制成，并与Mayer‘s的苏木精(Muto纯化学品，日本东京)抗衡。染色切片在分级酒精溶液中脱水，并进行盖层。

免疫荧光染色

对IPC标本进行切片、脱蜡、离体处理和再水化处理。内源性过氧化物酶的阻断和抗原的回收就像上面所描述的那样。为防止非特异性抗原结合，切片在3%BSA中孵育1h。然后用抗人胰岛素抗体(#4590S，细胞信号技术，Danvers，MA)在4℃培养一夜。用PBS洗涤3次后，再用二抗AlexaFluor 555羊抗兔IgG(A-21244，1：500，Invitrogen)孵育。用PBS冲洗后，用4‘，6-二氨基-2-苯环吲哚(28718~90-3，1：2000，圣克鲁斯生物技术，帕索·罗布尔斯，CA)孵育，检测细胞核。染色样品用PBS洗涤，眼睑覆盖。

定量成像分析

用ImageJ(国家卫生研究所，贝塞斯达，ML)对细胞图像进行数字分析。26...在双硫腙染色的分析中，细胞图像被转换为色调、饱和度和值(Hsv)模型，然后用7-20的色调阈值进行滤波。用滤波后的图像作为染色强度，测量了一个球体区域三个随机点饱和度的平均灰度值。52...在免疫组织化学染色分析中，将图像分为三个通道，用20-28色调阈值对图像进行滤波。在滤波后的图像中，测量了三个随机点在一个球体区域和背景下饱和度的平均灰度值。免疫组织化学染色强度以球体面积的灰度平均值除以背景灰度值的比值计算。染色强度数据按8个细胞球(3个随机点，n=8)的平均值计算。

IPC移植到链脲佐菌素诱导的糖尿病裸鼠体内

作为体内功能测试，ipc的移植正如我们上一次报告所描述的那样。17...将200 mg/kg体重链脲佐菌素(STZ；Sigma-Aldrich)溶于柠檬酸缓冲液(pH4.5)中，腹腔注射5~6周龄BALB/c裸鼠(日本横滨查尔斯河)。将STZ诱导的DM裸鼠定义为血糖值大于350 mg/dl，连续两次或400 mg/dl的裸鼠。按照我们以前的IPC移植方法，将96只iPC移植到STZ诱导的DM小鼠肠系膜中。17...假手术小鼠4只(n=4)，腹腔注射生理盐水(n=4)和裸小鼠n=4(n=4)。移植后，每2天记录一次用Medisafe Fit试剂盒(日本东京Terumo)获得的血糖值和体重，包括假手术组和天真裸鼠组。所有的老鼠都是在德岛大学的动物设施中繁殖的。实验和程序由德岛大学动物保护和使用委员会批准，并按照NIH“实验室动物护理和使用指南”进行。

定量逆转录聚合酶链反应分析

用RNeaseMini试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)从培养细胞中提取总RNA。RNA纯度用纳米滴Nd-1000谱仪(热科学)评定.用反转录试剂盒(QIAGEN)从总RNA中合成cDNA。应用StepOne Plus软件(应用生物系统，福斯特市，CA)对7500个实时聚合酶链反应系统进行TaqMan基因表达的定量逆转录-聚合酶链反应分析。基因表达水平与GAPDH基因表达水平基本一致。对SOX 17(Hs 00751752_S1，应用生物系统)和NGN 3(Hs 01875204_S1，应用生物系统)的引物进行了研究。

统计分析

统计计算采用SPSS统计版24(IBM，芝加哥，IL)或州立Mate III(ATMsCo.，Ltd.)。日本东京)。样本数据采用曼-惠特尼U-测验、学生和韦尔奇t检验或x-平方检验进行比较.多组间比较采用单因素方差分析、Bonferroni检验和Fisher‘s最小显着性差异。P值<0.05者为显着性。