脓毒性休克是一种与细胞代谢紊乱和心血管功能障碍相关的全身炎症。增加O-GlcN酰化在急性病变中表现出有益的心血管效应。我们用两种不同的大鼠模型来评价O-在脓毒性休克早期刺激GlcNAc。大鼠接受脂多糖(LPS)诱导内毒素性休克或生理盐水(对照组)和液体复苏(R)。O休克诱导后1h刺激GlcNAc(NButGT-10 mg/kg)。第二组大鼠采用盲肠结扎穿刺(CLP)手术和液体治疗，无论NButGT是否存在。心血管功能评估和心脏和血液样本的收集和分析。NButGT治疗有效增加总量O-GlcNAc，不改变HBP酶的表达，改善两种模型的循环参数和心血管功能，恢复SERCA2a的表达水平。NButGT治疗也降低了动物死亡率。在这项研究中，我们证明了在脓毒性休克中O-GlcNAc刺激改善与SERCA2a水平恢复相关的全球动物和心血管功能结果。这项临床前研究为早期脓毒性休克的潜在治疗开辟了道路。

脓毒症是一种重大的世界性负担，也是导致死亡的主要原因。根据丹尼尔斯的说法，2011年全世界每天有20，000多人死于脓毒症。1...辛格最近的衰老报告等人...脓毒性休克是一种全身炎症反应综合征，是指与心血管功能障碍和细胞代谢改变相关的感染。2...事实上，感染性休克的诊断因素包括低血压、心动过速、高乳酸血症和器官功能障碍。

大约50%的感染性休克患者会出现心肌抑制。3...虽然目前还不完全清楚心肌抑制的机制，但许多研究已经确定其共同特征包括微血管异常、钙缺乏、代谢改变、线粒体功能障碍和心肌细胞凋亡。4...伴随的炎症反应导致高水平的细胞因子和趋化因子(如肿瘤坏死因子、α、IL-6)的合成，也可能是脓毒性休克或内毒素性休克后心功能不全的原因之一。

抗生素是首选的治疗方法，在此基础上，脓毒性休克治疗的主要目的是优化组织供氧，避免缺血和多器官功能衰竭的发生。因此，改善血流动力学和心血管功能是病人管理的首要目标。5.

关于心脏的主要代谢途径和心衰过程中流量改变的影响，人们对此了解甚多，但对替代代谢途径知之甚少。己糖胺生物合成途径(HBP)导致了一种独特的蛋白质糖基化形式，尽管在过去的十年里人们一直在深入研究它。OGlcN酰化在1984年首次被Torres和Hart描述6...这种翻译后修饰是一个快速而可逆的过程，调节蛋白质的活性或定位。OGlcN酰化可以与丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸化竞争。速率限制酶L谷氨酰胺果糖-6-磷酸氨基转移酶(GFAT)调节HBP的通量，只有2种酶能转移或去除蛋白质上的GlcNAc结构：OGlcNAc转移酶(OGT)和OGlcNAcase(OGA)。水平O-GcNAc可通过使用药理化合物来调节，以降低(如：DON和Azaserine)或增加(例如：氨基葡萄糖、PUGNAc、NButGT)的蛋白质水平。O-GlcN酰化。而蛋白质O-GlcN酰化调节在急慢性疾病中似乎会产生不同的影响。7几乎没有证据表明，这种翻译后修饰在全球范围内的增加可能成为治疗脓毒性休克的一种未来治疗途径。在创伤出血的情况下，再灌注期间使用氨基葡萄糖或PUGNAc通过改善炎症反应和器官功能提高动物的存活率。8...最近，黄等人...在脓毒性休克模型中证明，由于小鼠炎症状态的减少，氨基葡萄糖预处理可以提高小鼠的存活率。9.

在这方面，我们建议增加蛋白质ONButGT治疗后的GlcN酰化可以改善脓毒性休克动物模型的预后。我们证明，尽管炎症状态没有改善，但增加了蛋白质。O-GlcN酰化能改善脓毒性休克大鼠的全球预后。我们认为，这种治疗可以改善心功能。

NButGT有效增加总数O-GlcNAc在脓毒性休克中，对参与己糖胺生物合成途径的主要酶没有任何影响。

脓毒性休克大鼠(LPS和CLP)O-GlcNAcylated蛋白和HBP酶(OGT和OGA)与对照大鼠和Sham大鼠相比没有修饰(见图)。1，但GFAT增加了，这是限速酶(p=0.0210)。VS假图2B)在CLP模型中观察到。除了略有增加的OGA之外，O用液体复苏法改变GlcNAc水平、OGT和GFAT表达。不出所料，OGA阻断剂NButGT治疗有效地增加了总量。O-蛋白的GlcN酰化在LPS模型中为2倍，在CLP模型中为2.5倍(图1)。1A和2A)。在这两个模型中，这种增加与三种主要酶的调节作用无关。O-GlcNAc水平。

内毒素休克的影响O-免疫印迹法检测GcNAc对己糖胺生物合成途径主要蛋白的刺激作用。分别于休克诱导后3h、LPS、LPS+液体复苏(休克诱导后1h：15 ml/kg)和LPS+R+(NButGT：10 mg/kg)处理对照组的心粉蛋白进行检测。O-GlcNAc(A)，GFAT(B)，OGT(C)和OGA(D)。图像是典型的免疫印迹在4-15%TGX无染色凝胶上的代表.结果表示为归一化与GAPDH表达的比率。均值±扫描电镜，**p<0.01VS控制；##P<0.01VS采用Kruskal-Wallis分析和Dunn‘s后测法测定。

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脓毒性休克的影响O-用免疫印迹法评估GlcNAc对GcNAc的刺激作用。O-GlcNAc通路调控。24小时后用NButGT(NButGT：10 mg/kg)对Sham、CLP和CLP+处理的心粉蛋白进行检测。O-GlcNAc(A)，GFAT(B)，OGT(C)和OGA(D)。图像是典型的免疫印迹在4-15%TGX无染色凝胶上的代表.结果以TGX无染色或GAPDH表达的比例表示.均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01 vs Sham；#P<0.05VS采用Kruskal-Wallis分析和Dunn‘s后测法测定。

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O-GlcNAc刺激不影响炎症反应

用心脏(RT-qPCR)和血浆(ELISA)检测感染性休克动物的炎症状态。3)。在这两项分析中，LPS均导致炎症性IL-6和肿瘤坏死因子α细胞因子的显著增加.然而，单用液体复苏或NButGT治疗未改变动物的炎症反应。

炎症参数的测量。Il-6的心脏基因表达及血液细胞因子释放A)和肿瘤坏死因子α(B)用定量逆转录聚合酶链反应(qrt-PCR)和酶联免疫吸附试验观察休克诱导后1h LPS、LPS+液体复苏(R：15 ml/kg)和NButGT(NButGT：10 mg/kg)处理对照组心肌粉蛋白或RNA的变化。平均值±扫描电镜，*p<0.05VS控制室。

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O-GlcNAc刺激可显著减少脓毒性休克对循环参数的影响

LPS处理的大鼠血液pH值降低(pH值7.38±0.02)；VSLPS组(7.31±0.01)与碳酸氢盐浓度及二氧化碳分压降低相关(P<0.01)。4A-C)。低氧(乳酸：2.52±0.37，LPS：4.74±0.53mmol/L，p<0.01)、肾滤过(肌酐：25.3±3.4，LPS：51.4±7.8mol/L，p<0.01)和心肌损伤(肌钙蛋白T，CTRL：6.1±1.0，LPS：156.5±82.3ng/L，P<0.05)。4D-F).

分别于休克诱导后3h、LPS、LPS+液体复苏(休克诱导后1h：15 ml/kg)和NButGT(NButGT：10 mg/kg)处理LPS+R+后3h测定循环血液参数。评价了代表稳态的参数：pH(A)、碳酸氢盐(HCO)3−), (B)和血液二氧化碳分压(PCO)2), (C)。乳酸被用作全球缺氧的标志。D)，肌酐用于肾功能评估(D)，肌钙蛋白T(肌钙蛋白T)作为心脏损害的标记物(E)。在脓毒性休克诱导后30小时内对死亡率进行了评估(F)。测量值为均值±扫描电镜。*p<0.001.0 5，**p<0.0 1，**p<0.001.0 1，采用Kruskal-Wallis分析和Dunn‘s后测.生存分析采用Kaplan-Meyer曲线，用Mantel-Cox检验进行评估.

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虽然单用液体复苏并不能改善这些参数，但结合NButGT治疗，可使循环参数(如HCO)正常化。3−(P<0.001)VSLPs+FR)和PCO2(P<0.001)VSLPS+FR)。此外，NButGT处理引起乳酸正常(3.02±0.27mmol/L，p<0.001)。VS肌酐(33.7±4.7mol/L)，p=0.001VSLPs+R)和肌钙蛋白T(33.6±11.6ng/L，ns)VS表明NButGT动物的器官功能得到改善。最后，如图所示。4G，添加NButGT可使存活时间增加3倍(NButGT为26.8h)。VS8.6h，LPR+R，p=0.0242)。

O-GlcNAc刺激改善内毒素血症大鼠的心血管功能

探讨O-GlcNAc刺激，下一步是研究心血管功能。如图所示。5A，B，内毒素休克四、四注射LPS可引起血流动力学改变，尤其是心动过速。LPS治疗大鼠也出现收缩功能障碍(LVEF，对照组为80.7±2.1)。VS脂多糖组65.1±2.9%，P<0.001)和延迟舒张期(E/E‘比，对照组25.4±2.9)。VS超声心动图评价LPS含量为17.0±1.34(P<0.05)。5C，D)。液体复苏能有效改善平均动脉压(与对照组相似)，但对心功能无任何影响。

心功能参数心功能评价体内休克诱导3h后，LPS、LPS+液体复苏(R：15 ml/kg)和LPS+R+给予NButGT(10 mg/kg)。上面的面板显示了侵入性心率评估的结果(A)和平均动脉压(B)。底部面板显示各种超声参数与收缩功能评估(C)左室射血分数：左室射血分数(LVEF)及舒张功能评价(D二尖瓣早期血流速度与二尖瓣环舒张早期速度E/E‘的比值。均值±扫描电镜，*p<0.05，**p<0.01，*p<0.001。VSCtrl；#P<0.05VS采用Kruskal-Wallis分析和Dunn‘s后测法测定。

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NButGT在液体复苏刺激蛋白中的应用O-GlcN酰化对平均动脉压无进一步影响(与对照组和LPS+R组相似)。但轻度恢复心功能，收缩功能改善(LVEF，75.0±1.7%，P<0.05)。VS心脏舒张功能(E/E‘，23.0±2.0，p=0.090)VS)。

一种更相关的脓毒性休克模型证实了O-GlcNAc刺激对血浆参数的改善和对心血管的影响。

如图所示。6A，B，CLP所致脓毒性休克导致低血压(91.3±3.8)VS101.3±1.7mmHg(P=0.0789)和心动过速(490.8±10.8)VSSham组419.3±10.6bpm，P<0.001)。补NButGT后平均动脉压恢复(101.0±3.6mmHg，p=0.0789)VS而心率几乎降至控制值(441.1±8.6bpm，P<0.0 1)。VS(中电)。

全球成果的衡量。评价了全球结果体内术后24h给予NButGT(NButGT：10 mg/kg)治疗Sham、CLP和CLP+。上面的面板显示了心脏功能的侵袭性评估(A)平均动脉压和(B)心率。底部面板表示(C)呼吸频率，(D)乳酸症(E)肌酐血症和(F)肌钙蛋白T水平。均值±扫描电镜，*p<0.05，**p<0.01，*p<0.001。VS假的；#P<0.05，##与CLP比较，P<0.01；采用Kruskal-Wallis检验和Dunn‘s后测.

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CLP大鼠呼吸频率也有增加(54.1±3.0)。VS44.9±1.7rpm在Sham，p<0.001)，在乳酸血症中(3.2±0.2vs1.1±0.1mmol/L，p<0.001)。VS和肌酐血症(31.0±3.5)VSSham组为22.4±1.0mol/L，P<0.01)。有趣的是，NButGT没有改善模型中的乳酸血症(3.6±0.2mmol/L)，但能显著改善呼吸频率(42.8±1.3 rpm，p<0.01)。VSCLP)和血浆肌酐水平(23.4±0.9mol/L，p<0.05)VS)(图1.6C-E).

O-GlcNAc刺激通过恢复钙调节因子改善心血管功能，但不改变自噬。

的影响所涉及的机制的评估O-内毒素休克大鼠仅进行GlcNAc刺激。本模型不受LPS、液体复苏或NButGT的影响。7A-C)。然而，LPS注射增加了CTRL中SERCA2a蛋白的表达(1.0±0.1)。VS1.7±0.2，P<0.001.0 1，液体复苏未恢复(1.5±0.2，p=0.0 7)VS但受到NButGT治疗的影响(NButGT为0.7±0.1，P<0.001)。VSP<0.01VSLPs+R)(图1.7E)。同时，LPS液体复苏和NButGT均不影响RyR 2的表达，也不影响磷脂的活性形式(图1)。7D-F)。在这个模型中，参与自噬的基因和蛋白质也在心脏中被评估，但是NButGT治疗没有改变这些基因和蛋白。8).

钙稳态的调节。分别于休克诱导后3h用心粉、LPS、LPS+液体复苏(1h后R：15 ml/kg)和LPS+R+(NButGT：10 mg/kg)治疗。Ryr 2基因表达A)，SERCA 2(B)和磷脂(C)采用qRT-PCR方法进行评价。RyR 2蛋白表达D)，SERCA2a(E)和磷脂(F)免疫印迹分析。图像是典型的免疫印迹在4-15%TGX无染色凝胶上的代表.结果以TGX无染色印迹或α-微管蛋白为标准表达.平均值±扫描电镜，*p<0.001。VSCtrl；###P<0.001VSLPs；$$P<0.01VSLPs+R；用Kruskal-Wallis分析和Dunn‘s后测法测定.

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自噬的调节。分别于休克诱导后3h用心粉、LPS、LPS+液体复苏(1h后R：15 ml/kg)和LPS+R+(NButGT：10 mg/kg)治疗。LC3基因和蛋白的表达A)和Beclin-1(B)采用qRT-PCR和免疫印迹分析。图像是典型的免疫球蛋白在4-15%的凝胶上的代表.结果表示为归一化与GAPDH表达的比率。平均值为±SEM。

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本研究旨在评估O-GlcNAc刺激作为脓毒性休克的早期治疗。我们的结果表明蛋白质的增加O-与OGA抑制剂NButGT的GlcN酰化，改善了两种不同的脓毒性休克动物的全球预后。O-GlcNAc刺激可能是临床感染性休克治疗的一种有价值的治疗策略。

在本研究中，LPS和CLP模型均产生脓毒性休克，在血浆(肌酐、肌钙蛋白T和/或乳酸)水平出现器官功能障碍和代谢紊乱，心血管功能障碍伴心动过速、低血压以及收缩和舒张功能障碍。因此，根据最新的定义，我们的动物发生了脓毒性休克。2,10.

蛋白质增加O-与NButGT的GlcN酰化与HBP酶表达的修饰无关。本研究的结果是基于两种休克模型，一种是LPS诱导的模型，一种是快速和可重复的内毒素休克(3h)，另一种是CLP模型，后者发展了一种长期的多微生物脓毒性休克(24小时)。在这两种模型中，脓毒性休克导致GFAT表达增加，但没有改变(I)OGT和OGA的表达，OGT和OGA是两种直接参与GFAT表达的酶。O-GlcNAc水平调节和(Ii)全球蛋白O-心脏组织中的GlcN酰化。NButGT诱导大鼠全身性蛋白质增加O-GlcN酰化在心脏组织中，但对OGA、OGT和GFAT的表达无影响。之间的关系O-GlcNAc水平和病理状态尚不清楚。我们的结果与之前的研究一致O-GlcNAc水平受压力调节，GFAT、OGA和OGT的调节可能需要更长的时间。例如，胞内葡萄糖浓度的显著增加并没有改变gft基因或蛋白的表达。11,12...同时，OGT的表达似乎对O-GlcNAc调制13,14...然而，gft和ogt的活性受udp-glcnc、glcn-6-P和O-GlcNAc集团13,15,16,17. 离体，长期的扩大O-OGT腺病毒转染或硫代美G(10 M)处理后GlcNAc水平增加，OGA基因和蛋白表达增加。14,15,18...这些结果表明，OGA的调制需要更长的时间。

目前，四、四液体复苏联合抗生素治疗是治疗感染性休克的金标准。19...正如我们所预期的，在我们的研究中，用胶体团进行液体复苏可以提高平均动脉压。然而，仅用液体复苏并不能改善酸中毒和器官功能障碍的循环标志物。液体复苏疗法最近被讨论，因为它可能会对肾功能产生不良影响。20，对脓毒性休克患者有潜在的长期不利影响。我们的研究结果表明有必要对液体复苏疗法进行一次新的询问。有趣的是，NButGT在LPS处理的大鼠液体复苏治疗中能有效地使pH和碳酸氢盐正常化。这种治疗方法也能使乳酸和肌钙蛋白T等器官功能的循环指标正常化，并延长生存期。此外，我们观察到LPS处理的大鼠血浆肌酐水平明显升高，提示急性肾损伤。在我们的两种模型中，NButGT治疗使血浆肌酐水平正常化，提示对肾功能有潜在的有益影响。为了验证这一假设，还需要进行额外的生理、生化和组织学分析。在这个模型中，NButGT也改善了心脏，导致动物状态的早期改善。我们的CLP所致脓毒性休克模型也证实了NButGT的有益作用，从而改善了心血管功能和呼吸功能。这一观察与其他研究相一致，这些研究也证明了O-休克刺激GlcNAc。在心脏缺血再灌注，急性肾损伤或出血性休克后，O-GlcNAc刺激(以葡萄糖胺、PUGNAc、siRNA对抗OGA)改善心脏或肾功能，并提高动物的存活率。8,21,22,23,24,25...在这些作用的机制中，作者的结论是在炎症反应，自噬调节和/或钙超载方面有改善。

有趣的是，在我们的模型中，O-GlcNAc刺激可改善存活率、循环参数和心功能，而对炎症反应无任何影响。在我们的研究中，IL-6和TNF-α在休克诱导后3h升高，无论是否给予NButGT的液体复苏治疗均无影响。有趣的是，O-在其他心力衰竭模型的病理后期，GlcNAc水平与炎症标志物显著减少有关。8...在最近的一项研究中，Baudoin等人...定义.之间的关系O-GlcN酰化和炎症是“广阔的探索领域”26...事实上，O关于炎症的GlcNAc是有争议的。在以前关于感染性休克的研究中9或炎症模型，如外伤出血27作者证实血浆细胞因子(IL-6或TNF-α)减少.尽管如此，由于NButGT的作用，这种炎症反应的增加并没有改善，这与PRO是一致的。-炎症反应开始于LPS注射后30分钟，并维持至少24小时。28,29...其他的研究已经评估了蛋白质增加的影响。O-晚期GlcN酰化和早期NButGT治疗在病理后期可能有影响。

自噬被认为是一种生物质量控制机制，在脓毒性休克中会导致大量的自降解或有毒物质的积累。减少自噬已被证明能改善心脏的收缩能力。30...基于这一观察，我们假设在NButGT治疗的大鼠中观察到的改善可以部分通过调节自噬来解释。事实上，蛋白质的增加O-GlcN酰化通过降低Beclin-1或LC3II蛋白的表达而减弱自噬途径。31,32...然而，在我们的研究中，Beclin-1或LC3基因或蛋白在对照组和LPS处理的大鼠中的表达没有差异。据孙说等人.这些自噬调节因子的表达取决于给予LPS的时间和剂量。33,34...因此，在我们的实验条件下，NButGT对自噬途径的影响不能与NButGT的有益作用联系起来。

心脏的改善也与钙调节蛋白表达的改善有关。考虑到心功能不全在脓毒性休克反应中的主要作用，我们仅在LPS大鼠模型中研究了心肌收缩力的主要调控因子钙稳态。虽然许多研究描述了脓毒性休克晚期钙循环的改变，但早期研究很少。35...这些研究表明，在后期(小鼠和大鼠内毒素休克后6-20小时)和莫尔斯(Morse)，SERCA 2功能下降或没有变化。等人...显示脓毒性休克恢复期SERCA 2活性增加。36...在我们的研究中，SERCA2a在脓毒性休克的早期(3h)进行了研究，SERCA2a蛋白水平似乎有所增加。有趣的是，NButGT治疗重新建立了SERCA2a蛋白的表达.我们推测，在我们的模型中，SERCA2a过表达可能是一种旨在减少脓毒性休克时潜在的细胞质钙超载的代偿机制。此外，对少数动物(n=4)进行了离体心肌细胞钙功能的分析，结果与westernblot分析结果一致，表明NButGT处理的动物细胞在钙处理方面有明显改善(数据未显示)。之前的研究已经证明了O-GlcNAc水平和SERCA2a表达，对SERCA2a表达的确切影响尚不清楚。两项研究显示，在调节O-GlcNAc水平后，SERCA2a的表达没有改变。37,38...然而，随着心脏功能的改变，O-GlcNAc的增加也与糖尿病患者SERCA2a mRNA和蛋白表达的下降有关。39,40...此外，SERCA2a可以O-GlcNAcylated，对其活动的影响仍不清楚41,42...NButGT在早期感染性休克治疗中的有益心血管效应可能部分是由于钙稳态蛋白水平的提高所致。

总之，我们证明了O-NButGT治疗后刺激GlcNAc可改善两种不同的脓毒性休克模型的心血管功能和整体预后。在本研究中，我们发现这种改善与钙周期相关蛋白的正常化有关。这项临床前研究为急性疾病，尤其是脓毒性休克的潜在治疗开辟了新的途径。

试剂

所有试剂和解决方案都是从Thermo Fisher科学公司购买的。(马里兰州沃尔瑟姆)或来自西格玛-奥尔德里奇(圣路易斯，MO)。用MS法合成NButGT43...从试验研究中确定NButGT剂量为10 mg/kg，作为获得最佳心脏蛋白的最佳剂量。O-GlcN酰化。

动物模型

在温度(21~24°C)、湿度(40~60%)和光照/暗周期(12 H)的标准条件下饲养大鼠，光照周期从07：00开始。有食物和水[医]锂...实验是由负责动物实验的伦理委员会、负责动物实验的第6号付款委员会(2687-2015102815445892)批准的，并按照法国关于动物福利的法律、欧盟关于动物实验的第2010/63/EU号指令以及国家卫生研究院“实验室动物的护理和使用指南”(NIH Pub)进行。第85-23号，2011年修订)。

NButGT最佳剂量的确定

在Macauley和Savadlo研究的基础上，确定了健康大鼠NButGT的最佳剂量。44...在LPS模型中测试三种剂量，并在心脏水平进行O-GlcNAc测量。在本研究的所有后续议定书中，剂量为10 mg.kg。−1被利用了。

内毒素大鼠模型

10周龄雄性Sprague-Dawley大鼠(法国LeGenest ST，Janvier)静脉注射脂多糖(LPS，5mg.kg-1，LPS来自法国西格玛大肠杆菌O 111：b4)诱发内毒素休克，并与正常大鼠(iv注射生理盐水)进行比较。1小时后，单独用格洛芬(B.Braun)15 mL/kg(LPS+R)或NButGT(10 mg/kg)复苏。注射LPS后3小时，观察大鼠体内测量，处死，左心室在液氮中收集。心粉是用迫击炮磨得的。

观察大鼠内毒素休克诱导后30h的死亡率。在此期间，动物被过早地用致死剂量的戊巴比妥(Dolethal)安乐死。®、法国巴黎的维托奎诺)，如果它们符合具体标准：无行动能力，褥疮姿势呼吸困难。

盲肠结扎穿孔大鼠模型

对10周龄雄性Wistar大鼠进行盲肠结扎穿刺(CLP)手术。查尔斯河由Rittirsch出版的一份修改的协议(法国，Ecully)等人.45...大鼠用1%异氟醚(Forene，Abbott France，Rungis，法国)混合气体麻醉。2...两次结扎。第一例位于回肠盲肠瓣下(盲肠长度的100%)，以避免结扎回盲肠动脉，从而引发大量坏死。第二位位于盲肠远端(占体长的20%)，包括动脉，以造成坏死。在这两次结扎之间，用一根16-G针进行了一次穿刺.取粪便0.1mL，然后在腹腔内分布。假手术大鼠麻醉后行开腹手术，无盲肠结扎及穿刺。所有动物均接受丁丙诺啡治疗(10克/公斤)−1，术前和术后8h皮下，Buprecare，Med‘Vet，法国)。CLP大鼠亦注射10毫升/公斤。−1皮下注射生理盐水，用于术后液体复苏，术后8和22h，补充或不加NButGT 10 mg/kg。−1...手术后24小时，对大鼠进行观察。体内压力测量，献祭，心脏和血液采集进行生化分析。

体内心血管评估

在LPS或生理盐水注射后3小时，用2%异氟醚和1 L.min麻醉动物。−1 O2限制血流动力学反应。经胸超声心动图采用VIVID 7(GE保健(挪威霍顿)(如上文所述，配备10兆赫扇形探头)39...测量了五个心脏周期，并对每个数据值进行了平均。

通过右颈动脉测量血压，评估平均动脉压信号和心率。取右侧颈动脉，近端结扎，插入2F微端压力导管(米拉尔仪器公司、得克萨斯州休斯顿)。压力信号和心率用A/D转换器记录。EMKA技术(法国巴黎)通过IOX1.5.7软件系统在计算机上存储和显示(EMKA技术)。然后，采集血液和左心室进行生物和生化分析。

血液分析

使用Gem Premier 3000血气分析仪对动脉血气参数进行了分析，该仪器实验室位于法国勒普雷圣热尔韦市的Werfen。用Nova STATABLE测定静脉血中的乳酸。®乳酸护理点，诺瓦生物医学，隆吉斯，法国。用肌酐酶酶法测定血清肌酐，用免疫化学发光法测定肌钙蛋白T HS在法国罗氏罗氏6000 Ce分析仪上的含量。

qPCR和WESTERNBLOTTING分析

定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)如前所述。40使用SYBR绿色(StepOnePlus，ThermoFisher)。对每一组织，反转录总RNA样本进行三份定量的基因表达。对Ywhaz和GAPDH家族基因(来自GeNorm定义的基因池)进行正常表达，并采用ddCT方法进行表达。Primers for the genes measured in this study were：Ywhaz(Fwd AGCGAGGGACATCTGCAAC，Rev CTTTGCTTTCTGGCTGCGAA)，Gapdh(Fwd TTGTGCAGTGCCAGCCTC，Rev TGAACTTGCCGTGGGTAGAG)，Phospholamban(Fwd GGGTTTGACCAGCAAGCAAG，Rev AGCACAGCTGTCTGGTTTGT)，Serca(Fwd GTGGAACCTTTGCCACTCATT，Rev AGCACAAAGGGCCAGGAAAT)，Ryr(Fwd TCCTGTGCTGAGGCACTGAT，Rev CTCCATGACCCTCAGGGGA)，Lc3(Fwd GCCCCCACCCCTGAAAGG，Rev AATGACCACAAGATCCACATACCAT)，Beclin(Fwd TGGAGTCCCTGACAGACAAATCT，Rev ACCGCAAACCCCAGAA)，Il6(Fwd CCACCAGGAACGAAAGTCAAC，Rev TTGCGGAGAGAAACTTCATAGCT)；Tnfa(Fwd TGCCATTTCATACCAGGAGAAAGT，Rev CTTAGGGCAAGGGCTCTTGA).

Westernblotting实验是在如前所述的LV组织样本上进行的。46，在T-1缓冲液中用10 MNButGT进行萃取。蛋白质用以下抗体进行评估：gFAT(Thermo Science，1858781)、ogt(Sigma，O-6139)、ogA(ABCAM，105217)、RyR 2(ABCAM，2868)、SERCA2a(ABCAM，2817)、磷化安定(ABCAM，2865)、O-GlcNAc(ThermoScience，24565)和α-tubulin(Sigma，T 9026)。

数据和统计分析

结果表示为n个实验的平均±扫描电镜。如果样本的分布符合高斯定律，则采用单向方差分析进行参数比较，否则采用Kruskal-Wallis检验进行比较。然后用邓恩试验(GraphPad Prism 8)对这两种测试进行分析。a P值<0.05被认为具有统计学意义。生存分析采用Kaplan-Meyer生存曲线，用Mantel-Cox检验进行评估.