吸血行为按蚊雌性提供卵子发育所必需的营养物质，并推动寄生虫在人与人之间的传播。疟原虫生长适应了媒介生殖周期，但生殖周期的变化如何影响寄生虫的发育尚不清楚。在这里，我们展示了血粉诱导的mir-276-5p微调的表达。支链氨基酸转移酶终止生殖周期。miR-276的沉默延长了高氨基酸(AA)分解代谢率，提高了雌性的生育力，提示AA分解代谢的及时终止限制了蚊子对繁殖的投入。延长AA分解代谢恶性疟原虫-受感染的女性也会损害传播子孢子形式的发育。我们的结果表明疟原虫孢子囊利用生殖投资后剩余的蚊子资源，论证了蚊子AA代谢在媒介内寄生虫增殖和疟疾传播中的重要作用。

食血生活方式按蚊女性是一种有效的生殖策略，被疟原虫利用进行传播。蚊子主要以富含碳水化合物的植物蜜腺为食，只有雌性蚊子才会采血来启动生殖周期。血粉为雌性提供了氨基酸和脂类的营养，这对卵子的发育至关重要。这种极端的饮食变化触发了多种蚊子组织的大量协调代谢变化，以确保在3天的时间窗内有健壮的卵子发育。

昆虫脂肪体是主要的营养储存器官，在蚊子的代谢过程中起着重要的作用。在血液喂养的合成阶段，脂肪体以三酰甘油(Tag)和从植物蜜腺中提取的糖原的形式积累营养。1,2,3,4...成功的血液喂养会大量增加蚊子循环中的游离氨基酸(AAS)水平，而这些氨基酸是通过雷帕霉素(TOR)途径在脂肪体内感知到的。5,6,7...TOR的激活，以及类固醇激素20-羟基蜕皮激素(20E)水平的升高，启动了从合成代谢向分解代谢的转变。1,2,7...在脂肪体中，血粉衍生的aas会进入三羧酸循环，产生能量以进行营养动员，并被整合到主要的卵黄蛋白中，如lipophorin和evellogenin。8,9...抑制营养物质的运输、代谢或TOR信号通路会显著降低卵子的产量。5,10,11,12,13...蚊子的繁殖周期大致可分为三个阶段。1,2：在早期(0-10h血液喂养(HPB))和中期(10-36 HPB)，代谢计划优先为快速卵子发育动员营养。在后期(36-72 HPB)，脂肪体中卵黄蛋白的产生停止，转录和代谢程序恢复到合成状态，以补充消耗的糖原和脂质储备。在后期从分解代谢转变为合成代谢，使雌性为下一个生殖周期做好准备。事实上，通过抑制脂肪体中的TOR信号负调节因子的自噬或沉默来延长生殖周期，第二个生殖周期限制了卵子的产生。14,15...因此，生殖周期的诱导和终止对女性生育至关重要。

蚊子在吸食被感染的血液时会感染疟原虫。恶性疟原虫性阶段，融合在蚊子的中肠产生运动的软绵体。渗出物在18~24 hPB时穿过中肠上皮，转化为卵囊，在中肠壁的基部形成感染。在这里，寄生虫经历大规模的复制和成熟(也称为产孢)。孢子发生后两周内，疟原虫生物量急剧增加，在每个卵囊内产生多达1000个子孢子。16...发育中的卵囊需要大量的营养物质，如AAS、糖类和脂类，它们依赖于蚊子的环境。因此，蚊子的营养状况在很大程度上与寄生虫的发育有关，这一点也就不足为奇了。17,18...抑制糖摄取或脂类通道疟原虫卵囊减少了可传播子孢子的数量和毒力。19,20...由于孢子发生在蚊子生殖周期结束后，卵囊并不直接与载体竞争，而是依赖于蚊子组织中未消耗的资源。19,21.

荷尔蒙信号，特别是20E，协调了形成蚊子血液后餐后代谢的转录和转录后网络。1,2,7...事实上，20E驱动的代谢改变对于释放储存的和血粉衍生的营养物对于蚊子的繁殖和寄生虫的发育是至关重要的。21...微RNA参与转录后调控，并将内分泌调节与代谢稳态联系在一起。埃德斯蚊虫22,23,24...使用转录方法冈比亚，我们鉴定了三种miRNAs，即miR-275、miR-276和miR-305，它们在血液喂养后不久就能诱导脂肪体表达。25...据报道，mir-275与我们的发现一致，可以调节血液的消化和鸡蛋的发育。24，而miR-305则显示会影响蚊子的微生物区系及恶性疟原虫一种尚不清楚的发展机制26...在这里，我们报告mir-276在微调支链氨基酸转移酶 (BCAT)在肥胖的身体里。我们发现miR-276耗竭延长了高水平的BCAT脂肪体中的表达和AA分解代谢，从而提高女性的生育能力。出人意料的是，持续的高AA分解代谢妥协恶性疟原虫孢子的发育和减少可传播的子孢子的数量。我们的结果证明了蚊子代谢在媒介能力和疟疾传播中的重要作用。

AAS和蜕皮激素对脂肪体miR-276的调节作用

为了明确miR-276在蚊虫繁殖周期中的作用，我们采用逆转录定量实时PCR(RT-qPCR)技术检测了其在采血前后腹部组织中的表达情况。由于脂肪体在腹部身体中高度富集，我们将其称为脂肪体样本。新蜕皮的女性表现出高水平的miR-276表达，在羽化后第二天下降(补充图)。1)。一顿血餐使miR-276水平从28提高到44 hpb(如图所示)。1A)。这种表达模式与类固醇激素蜕皮激素的动力学是平行的，蜕皮激素是蚊子发育和繁殖的关键调节因子，它的合成是由血粉触发的。为了比较miR-276表达的时间和蜕皮激素滴度，我们用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定了血液喂养的雌性雌性动物中代谢活性形式20-羟蜕皮酮(20E)的水平。1A)。20E滴度在诱导miR-276表达之前，从6升高到24，在36 hPB时下降到基础水平。基于这些结果，我们推测miR-276在脂肪体中的表达可能受到20E的调控。

aMir-276(红色)在女性脂肪体中的表达n=10，N=6)和20-羟基蜕皮酮(20E)标题(灰色)在蚊子雌性(n=9，N(3)采血后不同时间点。图为独立实验的平均值±扫描电镜。bMir-276在3~4日龄雌性大鼠体内脂肪体培养中的表达n=3，N=4)与含有或不含氨基酸(AA)和20E的培养基孵育后。用核糖体蛋白调节miRNA的表达水平。RPS 7基因。盒形图显示中位数与第一和第三四分位数，胡须描绘独立实验的最小和最大值，彩色点显示每个实验的平均值。统计显着性采用单因素方差分析和Tukey后自组织检验，并计算结果。p-数值显示在水平线上(n=为每个独立实验汇集的蚊子数量；N=独立实验的数目)。

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当20E和aAs共同调节蚊子的生殖周期时，我们在体外脂肪体培养系统中测定了20E或/和aAs刺激后miR-276的表达水平。27,28...腹部身体在附加或不加20E或/和AAS的培养基中进行体外培养。添加AAS或20E使miR-276的水平增加了两倍。此外，当AA和20E加在一起时，miR-276的表达明显增加了5倍(见图)。1B)。这些结果提示AA和20E对餐后脂肪体miR-276表达的调控具有协同作用。根据这些结果，生物信息学分析在miR-276基因上游调控区发现了一个潜在的与蜕皮激素诱导的转录因子宽带结合的位点。

MIR-276对支链氨基酸转移酶的抑制作用

microRNAs转录后通过与主要位于3‘UTR的特定位点结合，促进转录降解或抑制翻译。为了确定mir-276 mrna靶点，我们在硅靶预测工具中应用了三种，即米兰达(Miranda)。29、RNA杂交30和微焦油31(补充数据)1)。接下来，我们使用了一个可公开使用的RNAseq数据集。7为了鉴定脂肪体表达的候选目标mRNAs，将其反向表达模式转化为miR-276.这种双重方法使我们能够降低-为进一步分析挑选了8个可能的目标：ATP合酶(AGAP 012081)、支链氨基酸转移酶 (大西洋金枪鱼养护委员会；(AGAP 0011)，甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD；AGAP 004437)，甲基丙二酸-半醛脱氢酶 (MMSDH；AGAP 002499)，NADH脱氢酶 (NADH(I)、AGAP 010464)、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶 (MCC；AGAP 010228)，支链α-酮酸脱氢酶 (BCKDH、AGAP 003136)和线粒体鸟氨酸受体 (莫尔；AGAP000448)。

我们假设这些目标转录本的表达应该被miR-276抑制，并在miR-276敲除蚊子(miR-276)的脂肪体中测量选定的mRNAs的转录水平。川崎)RT-qPCR在miR-276表达高峰(38 HPB).注射反义寡核苷酸(miR-276 antagomir)可使MIR-276沉默，而注射加扰抗肿瘤药物作为对照(补充表)。2)。在通过考试的候选人中，只表达了BCATmiR-276抑制后显著增加(图1)。2A). BCAT携带一个预测的miR-276结合位点在其3‘UTR(图)。2B)。然而，由于我们没有对mir-276抑制后的mrna变化进行全基因组分析，我们不能排除mir-276对其他mRNAs的调节作用。BCAT.

a蚊虫采血后38h预测miRNA靶基因在蚊虫体中的表达(英文)n=5，N(6)注射抗miR-276(miR-276，红色)或加扰抗黑药(杂乱，灰色)。表示ATP合成酶, 支链氨基酸转移酶 (BCAT), 甘油-3-磷酸脱氢酶 (GPD), 甲基丙二酸-半醛脱氢酶 (MMSDH), 3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶 (MCC), NADH脱氢酶 (NADH(I)), 支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)和线粒体鸟氨酸受体 (莫尔)。表达水平通过核糖体蛋白正常化。RPS 7基因。方格显示的中位数与第一和第三四分位数，胡须描绘的最小和最大。统计学上的显着性用双向方差分析和Tukey‘s检验。临时员额测试和显着性差异由p-水平线以上的数值。b中预测的miR-276结合位点的序列。BCAT3‘UTR红色表示3‘UTR结合位点和miR-276的互补核苷酸.c体外双荧光素酶报告试验。一个包含三个miR-276结合位点拷贝的结构作为阳性对照。线条描绘媒介和彩色点显示独立实验的手段(N=3)。差异的统计学意义采用单向方差分析和Tukey后特别检验，差异的显着性由p-水平线以上的数值。d BCAT注射抗miR-276(miR-276)的蚊子生殖周期中脂肪体的表达川崎，红色的)或乱七八糟的(乱七八糟的，黑色的)。表达水平通过核糖体蛋白正常化。RPS 7基因。绘制了平均±SEM(垂直线)。miR-276之间的统计学差异川崎对照蚊用双向方差分析，图基后测(N=3)，显著差异显示在p-价值(*)(n=为每个独立实验汇集的蚊子数量；N=独立实验的数目)。

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接下来，我们将测试miR-276与BCAT3‘UTR的双重荧光素酶报告分析果蝇Schneider 2(S2)细胞体外培养。本实验检测miR-276在转录后抑制报告结构的能力，该报告结构包含雷尼拉荧光素酶报告基因BCAT3‘UTR我们生成了三个结构：(1)一个阳性对照，它携带三个mir-276结合位点(3x结合位点)的副本，(2)野生型。BCAT3‘UTR与一个完整的miR-276结合位点(BCAT 3’UTR)；和(3)aBCAT3‘UTR阴性对照与miR-276结合位点突变序列(bCAT 3’UTR)穆特)。S2细胞内源性低水平表达果蝇Mir-276导致基底抑制BCAT3‘UTR记者活动。共转染的蚊虫miR-276进一步增强了荧光素酶报告融合到功能3‘UTR结合位点的抑制作用，但不与突变对照融合(附图)。2)。重要的是，蚊虫miR-276通过miRNA结合位点和野生型三拷贝显著抑制阳性对照报告的表达。BCAT3‘UTR记者。相反，bCAT miRNA结合位点的突变使荧光素酶报告的抑制作用减少了两倍以上(如图所示)。2C和补充图。2)。这些结果表明，BCAT3‘UTR是善意目标是miR-276。

为了证实我们的体外发现，我们检查了BCATmiR-276血液喂养后体内转录水平的变化川崎注射蚊子。我们观察到在miR-276面前，BCAT转录水平早在24 hpb就下降了，抗肿瘤药对miRNA功能的抑制作用延长。BCAT表达速度接近12小时(图1)。二维空间)。我们得出结论，mir-276的曲调很低。BCAT在蚊子繁殖周期后期的表达。

Mir-276微调-生殖周期的aa代谢

BCAT催化支链氨基酸(亮氨酸、缬草碱和异亮氨酸)分解代谢的第一步。作为miR-276转录后抑制BCAT在生殖周期的后期，我们检测了miR-276基因敲除后的氨基酸代谢。我们比较了miR-276的代谢物谱。川崎并在三个时间点控制雌蚊(全蚊)恶性疟原虫-使用气相色谱-质谱(GC-MS)和液相色谱-质谱(LC-MS)(补充数据)进行感染的血液喂养(10、38和48 hpb)。1)。在miR-276表达前(10 HPB)和miR-276表达时(38和48 hPB)，我们选择了时间点。共检测到4，716个色谱峰(M/z在特定的保留时间)，其中816个是参照真实标准标注的。注释的数据被标准化为样本中值，并使用四分位数范围进行过滤。这些数据是进一步记录的。2-转换和帕累托缩放热图可视化。294项特征在生殖周期内发生显著变化(双向方差分析；补充数据)2)，并包括在热图中。对照组和miR-276均观察到血液喂养后的大量代谢变化。川崎蚊子(图1.3A)。早在10 HPB时，一大群高度富集的代谢产物就与人类血液的流入有关(第一组)。该簇由氨基酸、短链和长链脂肪酸以及鞘氨酰肌醇组成，可能代表从摄入的血液中提取的代谢物。第二个簇(第二组)主要由二肽组成，在10和38 HPB时大量存在，在生殖周期后期(48 HPB)消失。相反，第三组的代谢产物在38和48 HPB水平升高，与全血消化和卵巢发育阶段相对应。绝大多数第三簇代谢物是脂类(三酰基甘油醚(Tags)、磷脂二酰胆碱、磷脂二乙醇胺、磷脂酰肌醇)和海藻糖(图1)。3A)。总的来说，miR-276对所观察到的代谢物动力学没有明显的影响。川崎与血液喂养诱导的主要生理过程密切相关。这一观察与miR-276的微调作用是一致的，而miR-276的沉默并不妨碍血液喂养诱导的代谢谱。

a随生殖周期而变化的经注释的代谢物水平的热图。用气相色谱-质谱(GC-MS)和液相色谱-质谱(LC-MS)法测定全雌性(n=10，N=6)在10、38和48小时后恶性疟原虫-感染的血粉在对照组(杂乱，灰色)和miR-276-耗尽(miR-276)川崎、红色的)蚊子。底栏表示喂血后的时间点(10h，灰色；38h，橙色；48h，红色)，下面的梯度显示血液消化(红色)和卵巢发育(绿色)的进展。样本绘制在x-轴和代谢物y-轴心。对于热图可视化，数据是日志。2转变和帕累托规模。b动物分支链氨基转移酶(BCAT)经典酶活性综述。BCAA的氨基被BCAT转移到α-酮戊二酸盐中，从而产生谷氨酸.谷氨酸是一种氮库，在脊椎动物中被传递到尿素循环中。由于蚊子缺乏氨基甲酰磷酸合成酶，谷氨酸和尿素循环中的瓜氨酸之间的联系尚不清楚。在经典的尿素循环中，瓜氨酸被转化为精氨酸琥珀酸盐，然后精氨酸被代谢成鸟氨酸，最终释放尿素。代谢物在miR-276抑制作用下的变化(48 HPB)呈红色，未被检测到的代谢物呈蓝色，未被检测到的代谢物呈灰色。cmiR-276中分支链氨基酸(亮氨酸、缬草碱、异亮氨酸)、α-酮戊二酸和谷氨酸的折叠变化差异川崎与混乱控制相比。d全雌鱼采血后10h(灰色)、38h(橙色)、48h(红色)AA代谢产物的变化差异有显着性(P<0.05)。miR-276代谢物水平差异的统计学意义川崎而扰码控制被测试t-测试(n=为每个独立实验汇集的蚊子数量；N=独立实验的数目)。

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我们接下来的重点是BCAT相关的代谢产物。bCAT通过将bcaa氨基转移到形成谷氨酸的α-酮戊二酸盐中，启动bcaa分解代谢，该物质被认为是昆虫中的一种氮库。32(无花果)3B)。而BCAA的水平并没有在miR-276中有很大的变化。川崎蚊子，在48 HPB检测到的谷氨酸含量明显较高(图一)。3C)。此外，miR-276川崎组氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、精氨酸、精氨酸、琥珀酸精氨酸和鸟氨酸在48 HPB时也升高(图1)。三维空间)，指在生殖周期后期与氮代谢相关的代谢产物，即AA分解代谢产物的积累。miR-276测得的氮代谢增加川崎繁殖周期后期的蚊子(48 Hpb)与BCATmiR-276中观察到的水平川崎女性。综上所述，我们的结果表明mir-276通过微调来终止aa分解代谢。BCAT转录水平和miR-276沉默延长了蚊子生殖周期的分解期。

Mir-276调节卵子发生恶性疟原虫产孢性

蚊虫和疟原虫都依赖于营养物质，以获得成功的卵巢和孢子囊发育。我们首先研究了miR-276中分解相的延长。川崎蚊子会影响卵子的发育。雌蚊被注射miR-276或对照(扰流)和血液喂养三天后，以诱导卵子发育。两天后，女性被转移到产蛋室，并列举了雌性个体产卵的数量。抑制miR-276显著增加产卵(育性)而不影响幼虫孵化率(繁殖力)(图)。4A和补充图。5)。提供进一步证据BCAT是mir-276的目标，我们检验了BCAT击倒卵子。与miR-276的结果一致。川崎, BCAT血液喂养前注射dsRNA沉默可减少产蛋量，提示氨基酸分解代谢在蚊子繁殖中的关键作用(补充图)。6)。我们的结论是miR-276-BCAT轴通过终止卵子形成前的分解代谢阶段来调节蚊子对卵子的代谢投资。

a注射miR-276(miR-276)的雌性个体的产蛋率(育性)川崎)或控制血餐后的抗胃泌素(混乱)。方阵显示的中位数与第一和第三四分位数，胡须描绘最小和最大值。每个点代表一只蚊子，点的颜色表示独立的实验(N=3，补充表3). b女性注射miR-276(miR-276)川崎)或控制(混乱)抗黑药被感染恶性疟原虫...于感染后第11天测定卵囊数目和大小。中位恶性疟原虫平均每中肠卵囊恶性疟原虫每个实验的卵囊大小乘以产生孢子体指数(N=3，补充表3). c在感染后第14天，对每只蚊子的唾液腺孢子数量进行量化。方阵显示的中位数与第一和第三四分位数，胡须描绘最小和最大值。颜色显示每个独立实验的复制。统计上的显著差异表明p-由单向方差分析及图基的后特别检验推算出的水平线之上的数值(N=3，补充表3), N=独立实验的数目。

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接下来，我们问到，所观察到的代谢投资转向卵子发育是否会影响寄生虫的发育。使用相同的实验设置，我们感染了mir-276。川崎控制蚊子恶性疟原虫并测定感染后11天卵囊的数量和大小。类似于以前的报道，注射抗炎药致伤降低了寄生虫的感染负荷。33(补充图。4)。重要的是，对miR-276的抑制进一步显著减少了中位数或平均大小。恶性疟原虫卵囊。为了量化卵囊的发育，在每个独立的实验中，我们通过将中位数乘以每个中肠卵囊的平均大小来计算出一个孢子囊指数。我们观察到，无论感染水平如何，miR-276的孢子囊指数都明显降低。川崎蚊子比对照组(图1)。4B)。我们进一步检查了观察到的寄生虫质量的减少是否转化为唾液腺子孢子数量的减少。事实上，miR-276的抑制作用显著降低了唾液腺孢子的两倍负荷(图一)。4C)，表明分解期的延长限制了可用于寄生虫传播形式发展的资源。

总之，我们的结果表明，在脂肪体内，mir-276调节的从分解代谢向合成氨基酸代谢的转换限制了蚊子对卵子发育的投资和益处。恶性疟原虫发展。

这种嗜血的生活方式使蚊子在几天内获得了快速的卵子发育，但也有利于疟原虫的传播。血液喂养会引起大量的代谢改变，将所有资源重新导向生殖，这种状态在很长一段时间内是不可持续的。在这里，我们提供了证据，证明miR-276通过抑制BCAA分解代谢而产生负反馈回路，从而重置蚊子的新陈代谢。这种代谢复位限制了蚊子的繁殖投资，从而带来益处。恶性疟原虫产孢。我们的结果突出了蚊子繁殖在媒介能力中的重要作用。

脂肪体是昆虫的主要储存器官，它产生了大部分血淋巴产生的卵黄蛋白，对蚊子卵巢的发育起着至关重要的作用。34...血液喂养后，高滴度的AAs和20E促进脂肪体内从合成代谢转变为分解代谢，从而迅速释放糖原和脂质储备。1,2...同样的信号会诱导负调节因子(包括miR-276)的表达，从而保证脂肪体代谢的及时复位。14,15,25...脂肪体内AAS的大量降解为卵子的成功发育提供了高能量的营养动员和蛋白质合成需求。8,10...然而，高水平的AA降解也会产生大量的氮废物，这可能会限制生殖周期的代谢投资。35,36,37...有趣的是，埃德斯蚊子缺乏尿素循环酶的全部储备，并且依赖另一种氨解毒途径，即谷氨酰胺、丙氨酸和脯氨酸。32,38...我们没有观察到miR-276驱动的代谢产物在任何时间点的变化.相反，我们检测到在生殖周期后期，谷氨酸和其他典型的尿素循环代谢物(瓜氨酸、鸟氨酸、精氨酸琥珀酸盐和精氨酸)含量增加。这些结果指出了潜在重要的代谢差异埃德斯和按蚊蚊虫和呼吁进一步利用N进行有针对性的代谢物调查15-标记BCA，以测定这两种蚊子的尿素循环成分。本研究观察到的代谢变化的时间和性质表明miR-276有助于在生殖周期后期精细调节AA分解代谢。在这个阶段，脂肪体经历了从分解代谢到合成代谢的反向转变，以补充营养资源，为下一个生殖周期做好准备。1,2...作为代谢转换的一部分，miR-276转录后抑制编码分支链氨基酸转移酶(BCAA分解的第一步催化剂)的mRNA的翻译。BCAA的周转率代表着一个中心枢纽，它塑造了整个代谢状态，并受到严格的调控。39,40,41,42...在……里面果蝇，bcaa降解由miR-277控制。43...有趣的是，BCAA降解途径埃德斯中肠细菌负荷的形成机制尚不清楚。44...因此，除了在此检查的脂肪体外，miR-276对BCAA代谢的转录后调节可能在多个层面上影响蚊子的生理，包括中肠微生物群。结果表明，抑制miR-276可延长BCAA高水平的分解代谢，有利于女性生育能力的提高。这些结论进一步得到观察到的主要卵黄蛋白基因表达变化的支持。卵黄蛋白 (VG)(附图。3)。如VG在其3‘UTR中缺乏miR-276结合位点，不能直接受此miRNA调控，AA分解代谢的延长必须与脂代谢协调，这是一个值得进一步研究的有趣观察。基于这些结果，我们认为miR-276参与了一个负反馈回路，将AAS和20E在雌性生殖周期的早期/中期引起的分解代谢转移到了合成阶段。分解阶段的及时衰减对于限制昂贵的生殖投资和防止养分完全耗尽是非常重要的(图一)。5A)。代谢成本可能在调节生殖投资中发挥重要作用，因为噬血昆虫的血液消化会加剧氧化应激和氮废物产物。36,37,45...事实上，血液消化减少了飞行肌肉的线粒体活动，大概是为了减轻整体的代谢压力。46...此外，及时完成生殖计划对于筹备下一个生殖周期至关重要。14,15...我们建议，生殖周期的持续时间受到资源可得性和生殖费用之间的平衡的严格控制。

a氨基酸(AA)和20-羟蜕皮酮(20E)在血液喂养后诱导miR-276的表达，从而通过抑制支链氨基酸转移酶 (BCAT)。这种向合成代谢转变的脂肪体内限制了蚊子对繁殖的投入。恶性疟原虫孢子囊期寄生于剩余的蚊子资源中，以供其自身发育。b蚊虫营养状况及生殖投资程度对媒介内环境的影响恶性疟原虫孢子囊发育

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疟原虫严重依赖蚊子吸血来进行有性生殖和传播。早期的研究集中在蚊子繁殖和蚊子繁殖之间的权衡上。疟原虫感染蚊虫与未感染蚊虫生殖读数的比较研究47,48...然而，蚊子雌蚊在大量寄生虫繁殖前完成卵的发育，从而避免直接竞争营养物质。疟原虫寄生虫19,21...在这里，我们实验证明，通过抑制miR-276来延长AA分解期的高水平会增加蚊子的繁殖投资，并限制了蚊子的孢子发育。恶性疟原虫...我们认为，蚊子的代谢状况和生殖投资之间的平衡决定了疟原虫孢子发生与传播(图1.5B)。重要的是，生殖投资策略的多变性可能是导致同样暴露于蚊子物种之间的媒介能力差异的原因之一。疟原虫感染49.

连同以前的报告19,21，我们的研究描述了蚊子代谢计划和资源分配的遗传或激素控制影响女性生殖能力的一般机制。疟原虫发育和寄主内毒力。我们认为蚊子的代谢状况和生殖投资是影响疟疾传播的媒介能力的重要组成部分。

蚊虫

[医]科氏按蚊恩古索(TEP 1*S1在整个研究过程中使用了菌株。蚊虫在30°C，80%湿度下，昼夜循环12/12 h，有半小时长的黎明/黄昏期。所有的蚊子都喂饱了[医]锂加10%的糖溶液。

血餐恶性疟原虫感染

无性培养(寄生虫血症>2%)恶性疟原虫NF54(由荷兰RUMC的R.Sauerwein教授提供)以1，500 rpm离心5 min，用新鲜红细胞(RBS)稀释至4%红细胞压积下的总寄生虫血症1%。无性和配子体细胞在37℃与3%O共同培养。24%CO2...在加热板上每天更换配子体培养基15~16d，以减少温降。播种后第14天，用Giemsa染色涂片测定配子体血症，显微镜下观察寄生虫的发芽率。

蚊子是用人工饲养系统喂养的。50,51接种后15~16d用稀释的配子体培养，最终配子体率为0.15~0.22%。该喂料系统是通过在喂料器底部盖上拉伸的副菲林来制备的。给料机采用水流加热至37°C。饲喂蚊虫15 min，驱除未喂食的蚊虫。在湿度为80%的26°C下，只对完全膨大的雌性进行了进一步的分析。

寄生虫量化

为恶性疟原虫卵囊计数，感染后第11天用70%乙醇杀死感染蚊子。蚊虫在PBS中洗两次，中肠在1%的水中进行解剖，室温下孵育10 min。卵囊在立体镜下计数。在卵囊大小方面，光镜下每中肠取3张有代表性的中肠卵囊，放大40倍，用斐济图像测量卵囊大小。每个试验通过将卵囊的中位数和平均卵囊大小相乘来计算孢子体指数。

.的数目恶性疟原虫在感染14d后，对唾液腺中的子孢子进行检测。在70%乙醇中，用PBS洗涤，杀死至少30只蚊虫，并在RPMI培养基(吉布科)3%牛血清白蛋白(Sigma Aldrich)中解剖唾液腺。用玻璃柱塞将唾液腺均匀化，释放子孢子。用细胞滤器(100和40m)过滤两次玻璃瓶，1：10、1：20和1：50稀释。在光镜下用血细胞计对孢子进行计数。补充表中提供了每个实验的样本大小3.

20-羟蜕皮激素(20E)定量

使用20E环境影响评估试剂盒(开曼化学)量化20E水平。每个时间点收集9只雌鱼，冷冻后保存在−80°C。分析当天，所有样品均质于500 ml甲醇中，用偷窃珠和琼脂组织裂解器在50 rpm下进行10 min。样品经15，000 rpm离心1 min后，上清液(420 Rm L)转入干净管。甲醇在快速箱里蒸发了。球团被溶解在230升的环境影响评估缓冲液(开曼化学)。1：3稀释系列20E，从361 ng/ml开始，作为标准曲线。测量是按照制造商的指示进行的。

体内脂肪体组织培养

体外脂肪体培养采用氨基酸、盐、钙和Tris缓冲液。27无菌过滤保存在−20°C中，制备出不含氨基酸的碱性培养基，用等摩尔度的甘露醇代替。20E在乙醇中溶解，在培养基中加入等量乙醇。3只3-4日龄雌性雌性的腹部身体被解剖，并与以下物质孵育：(1)培养基，(Ii)10。−6M20E，(Iii)氨基酸(AAS)；和(Iv)10−6M20E(Sigma)和AAS27...27°C培养6h，用RNAzol提取RNA，定量表达miRNA/mRNA。

RNA表达分析样品采集

为了研究miRNA和mRNA的表达动力学，在餐后不同时间在冰上解剖了10只喂糖或喂血的雌性动物。立即用RNAzol(SigmaAldrich)对腹部身体(脂肪体)进行匀浆，并将其保存在−80°C进行RNA提取。总RNA由RNAzol根据制造商的建议进行分离，包括用4-溴氨基甲酚进行纯化。总RNA产量用Qubit(ThermoFisher Science)测定。

miRNA表达分析

miRNA表达用miScript PCR系统(Chiagen)进行定量，该系统允许实时PCR定量表达同一个反转录反应混合物中的mRNA和miRNA。用Quantitect SYBR Green PCR试剂盒进一步检测其cDNA水平。从miScript引物分析中得到正向miR-276引物，并根据补充表中所述的序列合成反向引物。124...用相对标准曲线法计算表达数据。miRNA的相对表达量与核糖体蛋白S7(RPS 7).

mRNA表达分析

在靶标鉴定方面，用Revertaid H负第一Strand cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Science)反向转录RNA，用SYBR Green PCR(Thermo Fisher Science)进行RT-qPCR分析。用相对标准曲线法计算表达数据。miRNA的相对表达量与编码核糖体蛋白S7的基因(RPS 7)。引物序列列在补充表中1.

计算miRNA靶预测

用三种独立的算法：Miranda对miRNA目标进行了预测。29、RNA杂交30，和微TAR31.

miRNA抑制

Anagomir(反miR-276-5p和一个没有目标的相同的加扰版本冈比亚基因组)是以自定义单链RNA合成(Dharmacon)的rna模块(Dharmacon)为RNA反义寡核苷酸，具有2‘-O-甲基化碱基、前两个和最后四个核苷酸的硫代磷酸骨干和一个3’胆固醇(补充表)。2)。为了抑制miRNA，蚊子被CO麻醉。2用Drummond Nanoject II号(Drummond Science)在羽化后12~18h微量注射207 nL 200 mantagomir(41 pmol/雌性)。蚊子在吸血或吸血之前，被留了四天时间恢复。恶性疟原虫感染。

产卵孵化试验

雌蚊和雄蚊被关在同一个笼子里。在生育测试中，雌性个体在血液喂养后的第三天被轻轻地转移到带有蛋盘(湿的白鲸纸)的单杯中，并允许产卵两夜。卵子用立体镜计数。在繁殖力测试中，雌性在血液喂养后被关在一起，并允许在一个普通的鸡蛋盘上产卵。产卵后，在26°C 80%的湿度下，将鸡蛋盘在水中保存一天。幼虫孵化率是通过用立体镜计算开卵壳的数量(至少100个卵)来衡量的。

双荧光素酶法

在体外目标验证中使用果蝇S2细胞(Invitrogen)。这些细胞被保存在施耐德果蝇在25°C添加10%热灭活的FBS(吉布科)和1%青霉素链霉素(vol/vol)(Thermo Fisher Science)的培养基，研究了三个荧光素酶结构：(1)与miR-276有三个反向互补位点的阳性对照物，每个miR-276结合位点之间有四个核苷酸连接点；(2)A.冈比亚大西洋金枪鱼养护委员会3‘UTR和(3)A.冈比亚大西洋金枪鱼养护委员会3‘UTR与一个置乱的miR-276绑定位点。所有构造都分别插入到位于雷尼拉psiCheck-2载体(Promega)内的翻译终止密码子。PsiCheck-2记者(100纳克)和一名合成人员冈比亚mir-276-5p miScript miRNA模拟物(100 ng，钱根)在最终浓度为100 nm的条件下被共转染。果蝇S2细胞使用FuGENE HD转染试剂(Promega)。只转染psiCheck-2的细胞作为“无miRNA模拟”对照。采用双荧光素酶报告系统(Promega)，转染48h后进行双荧光素酶报告分析。psiCheck-2载体中的萤火虫荧光素酶雷尼拉荧光素酶表达三组进行测量，三次分别重复三次。

非靶向代谢组学样品制备

雌性蚊子(1天大)被注射抗miR-276-5p或像上面描述的混乱的抗病毒剂。四天后，蚊子感染了恶性疟原虫...在10、38和48 hPB时，每处理10只雌鱼被冻在液氮中。样品在−80°C保存至制备。此外，在38和48 HPB时，每组10只雌性蚊子的腹部身体(脂肪体)被采集，用RT-qPCR进行miRNA靶分析。

非靶向代谢组学由MetaSysX GmbH公司进行，波茨坦，德国。样品的制备是按照MetaSysX标准程序进行的，这是Salem等人的一项改进协议。52...用组织匀浆器将10只冻住的蚊子的身体都埋在一种均匀的细粉中。分别用甲基叔丁基醚(MTBE)/甲醇/水溶剂体系萃取极性代谢产物和亲脂化合物，将分子分离为水相和有机相。MTBE萃取后，将含有脂类和亲脂化合物的有机相转移到1.5ml管中。用真空抽吸器除去有机相的残馀物，并将含有半极性和极性化合物的500μl的水相收集到一个新的管中。另外，150个极性相被转移到一个新鲜的试管中进行衍生化和GC-MS分析。所有样品用离心蒸发器干燥，保存在−80°C，直到LC-MS和GC-MS分析为止。

液相色谱质谱

对极性和脂质的测定，干燥样品分别悬浮在170毫升的水或乙腈中。对2l注射量进行了分析。采用超高效液相色谱(UPLC)分离小分子，并对QExactiveOrbitRAP MS(ThermoFisher Science)进行正、负极性分析。

用水-ACQUITY反相超效液相色谱(RP-UPLC)耦合热-Fisher QExactive质谱仪对样品进行了测定。丙8(100 mm×2.1 mm×1.7μm粒子；水)和HSS T3 C18(100 mm×2.1mm×1.8μm颗粒；水)柱分别用于亲脂和亲水性测定。采用15 min梯度分离极性和亲脂性化合物。以0.1%甲酸为流动相分离极性化合物和半极性化合物。2乙腈中O(缓冲液A)和0.1%甲酸(B缓冲液)。色谱分离条件为：初始浓度99%~1 min，A99%~A60%，0~11 min，A60%~A30%，11~13 min，A30%~A1%，13~15 min。以下流动相用于脂类和亲脂代谢物的分离：1M氨4在0.1%醋酸(缓冲液A)和乙腈：异丙醇(7：3)中加入1%的乙酸。M氨4Ac在0.1%醋酸(缓冲液B)中。脂类和亲脂化合物的分离采用步骤梯度，分别为45%起始至1 min、45%~25%A在4 min、25%~11%A在11 min内、11%~0%A在15 min之间。在全扫描质谱模式下记录色谱图(质量范围为100~1500)。

在本仪器采用加热电喷雾电离(HISI)，喷涂电压3.5kV，毛细管温度−275°C，鞘层气体流量−60单位，质量分辨率70，000，3×10的条件下，获得了全部质谱。6目标值(AGC)和最大填充时间为200 ms。在脂质注释方面，所有样品在LC-MS/MS模式下进行四次汇总和测定.利用高能碰撞离解(HCD)在数据依赖的MS/MS模式下进行碎裂。利用25的归一化碰撞能量，选择了三种最强烈的离子进行每个周期的碎裂。全扫描光谱在100-1，500 m/z范围内获得，质量分辨率为35，000，agc为10。5最大填充时间为100 ms的离子。数据依赖的MS/MS扫描的目标值设置为5×104离子的最大填充时间为50 ms，隔离窗为1 Th。测量了MS/MS离子的分辨率为17，500，动态排斥设置为3s，数据采集采用了Thermo Excalbur。

利用内部元SysX数据库对LC-MS极性平台和非极性平台检测到的特征进行匹配。元SysX数据库包含与样品测量相同的色谱和光谱条件下测定的标准化合物的质量-电荷比和保留时间信息。极性平台的匹配标准分别为5 ppm和0.095 min，偏离标准物质的质量-电荷比和保留时间，脂类注释的标准分别为5 ppm和范围(−0.095；0.255 min)。相同离子质量的共洗脱化合物被保留为未解决的注释。MS/MS生成的片段进一步证实了脂质的注释。元SysX开发的基于R的算法使用来自碎片、中性损失存在和在两种电离模式中检测到的前兆质量信息的信息。这些信息与从数据库搜索中获得的信息相结合，从而提供了更多的可信度。脂质数据库是根据前体离子质量、碎裂谱和洗脱模式建立的。53...注释过的脂质的洗脱模式被用来为脂质注释提供额外的置信度。

气相色谱质谱

干燥样品悬浮于盐酸甲氧基/吡啶溶液中，在30℃下孵育90 min，然后在37℃下用N-甲基-N-三甲基水飞蓟酰三氟乙酰胺(MSTFA)衍生化30 min。54...样品在Agilent技术GC上进行测量，该质谱计由EI电离源和TOF质量分析仪组成。柱：30 mDB 35；起始温度：85°C，2 min；梯度：15°C/min，至360°C。

从LECHPEGASUS软件导出的NetPDF文件被导入到“R”生物导体包TargetSearch中。55将保留时间转换为保留指数(RI)，对色谱图进行对齐，提取峰，并通过将光谱和RI与Fiehn库和用户创建的库进行比较来注释它们。在LECO飞马中人工确认了峰的注释。分析物是用一个独特的质量来量化的。在数据库中没有匹配的RT和质谱的代谢物被标记为未知。