Bach2缺乏小鼠IgG转换自身抗体滴度升高
据报道，bach 2缺乏的小鼠在gc形成方面有缺陷，当受到外源抗原的攻击时，类开关抗体的产生减少。21...我们证实，Bach2的缺失会影响B细胞产生IgG开关抗体，这是由于T细胞依赖的诱导抗原免疫，甚至在体外存在适当的信号(补充图1)。1)。由于这些结果与以前的研究一样，是在急性免疫模型和体外环境下获得的，因此目前尚不清楚它们是否适用于稳定状态下产生的慢性自发免疫激活。为了澄清这一问题，我们检测了未治疗的Bach2缺乏小鼠20周后的抗体反应。虽然这些小鼠血清总IgM效价升高，但血清总IgG滴度明显降低，提示CSR受损(图1)。1A)。Bach2缺乏的小鼠在其脾脏中没有形成任何GCs，而大量GCs存在于它们的WT小分子中(图1)。1B)。与此结果一致，B 220+CD 138−GL7+Fas+Bach2缺乏的脾脏中GcB细胞数量明显少于WT小鼠(见图)。1C)。因此，这些结果表明，在对故意免疫的反应中，年龄偏低的Bach2缺乏的小鼠在自发的GC形成中有缺陷，IgG开关抗体的产生减少。
图1：Bach2KO小鼠自身抗体和自身抗体分泌细胞的特征。取大约20周龄的Bach2KO小鼠及其小白鼠的血清和脾脏。用ELISA法测定血清总IgM和IgG滴度。a，抗dsDNA IgM和IgGd，抗M3R IgM和IgGf...用荧光共聚焦显微镜检测脾脏GCs。b、流式细胞术检测胃癌B细胞c，伊莉斯波特用来计数分泌抗体的细胞。e, g...数据以任意单位(AU)和抗体分泌细胞(ASCs)中的平均值±SEMs表示，分别来自三个独立的实验。B 220门控FACS型面+CD 138-细胞是三个独立实验的代表。标尺，250μm.*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 by Student’s t-测试。
鉴于对自身免疫和主动免疫的不同分子要求32,33Bach2缺乏可能不影响抗自身抗原的抗体反应，与抗外源抗原的作用相同。为了解决这一可能性，我们检测了抗双链DNA抗体的效价和同工型，这是一种抗狼疮的特异性自身抗体。令人惊讶的是，它们所含的IgG开关抗体的滴度比它们的WT小分子要高得多。1D)。其折叠差异与抗dsDNA IgM效价相当。与此相一致的是，分泌抗dsDNA IgG的细胞和分泌抗dsDNA IgM的细胞在Bach2缺乏小鼠的脾脏中比在其WT小白鼠中更丰富。1E)。我们还发现了另一种抗M3R蛋白的自身抗体。34抗dsDNA抗体在CSR的分布和分泌细胞的组织分布上表现为抗dsDNA抗体(图1)。1F，g)。因此，这些结果表明，Bach2缺乏以不依赖GC的方式刺激IgG转换的自身抗体分泌细胞的产生，这种活动在故意免疫的情况下不发生。
Bach2缺乏小鼠以不依赖Treg细胞的方式表现狼疮性肾炎的组织病理学表现
Anas，特别是抗dsDNA IgG，以免疫复合物的形式存在于肾小球内，导致Ⅲ型超敏性肾小球肾炎。为了确定这个过程是否发生在Bach2缺乏的老年小鼠身上，我们对他们的肾脏进行了组织病理学检查。正如预期的那样，IgG和IgM在Bach2缺乏小鼠的肾小球中沉积的数量比WT对照组多(图2所示)。2A，b)。Bach2缺乏的小鼠也有升高的组织学指标的狼疮性肾炎，以他们的高细胞评分和增殖肾小球百分比(图一)。2C，d)。因此，在Bach2缺乏的小鼠中富集的IgG自身抗体似乎足以驱动狼疮性肾炎。
图2：狼疮性肾炎的组织病理学表现及Treg重建对Bach2KO小鼠的影响。a–d用组织病理学方法对大约20周龄Bach2KO小鼠的肾脏和它们的WT小白鼠的肾脏进行了观察。抗鼠IgM抗体、IgG抗体及平均荧光强度(MFI)染色的典型免疫组化图像a, b...标度棒，50μm.周期性酸-希夫染色及组织病理学指标c, d. e–g正常同基因Foxp 3静脉注射Bach2KO和WT小鼠+Treg细胞或PBS作为车辆控制。Foxp 3+CD4+输注8周后检测脾细胞中的细胞。e...在指定的时间采集受体的血清，用ELISA法进行检测。f...所有图形显示为±SEMs，符号代表单个小鼠的值。用共聚焦荧光显微镜观察抗-IgM或抗-IgG抗体染色的肾脏切片，显示为平均±SEM MFI。g. *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 by Student’s t-测试。NS，没什么意义。
除了作为B细胞特异性的调节功能外，bach 2还以细胞自主的方式稳定foxp 3。+Treg细胞。事实上，我们观察到Treg细胞在CD4中所占的比例+Bach2缺乏的小鼠T细胞明显减少。为了确定狼疮诱导的自身免疫在Bach2缺乏小鼠中是否仅仅是由于这种Treg细胞缺乏，我们过继地将正常的Treg细胞转移到Bach2KO小鼠中，并能够部分但显著地恢复其Treg细胞的数量(图一)。2E)。从Treg细胞受体获得的Treg细胞对常规T细胞的增殖抑制作用与从PBS受体中获得的细胞一样有效(补充图1)。2A)。此外，PBS-注入的Bach2KO小鼠的肺部炎症在Treg细胞灌流小鼠中也有部分减轻(附图)。2B)，证实转移的Treg细胞功能正常。然而，在输注后4周和8周，Treg细胞受体和车辆受体的血清抗dsDNA IgM和IgG抗体水平没有显著差异(图1)。2F肾沉积IgM和IgG也未受影响(图1)。2G)。提示Bach2缺乏症的IgG自身抗体介导的病理并非单纯由于Treg细胞缺乏所致。
Bach2缺陷细胞与WT B细胞转录组的差异
为了鉴定bach2缺陷B细胞EF激活的基因和途径，我们对脾CD 19进行了RNAseq分析。+Bach2KO和WT小鼠在20周龄时的B细胞。这些结果揭示了两种细胞类型的基因表达模式不同。根据我们建立的DEG标准，共有234个基因差异表达，其中122个基因上调，112个基因下调。3A，b)。升华Prdm 1和CEBPB以及对.的下调艾达，这是以前知道的21,35，验证了用于获取RNAseq数据的细胞的状态。有趣的是，与B细胞GC限制有关的基因(RGS 13和S1PR2)36,37下调，而与B细胞GC释放有关的基因(S1pr3)37被放大(图1.3B，e)，提示Bach2在GC形成中具有B细胞自治功能。表示的结果RGS 16，另一种与B细胞的GC限制有关的基因，Bach2的缺失并没有改变，这表明RGS 13它依赖于Bach 2的功能，而不是改变GC形成的结果。
图3：Bach2缺乏的B细胞和对照B细胞的转录组分析。aBach2KO和WT B细胞基因表达热图的变化。bBach2KO与WT B细胞基因表达变化的火山图。与KEGG通路有关的基因如表所示。c和dSLE KEGG通路基因的热图和富集图。e定量RT-PCR验证RNAseq数据。图是两个独立实验的代表。*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 by Student’s t-测试。
接下来，我们在186条KEGG通路中确定了丰富的途径，以确定那些专门指导Bach2缺乏B细胞生理的途径。令人惊讶的是，具有特殊免疫意义的不同富集途径包括“系统性红斑狼疮的KEGG”(调整后)。P=0.046。3C，d)。提示Bach2缺乏的B细胞比WT B细胞具有更高的SLE相关基因激活。
bach 2的B细胞特异性缺失足以损害gc B细胞的发育，但不影响ef Ab的应答。
我们询问Bach2KO小鼠IgG自身抗体的不依赖于GC的产生是否源于B细胞自主机制。为了解决这个问题，我们将μmt bm细胞和bach2kobm细胞混合在一起，生成bm嵌合小鼠。拉格2−/−小鼠(以下简称B-KO)并对其进行检测。体外在重建后15周。μMT BM细胞与WT BM细胞的混合物作为对照(以下简称B-WT)。与KO小鼠相似，B-KO小鼠CD 19的比例和数量也有所减少。+B细胞和GC B细胞。4A，b)。然而，与KO小鼠不同的是，B-KO小鼠CD 19的比例并不高。罗氏CD 138+血浆细胞比他们的B-WT细胞(图1)。4C)。与此结果一致的是，B-KO小鼠血清总抗体和dsDNA特异性IgM抗体滴度没有升高，IgG抗体滴度明显降低(图一)。4D，e)。分泌IgM和IgG抗dsDNA抗体的细胞在B-KO小鼠的脾脏中也少于B-WT小鼠(见图)。4F)。这些结果表明，Bach2的B细胞内源性丢失足以导致B淋巴细胞减少和GC B细胞发育受损，但不足以驱动EF Ab的产生。
图4：Bach2的B细胞自治功能。拉格2−/−用μMT BM细胞加Bach2KO或WT BM细胞重组小鼠产生B-KO和B-WT嵌合小鼠。骨髓重建15周后，取受体血清和脾细胞，用流式细胞仪进行检测。a–c、ELISAd, e伊丽莎白f...基于CD 19的FACS配置文件+CD 138-细胞和活淋巴细胞被用来计数Fas。+GL7+胃癌B细胞与CD 19-CD 138+血浆细胞b, c...所显示的数据来自三个独立的实验。a–e或者是两个独立实验的代表f并显示为平均值±SEMs，符号表示单个小鼠的值。*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 by Student’s t-测试。
bach 2的T细胞特异性缺失诱导CD4+T细胞自发分化为Tefh细胞
由于上述数据暗示Bach2缺乏的B细胞产生IgG自身抗体需要Bach 2的非B细胞内源性丢失，因此我们扩展了我们的实验，以探讨Bach2缺乏是否以细胞自主的方式诱导Tefh细胞的自发发育。为此，我们制作了另一种混合BM嵌合小鼠TCRβ−/−在图中用BM细胞代替μMT BM细胞。4并测定重建后10周左右自发产生的Th亚群。不出所料，嵌合体老鼠与TCRβ−/−BM和Bach2KOBM细胞(简称T-KO)所含Th2和Th1细胞比例较高，Treg细胞比例较低。TCRβ−/−BM和WT细胞(称为T-WT)(图)。5A，b)。Th17细胞在两种类型的小鼠中几乎缺失(数据未显示)。在T-KO小鼠中，Foxp 3的比例+CD4细胞+CXCR 5+代表滤泡调节性T细胞(TFR)的细胞也减少了，而CD4细胞则减少了。+CXCR 5+BCL 6+Tfh细胞没有明显改变，导致Tfh细胞与TFR细胞的比例增加(见图)。5C，d)。此外，T-KO小鼠中CD4的比例较高。+CD62L−CD 44嗨PSGL 1罗氏细胞比T-WT小鼠(图1)。5E)。年老的KO小鼠与WT小鼠相比，同一表型细胞的比例也有所增加，而且这部分细胞中只含有两种CXCR 4。+细胞与CXCR 5+细胞(图1.5F)。重要的是，CXCR 4的百分比+KO小鼠和CXCR 5组细胞数均显著增加。+同一部位的细胞未发生改变。这些数据表明CD4细胞的比例+CD62L-CD 44嗨PSGL 1罗氏表型包括Tefh和Tfh细胞，T-KO小鼠的Tefh细胞比例高于T-WT小鼠。为支持这一发现，该部分中的细胞并不是IL-4或IFN-γ的主要来源，与Th2和Th1细胞不同(图1)。5G，h)。IL-21在任何组分中均未检测到表达(未显示)。有趣的是，CD4+CD62L−CD 44嗨PSGL 1罗氏T-KO小鼠细胞部分表达ICOS高于T-WT小鼠的水平(图1)。5I)。最后，我们发现在T-KO小鼠中，GC B细胞和IgG抗dsDNA抗体明显升高。5J，k)。这些结果表明，bach 2的缺失有利于CD4的自发分化。+T细胞以细胞自主的方式进入Tfh和Tefh细胞，分别通过GC介导和EF途径增强抗体反应。
图5：bach2的t单元自治功能。拉格2−/−小鼠TCRβ−/−BM细胞和Bach2KO或WT BM细胞产生T-KO和T-WT嵌合小鼠。骨髓重建后约10周，取受体脾细胞和血清，用流式细胞仪进行检测。a–e和g–j和ELISAk分别。用流式细胞仪检测了约20周龄Bach2KO小鼠的脾细胞及其WT小白鼠的脾细胞。f...具有代表性的CD4门控FACS简介+ a, b和d，CD4+CXCR 5+ c，CD4+CD62L− e–h，CD4+CD62L−CD 44嗨PSGL 1罗氏 i，以及B 220+ j都显示出来了。数据代表三个以上的独立实验，并显示为手段±SEMs，有或没有符号代表单个小鼠的价值。AUS，任意单位；CTL，阴性对照染色。*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 by Student’s t-测试。
Bach 2压制ICOSCD4转录+T细胞
上述数据使我们推测，Bach2是调节Tefh细胞发育途径的因子的抑制剂。我们主要研究的是作为调节因子的共刺激分子icos，因为icos是tefh细胞发育所必需的。10，我们注意到类似母马的序列是潜在的bach2结合位点−1891到−1899和−98到−108 bp的上游。ICOS转录起始位点硅中分析。这些序列与规范MAR序列的同源性>77%。事实上，我们发现当通过tcr和cd28刺激时，bach2缺乏的CD4。+T细胞产生更高水平的ICOSmrna和细胞表面icos比对照CD4更好。+T细胞(图1.6a，b)。C-Maf是Icos通路中的下游信号分子，在Bach2KO细胞中也比WT细胞丰富。相反，CD4+表达Bach2逆转录病毒的T细胞可下调Icos在细胞表面和mRNA水平上的表达。6C)。为了证实bach 2在体内的这一功能，我们将cd4进行了转导。+携带bach2或空载体的T细胞表达逆转录病毒，并过继地将这些细胞转移到TCRβ−/−老鼠。CD4+表达Bach2的逆转录病毒介导的T细胞表面Icos水平明显低于空载体介导的T细胞。6d)。这些结果揭示了Bach2和Icos之间的负相关关系。
图6：Bach2抑制Icos转录。a, b脾CD4+用定量RT-PCR法检测bach2ko和WT小鼠的T细胞。a和FACSb. c, dCD4+用流式细胞术(FACS)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测bach 2型或空载体型逆转录病毒(Rv)感染的T细胞。c转移到TCRβ−/−小鼠，10天后进行FACS分析d...CD4门控FACS简介+细胞显示。e将pGL4b-hICOS报告子与MigR1-Bach2或空载体共转染Jurkat T细胞，经PMA和离子霉素刺激后，用荧光素酶活性测定。f将pcDNA3-2×标志-Bach2载体转染Jurkat T细胞，在PMA和离子霉素(P/I)存在或不存在的情况下孵育，芯片-qPCR检测。所有的数据都代表了三个独立的实验。*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 by Student’s t-测试。
以检验bach 2绑定到ICOS启动子和转录抑制，我们用含有2000 bp的人的报告结构进行荧光素酶报告试验。ICOS转录起始点上游的启动子。Bach 2的强制表达降低了荧光素酶的表达，说明Bach 2抑制了荧光素酶的活化。ICOS启动子(如图所示)6E)。这一结果支持了bach2结合位点存在于2000 bp区域的观点。ICOS转录起始点在芯片-qPCR分析中，交叉连接染色质与Abs免疫共沉淀标记bach 2，而不富集于被刺激细胞中含有−1891至−1899母马样序列的基因组区，而未富集−98至−108区。6f)。这个结果显示bach 2与ICOS启动子，但不是近端。
