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Bach2缺乏导致自身反应性B细胞产生IgG自身抗体,并通过T细胞依赖性卵泡外途径诱导产生红斑狼疮

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发表时间:2019-12-09 17:13作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

Bach2缺乏导致自身反应性B细胞产生IgG自身抗体,并通过T细胞依赖性卵泡外途径诱导产生红斑狼疮

摘要

在系统性红斑狼疮(SLE)的发病过程中,类切换IgG自身抗体(而非未切换IgM自身抗体)起着至关重要的作用。众所周知,Bach 2对Ig基因的类转换重组是必不可少的,但最近的基因组和临床研究表明,Bach2缺乏与SLE有关联。本研究旨在探讨Bach2调节SLE发展的机制。尽管免疫时Ig类开关重组和生发中心形成存在缺陷,巴奇2−/−小鼠自发积累IgG自身抗体分泌细胞,无生发中心调节性T细胞独立反应,并伴有类似SLE的表现。转录组分析表明,Bach2调控了B细胞中与生发中心形成和SLE发病机制有关的基因的表达。B细胞特异性缺失Bach2足以损害生发中心B细胞的发育,但不足以促进IgG自身抗体的产生。Bach2缺乏症引起的CD4+T细胞以细胞自主的方式过度表达icos并分化为滤泡外辅助T细胞。这些发现提示Bach2缺陷的自身反应B细胞优先在卵泡外部位反应,产生IgG类转换的致病浆细胞,这种作用需要bach 2的帮助。-ICOS辅助T细胞因此,Bach2在B细胞中及其同源CD4中的细胞自主作用+T细胞需要维持对系统性红斑狼疮的自我耐受性。

导言

系统性红斑狼疮(SLE或狼疮)是一种系统性自身免疫性疾病,其特征是大量抗核自身抗原的抗体(Abs)。1...在不同类型的抗核抗体(Anas)中,只有IgG类转换型anas被认为是致病的,因为它们以免疫复合物的形式沉积在组织中,导致肾脏、皮肤和其他器官的炎症和终末期器官损害。相反,gm类未切换的anas通过协助清除细胞碎片和干扰由IgG anas介导的反应,从而产生对自身免疫的保护作用。2,3,4...其他亚型如IgA和IgE的致病性几乎没有证据。因此,在抗体分泌细胞出现之前进行IgG类开关重组(CSR)是SLE发生的关键。

虽然有一些模型表明T细胞无关的抗体反应会导致小鼠狼疮。5对易发狼疮小鼠和系统性红斑狼疮患者的研究表明,T细胞依赖的抗体反应是该疾病的主要驱动因素。抗原参与的B细胞与同源CD4的初步相互作用+T细胞在T细胞区和卵泡的边缘促使B细胞增殖并分化为卵泡外浆细胞和生发中心B细胞。6,7,8...EF和GC反应分别由辅助性T(Th)效应细胞(称为EF Th(Tefh)和滤泡Th(Tfh)细胞)的特殊亚群指示。9,10...尽管有一些常见的表型(Bcl 6)+ICOS+CD40L+PSGL罗氏B细胞帮助的共同机制,趋化因子受体(CXCR 5)的差异+CCR 7对于Tfh细胞和CXCR 4+CCR 7+(对于Tefh细胞而言)导致它们分化成两个解剖上不同的空间。然而,在分岔点控制B细胞命运决定的机制尚不清楚。

按照传统的模式,浆细胞分泌类转换和亲和力成熟的abb主要是由gc反应所致。11,12,13因此,GC一直被强调为SLE的主要驱动因素。然而,这一范式主要建立在使用急性免疫模型的研究基础上,而且由于几个原因,可能不适用于随机发病的慢性自身免疫反应。首先,自反应B细胞往往在卵泡入口处被排除在外,因而可能被优先激活以产生致病的IgG自身抗体。14,15...第二,一些B细胞通过EF途径进行Ig CSR。6,7...最后,在某些模型中,EF途径也与系统性红斑狼疮有关。15,16,17...这些发现提示EF抗体的反应在SLE的发展中也很重要。因此,阐明EF途径的机制和遗传风险等位基因,有助于了解SLE的发病机制。

最近的全基因组关联研究(Gwas)表明巴奇2与系统性红斑狼疮18,19...这一可能性得到了一项临床研究的支持,该研究显示bach 2在SLE患者中的表达受损。20...Bach 2是一个具有碱基区亮氨酸拉链结构域的转录抑制因子。18...它与小的maf蛋白形成异源二聚体,并与目标基因的maf识别元件(MAR)结合。Bach 2最初被鉴定为一种B细胞特异性因子,是Ig编码基因的csr和体细胞高突变(Shm)所必需的。21...这种活动可以用B细胞中的基因调控网络来解释:bach 2抑制了bach 2的表达。Prdm 1,它编码blimp-1,这是血浆细胞发育的主调节器;这延迟了blimp-1的诱导,从而确保了用于表达艾达,编码激活诱导的胞苷脱氨酶(Aid),这是csr和shm必需的酶,最终防止未切换的早产儿浆细胞的出现。22...除其在B细胞中的功能外,bach 2还以细胞自主的方式参与T细胞介导的免疫反应,CD4的倾斜分化证明了这一点。+T细胞向炎症效应T细胞(尤其是Th2细胞)转化而牺牲Foxp 3+Bach2缺乏小鼠的调节性T(Treg)细胞23,24,25...虽然这些发现证实了Bach 2作为免疫抵抗炎症效应T细胞活性的关键调节因子,但目前尚不清楚Bach 2是否也影响体液效应Th细胞的发育。

基于人类GWASs的证据和上述临床研究18,19,20可以预见,Bach2基因缺陷会使个体易患系统性红斑狼疮。然而,这一假说并不能解释Bach2缺陷的B细胞是如何引起SLE的,而SLE严重依赖于IgG自身抗体。也不清楚Bach2在B细胞、T细胞或T细胞和B细胞中的细胞自主效应在SLE中是否重要。为了回答这些问题,我们首先研究了Bach2缺乏的小鼠是否会自发地产生伴随狼疮的自身免疫反应。令人惊讶的是,我们发现与以前的报道相矛盾的是,Bach2缺乏的自身反应B细胞会产生产生IgG转换的自身抗体的浆细胞,这种活性足以使肾表现使人联想到狼疮。利用骨髓重建系统,我们解剖了B和T细胞中Bach 2的细胞自治功能。我们的发现提供了证据,证明Bach2基因缺陷通过T细胞依赖的EF激活Ab,使个体易患系统性红斑狼疮。

材料和方法

小鼠

C57BL/6小鼠巴奇2+/−最初由Igarashi博士(日本仙台东北大学)捐赠21在汉阳大学的动物设施中在特定的无病原体条件下繁殖。巴奇2−/−小鼠及其性别匹配的小白蚁被使用。CD45.1,拉格2−/−、TCRβ−/−并从杰克逊实验室获得μMT(B细胞缺陷)小鼠。所有程序均经动物保护和使用机构委员会批准,所有动物实验均严格按照准则和条例进行。

组织病理学检查

用标准组织病理学方法对小鼠肾脏组织进行检查。26...为了获得病理组织学评分,每只老鼠都有50多个肾小球被一名经过认证的病理学家单独检查,他对样本基因型视而不见。

荧光显微镜

测定小鼠肾脏和脾脏。死后用荧光免疫组织化学方法描述27...冷冻切片用抗B 220-异生氰素(EBioscience)、抗GL7-FITC(BD生物科学)、抗IgG-生物素(Sigma-Aldrich)和抗IgM-生物素(南方生物技术)抗体和链霉亲和素(STZ)的适当组合染色。在X 200放大率下计数GCS,用ImageJ软件(NIH)对肾小球Ig沉积进行平均荧光强度评分。

骨髓重建

拉格2−/−小鼠给予全身γ辐射500 rad,静脉注射5×10。63:1混合细胞巴奇2−/−或野生型(WT)TCRβ−/−或μMT BM细胞。他们用抗生素(Baytril)治疗2周,并进行检测。体外移植后10-15周。

Treg细胞重建

CD4+CD 25用MACS柱(Miltenyi Biotec)从WT脾中分离纯度>98%的Treg细胞,其次为FACSaria III(BD生物科学)。Treg细胞被静脉注射到大约8周龄。巴奇2−/小鼠2-3×106细胞/小鼠及体外4或8周后。

逆转录病毒介导的细胞转移

pat-E逆转录病毒包装细胞与MigR 1-bach2共转染。28或收集空载体、pcl-eco和含有逆转录病毒的培养上清液,如所述。29...CD45.1+CD4+CD 45.1 T细胞+用EasySep(Stemcell)阴性小鼠,用逆转录病毒上清液预激活和自旋感染小鼠。绿色荧光蛋白+细胞被分类并静脉转移到TCRβ−/−5×10小鼠5细胞/老鼠。

流式细胞术

制备脾单细胞悬液,用流式细胞仪测定。30...所用的氟铬结合单克隆抗体列于补充表中。1...用20 ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)和1μM-离体霉素(Sigma-Aldrich)刺激脾细胞,检测细胞因子的表达。

ELISA和ELISPOT法

测定血清抗dsdna和抗毒蕈碱受体3(M3r)抗体效价。26...用从阿尔法诊断国际公司购买的ELISA试剂盒测定总IgG和总IgM抗体浓度。为测定4-羟基-3-硝基苯乙酰基(NP)特异性抗体,用10μg/ml NP-BSA(BiosearchTechnologies)包覆平板,用标准ELISA法进行处理。ELISPOT法测定抗dsdna和抗m3rAb分泌细胞。26.

定量RT-PCR

提取细胞总RNA,用定量RT-PCR法检测细胞总RNA含量。28...用周期阈值法(∆、CT)测定β水平,并将其归一化为β-actin mRNA水平。在补充表中给出了所使用的引物序列。2.

RNA测序(RNAseq)与转录组分析

从CD 19中提取总RNA+Bach2基因敲除(KO)小鼠和WT小鼠B细胞。用TruSeq链mRNA LT样本预试剂盒(Illumina)制备cDNA文库,在NovaSeq 6000平台上用101 bp对读化学进行测序。使用FastQC对原始序列读取进行质量控制,然后用Trimmonatic进行读读修整。由此产生的高质量读取是通过HISAT 2映射到参考小鼠基因组(UCSCmm 10)上的。以RefSeq_2017_06_(12)为参照,用StringTie方法获得每个基因的读计数。为了生成分层聚类热图,计数数据用正则化的方法进行日志转换,并使用生物导体phatmap软件包检测差异表达的基因(Degs)。为了识别DEGS,我们使用DESeq 2,它基于负二项分布。在所有四个样本中,只有非零读计数的蛋白质编码基因被选择用于进一步的DEG分析(12545个保留的基因)。DEGS的标准定义为折叠变化(Fc)>2,并进行了调整。P数值<0.0531...为了不偏不倚地确定与转录相关的丰富途径,使用log对186条基于mSigdb(v6.2)的kegg通路进行了基因集富集分析(Gsea)。2fc作为排名指标。

荧光素酶分析

含人类2000 bp的报告结构ICOS利用PCR技术构建了转录起始位点上游的启动子,并将其克隆到pGL4b载体(Promega)中。将Jurkat T细胞与报告子和migr 1-bach2或空载体瞬时共转染,在pma和离子霉素存在或不存在的情况下培养,检测荧光素酶活性。28.

染色质免疫共沉淀定量PCR(芯片-qPCR)

转染Jurkat T细胞标记的bach2cDNA28,在PMA和离体霉素存在或不存在的情况下培养,并按所述方法进行检测。28...用抗旗标抗体(F 1804;Sigma-Aldrich)和对照IgG(SC-2027;Santa Cruz)沉淀染色质片段。在补充表中给出了所使用的引物序列。2.

结果

Bach2缺乏小鼠IgG转换自身抗体滴度升高

据报道,bach 2缺乏的小鼠在gc形成方面有缺陷,当受到外源抗原的攻击时,类开关抗体的产生减少。21...我们证实,Bach2的缺失会影响B细胞产生IgG开关抗体,这是由于T细胞依赖的诱导抗原免疫,甚至在体外存在适当的信号(补充图1)。1)。由于这些结果与以前的研究一样,是在急性免疫模型和体外环境下获得的,因此目前尚不清楚它们是否适用于稳定状态下产生的慢性自发免疫激活。为了澄清这一问题,我们检测了未治疗的Bach2缺乏小鼠20周后的抗体反应。虽然这些小鼠血清总IgM效价升高,但血清总IgG滴度明显降低,提示CSR受损(图1)。1A)。Bach2缺乏的小鼠在其脾脏中没有形成任何GCs,而大量GCs存在于它们的WT小分子中(图1)。1B)。与此结果一致,B 220+CD 138GL7+Fas+Bach2缺乏的脾脏中GcB细胞数量明显少于WT小鼠(见图)。1C)。因此,这些结果表明,在对故意免疫的反应中,年龄偏低的Bach2缺乏的小鼠在自发的GC形成中有缺陷,IgG开关抗体的产生减少。

图1:Bach2KO小鼠自身抗体和自身抗体分泌细胞的特征。
figure1

取大约20周龄的Bach2KO小鼠及其小白鼠的血清和脾脏。用ELISA法测定血清总IgM和IgG滴度。a,抗dsDNA IgM和IgGd,抗M3R IgM和IgGf...用荧光共聚焦显微镜检测脾脏GCs。b、流式细胞术检测胃癌B细胞c,伊莉斯波特用来计数分泌抗体的细胞。e, g...数据以任意单位(AU)和抗体分泌细胞(ASCs)中的平均值±SEMs表示,分别来自三个独立的实验。B 220门控FACS型面+CD 138-细胞是三个独立实验的代表。标尺,250μm.*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 by Student’s t-测试。

鉴于对自身免疫和主动免疫的不同分子要求32,33Bach2缺乏可能不影响抗自身抗原的抗体反应,与抗外源抗原的作用相同。为了解决这一可能性,我们检测了抗双链DNA抗体的效价和同工型,这是一种抗狼疮的特异性自身抗体。令人惊讶的是,它们所含的IgG开关抗体的滴度比它们的WT小分子要高得多。1D)。其折叠差异与抗dsDNA IgM效价相当。与此相一致的是,分泌抗dsDNA IgG的细胞和分泌抗dsDNA IgM的细胞在Bach2缺乏小鼠的脾脏中比在其WT小白鼠中更丰富。1E)。我们还发现了另一种抗M3R蛋白的自身抗体。34抗dsDNA抗体在CSR的分布和分泌细胞的组织分布上表现为抗dsDNA抗体(图1)。1F,g)。因此,这些结果表明,Bach2缺乏以不依赖GC的方式刺激IgG转换的自身抗体分泌细胞的产生,这种活动在故意免疫的情况下不发生。

Bach2缺乏小鼠以不依赖Treg细胞的方式表现狼疮性肾炎的组织病理学表现

Anas,特别是抗dsDNA IgG,以免疫复合物的形式存在于肾小球内,导致Ⅲ型超敏性肾小球肾炎。为了确定这个过程是否发生在Bach2缺乏的老年小鼠身上,我们对他们的肾脏进行了组织病理学检查。正如预期的那样,IgG和IgM在Bach2缺乏小鼠的肾小球中沉积的数量比WT对照组多(图2所示)。2A,b)。Bach2缺乏的小鼠也有升高的组织学指标的狼疮性肾炎,以他们的高细胞评分和增殖肾小球百分比(图一)。2C,d)。因此,在Bach2缺乏的小鼠中富集的IgG自身抗体似乎足以驱动狼疮性肾炎。

图2:狼疮性肾炎的组织病理学表现及Treg重建对Bach2KO小鼠的影响。
figure2

ad用组织病理学方法对大约20周龄Bach2KO小鼠的肾脏和它们的WT小白鼠的肾脏进行了观察。抗鼠IgM抗体、IgG抗体及平均荧光强度(MFI)染色的典型免疫组化图像a, b...标度棒,50μm.周期性酸-希夫染色及组织病理学指标c, d. eg正常同基因Foxp 3静脉注射Bach2KO和WT小鼠+Treg细胞或PBS作为车辆控制。Foxp 3+CD4+输注8周后检测脾细胞中的细胞。e...在指定的时间采集受体的血清,用ELISA法进行检测。f...所有图形显示为±SEMs,符号代表单个小鼠的值。用共聚焦荧光显微镜观察抗-IgM或抗-IgG抗体染色的肾脏切片,显示为平均±SEM MFI。g. *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 by Student’s t-测试。NS,没什么意义。

除了作为B细胞特异性的调节功能外,bach 2还以细胞自主的方式稳定foxp 3。+Treg细胞。事实上,我们观察到Treg细胞在CD4中所占的比例+Bach2缺乏的小鼠T细胞明显减少。为了确定狼疮诱导的自身免疫在Bach2缺乏小鼠中是否仅仅是由于这种Treg细胞缺乏,我们过继地将正常的Treg细胞转移到Bach2KO小鼠中,并能够部分但显著地恢复其Treg细胞的数量(图一)。2E)。从Treg细胞受体获得的Treg细胞对常规T细胞的增殖抑制作用与从PBS受体中获得的细胞一样有效(补充图1)。2A)。此外,PBS-注入的Bach2KO小鼠的肺部炎症在Treg细胞灌流小鼠中也有部分减轻(附图)。2B),证实转移的Treg细胞功能正常。然而,在输注后4周和8周,Treg细胞受体和车辆受体的血清抗dsDNA IgM和IgG抗体水平没有显著差异(图1)。2F肾沉积IgM和IgG也未受影响(图1)。2G)。提示Bach2缺乏症的IgG自身抗体介导的病理并非单纯由于Treg细胞缺乏所致。

Bach2缺陷细胞与WT B细胞转录组的差异

为了鉴定bach2缺陷B细胞EF激活的基因和途径,我们对脾CD 19进行了RNAseq分析。+Bach2KO和WT小鼠在20周龄时的B细胞。这些结果揭示了两种细胞类型的基因表达模式不同。根据我们建立的DEG标准,共有234个基因差异表达,其中122个基因上调,112个基因下调。3A,b)。升华Prdm 1CEBPB以及对.的下调艾达,这是以前知道的21,35,验证了用于获取RNAseq数据的细胞的状态。有趣的是,与B细胞GC限制有关的基因(RGS 13和S1PR2)36,37下调,而与B细胞GC释放有关的基因(S1pr3)37被放大(图1.3B,e),提示Bach2在GC形成中具有B细胞自治功能。表示的结果RGS 16,另一种与B细胞的GC限制有关的基因,Bach2的缺失并没有改变,这表明RGS 13它依赖于Bach 2的功能,而不是改变GC形成的结果。

图3:Bach2缺乏的B细胞和对照B细胞的转录组分析。
figure3

aBach2KO和WT B细胞基因表达热图的变化。bBach2KO与WT B细胞基因表达变化的火山图。与KEGG通路有关的基因如表所示。cdSLE KEGG通路基因的热图和富集图。e定量RT-PCR验证RNAseq数据。图是两个独立实验的代表。*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 by Student’s t-测试。

接下来,我们在186条KEGG通路中确定了丰富的途径,以确定那些专门指导Bach2缺乏B细胞生理的途径。令人惊讶的是,具有特殊免疫意义的不同富集途径包括“系统性红斑狼疮的KEGG”(调整后)。P=0.046。3C,d)。提示Bach2缺乏的B细胞比WT B细胞具有更高的SLE相关基因激活。

bach 2的B细胞特异性缺失足以损害gc B细胞的发育,但不影响ef Ab的应答。

我们询问Bach2KO小鼠IgG自身抗体的不依赖于GC的产生是否源于B细胞自主机制。为了解决这个问题,我们将μmt bm细胞和bach2kobm细胞混合在一起,生成bm嵌合小鼠。拉格2−/−小鼠(以下简称B-KO)并对其进行检测。体外在重建后15周。μMT BM细胞与WT BM细胞的混合物作为对照(以下简称B-WT)。与KO小鼠相似,B-KO小鼠CD 19的比例和数量也有所减少。+B细胞和GC B细胞。4A,b)。然而,与KO小鼠不同的是,B-KO小鼠CD 19的比例并不高。罗氏CD 138+血浆细胞比他们的B-WT细胞(图1)。4C)。与此结果一致的是,B-KO小鼠血清总抗体和dsDNA特异性IgM抗体滴度没有升高,IgG抗体滴度明显降低(图一)。4D,e)。分泌IgM和IgG抗dsDNA抗体的细胞在B-KO小鼠的脾脏中也少于B-WT小鼠(见图)。4F)。这些结果表明,Bach2的B细胞内源性丢失足以导致B淋巴细胞减少和GC B细胞发育受损,但不足以驱动EF Ab的产生。

图4:Bach2的B细胞自治功能。
figure4

拉格2−/−用μMT BM细胞加Bach2KO或WT BM细胞重组小鼠产生B-KO和B-WT嵌合小鼠。骨髓重建15周后,取受体血清和脾细胞,用流式细胞仪进行检测。ac、ELISAd, e伊丽莎白f...基于CD 19的FACS配置文件+CD 138-细胞和活淋巴细胞被用来计数Fas。+GL7+胃癌B细胞与CD 19-CD 138+血浆细胞b, c...所显示的数据来自三个独立的实验。ae或者是两个独立实验的代表f并显示为平均值±SEMs,符号表示单个小鼠的值。*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 by Student’s t-测试。

bach 2的T细胞特异性缺失诱导CD4+T细胞自发分化为Tefh细胞

由于上述数据暗示Bach2缺乏的B细胞产生IgG自身抗体需要Bach 2的非B细胞内源性丢失,因此我们扩展了我们的实验,以探讨Bach2缺乏是否以细胞自主的方式诱导Tefh细胞的自发发育。为此,我们制作了另一种混合BM嵌合小鼠TCRβ−/−在图中用BM细胞代替μMT BM细胞。4并测定重建后10周左右自发产生的Th亚群。不出所料,嵌合体老鼠与TCRβ−/−BM和Bach2KOBM细胞(简称T-KO)所含Th2和Th1细胞比例较高,Treg细胞比例较低。TCRβ−/BM和WT细胞(称为T-WT)(图)。5A,b)。Th17细胞在两种类型的小鼠中几乎缺失(数据未显示)。在T-KO小鼠中,Foxp 3的比例+CD4细胞+CXCR 5+代表滤泡调节性T细胞(TFR)的细胞也减少了,而CD4细胞则减少了。+CXCR 5+BCL 6+Tfh细胞没有明显改变,导致Tfh细胞与TFR细胞的比例增加(见图)。5C,d)。此外,T-KO小鼠中CD4的比例较高。+CD62LCD 44PSGL 1罗氏细胞比T-WT小鼠(图1)。5E)。年老的KO小鼠与WT小鼠相比,同一表型细胞的比例也有所增加,而且这部分细胞中只含有两种CXCR 4。+细胞与CXCR 5+细胞(图1.5F)。重要的是,CXCR 4的百分比+KO小鼠和CXCR 5组细胞数均显著增加。+同一部位的细胞未发生改变。这些数据表明CD4细胞的比例+CD62L-CD 44PSGL 1罗氏表型包括Tefh和Tfh细胞,T-KO小鼠的Tefh细胞比例高于T-WT小鼠。为支持这一发现,该部分中的细胞并不是IL-4或IFN-γ的主要来源,与Th2和Th1细胞不同(图1)。5G,h)。IL-21在任何组分中均未检测到表达(未显示)。有趣的是,CD4+CD62LCD 44PSGL 1罗氏T-KO小鼠细胞部分表达ICOS高于T-WT小鼠的水平(图1)。5I)。最后,我们发现在T-KO小鼠中,GC B细胞和IgG抗dsDNA抗体明显升高。5J,k)。这些结果表明,bach 2的缺失有利于CD4的自发分化。+T细胞以细胞自主的方式进入Tfh和Tefh细胞,分别通过GC介导和EF途径增强抗体反应。

图5:bach2的t单元自治功能。
figure5

拉格2−/−小鼠TCRβ−/−BM细胞和Bach2KO或WT BM细胞产生T-KO和T-WT嵌合小鼠。骨髓重建后约10周,取受体脾细胞和血清,用流式细胞仪进行检测。aegj和ELISAk分别。用流式细胞仪检测了约20周龄Bach2KO小鼠的脾细胞及其WT小白鼠的脾细胞。f...具有代表性的CD4门控FACS简介+ a, bd,CD4+CXCR 5+ c,CD4+CD62L eh,CD4+CD62LCD 44PSGL 1罗氏 i,以及B 220+ j都显示出来了。数据代表三个以上的独立实验,并显示为手段±SEMs,有或没有符号代表单个小鼠的价值。AUS,任意单位;CTL,阴性对照染色。*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 by Student’s t-测试。

Bach 2压制ICOSCD4转录+T细胞

上述数据使我们推测,Bach2是调节Tefh细胞发育途径的因子的抑制剂。我们主要研究的是作为调节因子的共刺激分子icos,因为icos是tefh细胞发育所必需的。10,我们注意到类似母马的序列是潜在的bach2结合位点−1891到−1899和−98到−108 bp的上游。ICOS转录起始位点硅中分析。这些序列与规范MAR序列的同源性>77%。事实上,我们发现当通过tcr和cd28刺激时,bach2缺乏的CD4。+T细胞产生更高水平的ICOSmrna和细胞表面icos比对照CD4更好。+T细胞(图1.6a,b)。C-Maf是Icos通路中的下游信号分子,在Bach2KO细胞中也比WT细胞丰富。相反,CD4+表达Bach2逆转录病毒的T细胞可下调Icos在细胞表面和mRNA水平上的表达。6C)。为了证实bach 2在体内的这一功能,我们将cd4进行了转导。+携带bach2或空载体的T细胞表达逆转录病毒,并过继地将这些细胞转移到TCRβ−/−老鼠。CD4+表达Bach2的逆转录病毒介导的T细胞表面Icos水平明显低于空载体介导的T细胞。6d)。这些结果揭示了Bach2和Icos之间的负相关关系。

图6:Bach2抑制Icos转录。
figure6

a, b脾CD4+用定量RT-PCR法检测bach2ko和WT小鼠的T细胞。a和FACSb. c, dCD4+用流式细胞术(FACS)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测bach 2型或空载体型逆转录病毒(Rv)感染的T细胞。c转移到TCRβ/−小鼠,10天后进行FACS分析d...CD4门控FACS简介+细胞显示。e将pGL4b-hICOS报告子与MigR1-Bach2或空载体共转染Jurkat T细胞,经PMA和离子霉素刺激后,用荧光素酶活性测定。f将pcDNA3-2×标志-Bach2载体转染Jurkat T细胞,在PMA和离子霉素(P/I)存在或不存在的情况下孵育,芯片-qPCR检测。所有的数据都代表了三个独立的实验。*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 by Student’s t-测试。

以检验bach 2绑定到ICOS启动子和转录抑制,我们用含有2000 bp的人的报告结构进行荧光素酶报告试验。ICOS转录起始点上游的启动子。Bach 2的强制表达降低了荧光素酶的表达,说明Bach 2抑制了荧光素酶的活化。ICOS启动子(如图所示)6E)。这一结果支持了bach2结合位点存在于2000 bp区域的观点。ICOS转录起始点在芯片-qPCR分析中,交叉连接染色质与Abs免疫共沉淀标记bach 2,而不富集于被刺激细胞中含有−1891至−1899母马样序列的基因组区,而未富集−98至−108区。6f)。这个结果显示bach 2与ICOS启动子,但不是近端。

讨论

我们在此证明,Bach2缺乏对Ab反应的影响因免疫环境而异。巴奇2−/−小鼠在稳态和故意免疫时,在GC形成和全IgG生成方面存在缺陷。然而,尽管缺乏GCs,这些小鼠产生的IgG自身抗体水平增加,伴随着类似狼疮性肾炎的组织病理学表现,不依赖于Treg细胞缺乏。GC形成的缺陷是B细胞自主的,这一效应不足以诱导切换后血浆细胞EF的形成。另一方面,bach 2的T细胞特异性缺失有利于tefh细胞的自发发育,这一作用与bach 2作为抑癌因子的作用有关。ICOS...综上所述,我们的结果表明,bach2缺陷的自身反应性B细胞在gc外经历IgG csr,这一过程需要bach2缺乏的CD4。+优先分化为体液效应的T细胞。因此,bach 2在B细胞和同源CD4中的细胞自主活动似乎具有一定的意义。+T细胞需要保持自我耐受性。

令人费解的是,Bach2缺乏的自反应B细胞可以通过EF途径进行CSR,尽管Bach2是CSR和GC形成所必需的。这一发现可能意味着Bach 2对于EF位点的CSR是可有可无的,在GC反应中是必不可少的。我们怀疑这种矛盾至少部分源于EF和GC反应的不同动力学。GcB细胞在光带和暗区之间反复循环,以实现csr和其他成熟过程,并最终作为分泌高亲和力类开关abb的浆细胞退出gc。8,38...因此,必须有一种机制,为AID的作用提供时间窗,防止未成熟的浆细胞在GC反应中意外退出。Bach 2似乎通过抑制blimp-1的表达来提供这种机制,而不是直接抑制。艾达22...相反,由于EF B细胞不能在区域间穿梭并比GC B细胞更快地分化为浆细胞,因此在EF反应期间执行CSR可能不需要Bach 2。

正常的自我反应B细胞通过自我耐受机制,包括阴性选择、抗体赎回和受体重新编辑,倾向于在GCs中丧失自身的反应性。39,40,41...因此,自我反应B细胞逃避GC检查点的某种过程是维持自身免疫的需要。我们发现Bach2缺乏的自反应B细胞不仅不能形成GCs,而且还能够通过EF途径进化为致病浆细胞,这表明Bach2的下调是自身反应B细胞超越GC检查点并保持自身反应性的一种机制。

我们的发现,Bach 2的细胞自主活动不足以允许IgG自身抗体分泌的EF浆细胞的积累,强调了Bach 2活性在B细胞帮助中的重要性。事实上,我们发现bach 2的T细胞特异性消融可以诱导CD4。+T细胞能自发分化为Tefh细胞和Th2细胞,提高Tfh与TFR细胞的比例。我们推测Tefh细胞是促进Bach2缺陷的自身反应B细胞成熟的最重要的子集,其原因有以下几个方面。首先,由于Bach2缺乏的小鼠在GC形成上存在B细胞自主缺陷,Tfh细胞不起作用。第二,Th2的发育对于IgG(偶IgG)来说是可有可无的。1)产生,在Th2缺乏的小鼠中,抗体反应的位置和IgG亚型的正常产生。42...这些原因共同说明了Tefh细胞在Bach2缺乏小鼠体液自身免疫反应中的重要性。在这方面,值得注意的是,我们首次确定了Bach2作为Tefh细胞的调节因子。

我们发现Bach2缺乏对诱导免疫和自身免疫有不同的影响。从IgG抗体的产生来看,后者似乎相对不受Bach2的影响。这一发现可能意味着T细胞依赖于主动免疫的抗体反应比自身抗体的产生更依赖于GC反应,EF事件在自身免疫中所起的作用比在主动免疫中的作用更重要。以前的报告提供了证据,表明这两个程序的要求不同。一个例子是干扰素γR在自发自身免疫中是GC形成所必需的,而在主动免疫中则不需要。32,33...我们的数据提供了这种不同需求的另一个例子,后者需要Bach2,而前者不需要。

Bach 2在不同谱系分岔点的细胞命运选择中起着至关重要的作用。在没有Bach 2的情况下,普通淋巴祖细胞和共同髓系祖细胞分别产生髓系细胞,而不是B细胞和红血球细胞。43,44...在前B细胞检查点,Bach2缺陷的前B细胞被积极选择,而对照的预B细胞则面临相反的命运。45...我们的证据表明EF反应优于GC反应,指出了另一个分岔点,其中Bach 2在细胞命运选择中起着重要作用。

Bach2如何实现这一效果?其潜在机制尚不清楚,但我们对与GC保留和释放相关的基因的转录组分析可能提供了答案的线索之一。G蛋白信号转导调节因子(RGS 13和RGS 16)在胃癌B细胞中高表达,并加速了与CXCR 4和CXCR 5连接的GαGTPase活性的内在速率,导致B细胞在GC中的滞留时间延长。37,46,47...这种迁移的停止可能会稳定GCs,从而为致病自身抗体的产生提供一个最佳的微环境。此外,一个失去功能的突变RGS 13可促进EF血浆细胞的产生,并干扰正常的gcb基因表达程序。48...这些结果与我们的数据一致,表明Rgs 13在Bach2KOB细胞中被下调。除Rgs 13外,这些细胞中鞘氨醇1磷酸受体(S1PR)3与S1PR2比值的升高可能是其GC形成缺陷的原因之一,因为已知S1PR3和S1PR2分别在B细胞的GC传播和限制中起作用。37...因此,我们认为在激活的B细胞中早期缺乏Bach2会导致Rgs 13的丢失和S1PR3/S1PR2比值的升高,最终导致GC的形成失败。

总之,我们在此证明Bach2是小鼠SLE的遗传危险等位基因。自身反应性Bach2缺陷B细胞逃离GC检查点进行自我耐受,并与Bach2缺陷Th细胞协同在EF位点产生IgG类转换型自身抗体。因此,我们的研究提供了关于系统性红斑狼疮的体液自身免疫起源的见解。




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