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巴西腹泻儿童肠道病毒分析首次鉴定哺乳动物3型原病毒

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发表时间:2019-12-09 17:11作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

巴西腹泻儿童肠道病毒分析首次鉴定哺乳动物3型原病毒

摘要

腹泻仍然是儿童死亡的最常见原因之一。尽管许多研究已经调查了全球各地肠道病原体的流行情况,但仍有一些腹泻病例无法解释。一些尚未确定的病毒制剂可能与这些胃肠炎病例有关。利用病毒基因组学技术,我们筛选了251例与常见病原体无关的0.5至2.5岁儿童急性腹泻粪便样本。这些儿童生活在农村地区,与猪、牛和蝙蝠等动物有不同程度的接触。在这里,我们报告了一个哺乳动物同源病毒(MRV)3型的完整基因组,表示为-151/BR,在托坎廷斯州(巴西北部)的一名女童身上检测到。巴西to-151/BR株根据S1系统发育分类为MRV-3,与猪亚洲株有密切的亲缘关系。系统发育分析表明,其他片段与不同地理位置和宿主(包括人类和蝙蝠)的MRV-3s更相似,突出了基因组重组和缺乏宿主特异性障碍。这是第一次报告的MRV-3在南美洲和一个假设的沉默的长期循环这种病毒在巴西已经提出。

导言

MRV是一种无包膜病毒,其基因组大小约为23,500个碱基对,包含10个不同大小的dsRNA片段:3个大片段(L1、L2和L3)、中等片段(M1、M2和M3)和小片段(S1、S2、S3和S4)。直链病毒属正向病毒病毒科的。1950年首次报告哺乳动物正向病毒(MRVS)感染。1...呼吸道和胃肠道是脊椎动物MRV感染的常见途径。基于诱导细胞融合和合胞体形成的能力2,3原病毒可以进一步分为两个亚组,融合基因和非融合基因。MRV的成员进一步分为四种血清型(1型lang、2型jones、3型Diliing和4型Ndelle),它们都是非杂化型。2,3,4.

MRV与胃肠道和呼吸道疾病有关,已从多种哺乳动物中分离出来,包括蝙蝠、水貂、猪和人类。5,6...在人类中,MRV感染通常会引起轻微的呼吸道和肠道感染,表现为高烧、腹泻和呕吐症状。7...然而,最近有报道称MRV与更严重的疾病有关,包括肺炎、脑炎和呼吸窘迫综合症。8,9.

在世界各地,包括马来西亚、印尼、香港、美国、加拿大及法国等地,人类均已发现mrv。8,9,10,11,12然而,拉丁美洲大陆尚未查明。3型MRV(MRV-3)是在美国分离出来的,其特征是引起儿童脑膜炎。12腹泻4...此外,最近从亚洲、美国和欧洲出现严重腹泻和呼吸道症状的仔猪中分离出mrv-3。5,6,13...在本研究中,我们首次报道了巴西MRV-3的检测和全基因组特征。从1例呕吐和腹泻患儿中分离到了MRV-3的近全基因组,并进行了进化分析。本研究具有创新原病毒基因组知识和理解的潜力,突出了其人畜共患病的潜力。

材料和方法

病人

这项研究是2010至2016年在巴西北部托坎廷斯州实施的监测计划的一部分,之前对患者的选择进行了详细描述。14,15,16,17,18...简单地说,在2010至2016年间共收集了251个粪便样本,并对肠道病原体(即轮状病毒和诺沃克病毒)、细菌(即,大肠杆菌沙门氏菌)、内孢子虫(Giardia sp.)和蠕虫,采用常规培养技术和商业酶免疫分析。除一名50岁个人外,0.5至2.5岁的病人在取样时患有急性胃肠炎。为了确定可能未被发现的肠道病毒,NGS技术被应用于所有251份样本,使用下面描述的方法。其中轮状病毒(n=112)、腺病毒(n=84)、诺沃克病毒(n=39)、经典星形细胞病毒(n=8)和sapovirus(n=8)在部分受试者中均有检出。该病人于2013年7月23日出生,是位于巴西托坎廷斯州的Araguaina农村地区的居民。病人被诊断为胃肠炎,并接受主要肠道病原体(轮状病毒,大肠杆菌,沙门氏菌SPP.贾第SP.使用传统的检测方法(即培养技术和商业酶免疫分析法)。未检出常见肠道病原菌。因此,为了鉴定与症状学相关的病原体,我们采用了NGS技术。

伦理认可

在涉及人类参与者的研究中执行的所有程序都符合机构和(或)国家研究委员会的道德标准以及1964年“赫尔辛基宣言”及其后来的修正或可比的道德标准。从参与研究的儿童的所有父母或监护人那里获得了成人个人和所有监护人的知情同意。道德委员会批准了圣保罗大学(CAAE:53153916.7.0000.0065)和帕尔马斯-ULBRA大学(CAAE:53153916.7.3007.5516)。

样品处理

用于执行深度测序的协议是几个通常应用于病毒元组学和/或病毒发现的协议的组合,如19...将50 mg人粪样品稀释到5 0 0μL的Hanks缓冲盐溶液中,加入含裂解基质C(MP生物制剂,Santa Ana,CA,USA)的抗冲击管2 mL,在FastPrep-2 4.5 G均化器(MP生物制剂,美国)中进行匀浆。均质样品在12,000×离心条件下离心。g上清液经0.45μm滤池(美国,美国)过滤10 min,去除真核细胞大小和细菌大小的颗粒。在滤液中加入约100μL,约相当于试管体积的四分之一,加入系统生物科学、帕洛阿尔托、CA、美国等病毒沉淀液,然后在4°C温育24h后,离心至10,000×10,000×10,000。g4°C离心30 min后,上清液(~350μL)被丢弃。该颗粒含有丰富的病毒颗粒,用核酸酶混合酶(Turbo DNase和RNase Cocktail混合酶-Thermo Fischer Science,Waltham,美国;基线-零DNase-ecentre,Madison,WI,美国;Benzonase-Darmstadt,Darmstadt,德国,Darmstadt;RQ1 RNase-Free DNase和RNase A溶液-Promega,Madison,WI,USA)处理,消化无保护的核酸。经37°C孵育2h后,用ZR&ZR-96病毒DNA/RNA试剂盒(Zymo Research,Irvine,CA,USA)提取病毒核酸。用AMV逆转录试剂(Promega,Madison,WI,USA)进行cDNA合成。利用DNA聚合酶I大(Klenow)片段(Promega)进行第二链cDNA合成。随后,用NextEra XT样品制备试剂盒(Illumina,San Diego,CA,USA)构建DNA文库,用双条形码进行鉴定。在尺寸范围上,采用Pippin Prep(Sage Science,Inc.,Bisly,MA,USA)选择300 bp插入(范围为200~400 bp)。利用Hi-Seq对图书馆进行了深度测序。2500 Sequencer(伊利米纳,加利福尼亚州,美国),126 bp结束。生物信息学分析是根据邓先前描述的协议进行的。等人.20...这些序列包括轮状病毒序列,以及肠道病毒、人、真菌、细菌等,核苷酸同源性为95%或更低。利用BLASTx分析得到的单个片段和结合体,以寻找与GenBank中病毒蛋白的相似性。并与GenBank非冗余核苷酸和蛋白质数据库(BLASTn和BLASTx)进行比较。病毒鉴定后,用参考模板序列对Geneious R9软件进行全基因组定位(BimattersLtd L2,18 Short Street Auckland,1010,新西兰)。在BLASTx搜索的基础上,选择MRV基因组进行进一步分析。

比对与系统发育分析

这些基因组是用集群X软件对齐的。21...随后,利用极大似然法构建了系统发育树,并利用Shimodaira-Hasegawa检验对支路支持值进行了评估。所有的树都是用FastTree软件推断出来的。22并根据jModeltest软件中实现的似然比检验(LRT),选择了GTR模型和伽马分布。23...利用1000个拷贝进行分析。在MegaX软件的相似矩阵工具中进行了相似性分析。24.

本研究确定的核苷酸序列已在GenBank中保存,登录号为MN 022930-MN 022939。

结果和讨论

几乎完全分段的基因组,新的MRV-3株至-151/BR如图所示。1...进行了更深入的分子表征,突出了与其他菌株相比的一些特点.对该菌株的10个片段(MRV-1LANG(T1L)、MRV-2Jones(T2J)和MRV-3 DING(T3D))进行了配对核苷酸同源性比较。在S2、S3、M1、M3和L2片段中,to-151/BR菌株与T1L菌株更为相似,而S1和M2片段中的T1L菌株与T3D菌株更接近(图1)。1)。此外,在S4、L1和L3片段中,to-151/BR株与T1L和T3D株具有相同的核苷酸同源性。

图1
figure1

MRV-3株片段基因组为-151/BR。彩色矩形表示MRV-3各基因组片段的编码区.每段两侧的数字表示编码区域的开始和结束。双头箭头上方的数字代表编码区域的氨基酸(AA)大小。暗线表示5‘和3’末端重复序列的大小。每个片段右侧的灰色盒表明,to-151/BR与MRV-1LANG(T1L)、MRV-2Jones(T2J)和MRV-3DING(T3D)的核苷酸同源性。

将MRV分为3种基因型(mrv-1、mrv-2和mrv-3),用s1片段进行基因分型。25...根据S1系统发育,巴西to-151/BR MRV-3株属于MRV 3系b系,与与猪腹泻相关的亚洲猪MRV-3S系密切相关。它与中国猪腹泻症状猪MRV-3 SC-A株(DQ 911244)的核苷酸同源性最高(95.7%)。1)。巴西to-151/br mrv-3菌株的其它片段L1、l3、m1、m3、s2、s3和s4与野生物种有关,包括猪、人、猫、鼠和蝙蝠(见表)。1).

表1巴西-151/BR MRV-3株每个基因片段核苷酸同源性最高。

由于以上核苷酸同源性分析不能提供进化相关性,我们也用最大似然方法进行了详细的系统发育分析(图1)。2、补充图。沙一中9)。系统发育分析证实了MRV-3基因组基因聚类的差异。这些数据反映了由重组引起的拓扑不一致模式。26...一项由意大利蝙蝠获得的mrv-1菌株进行的研究也报告了这一观察结果。5...巴西-151/BR株与GenBank中的其它MRV-3株在系统发育树上存在很大的差异,说明该病毒可能在巴西长期传播。然而,巴西MRV-3序列的缺乏仅限于得出任何可靠的结论.本研究还强调了MRV在人类和动物群体中保持沉默循环的能力。10,27...对不同哺乳动物种间MRV的监测可以大大提高人畜共患病策略的能力。

图2
figure2

巴西人至-151/BR MRV-3株S1全片段的系统发育树(用箭头表示)。该树是在jModeltest软件中使用最大似然方法GTR-G模型执行的,其自举次数为1000次。每个菌株的登录号、种类、分离物、国家和年份。不同的主机以不同的颜色突出显示。小写a,b和c代表三个不同的MRV-3谱系.

结果表明,to-151/BR株可能是由不同来源的MRV-3S的多重重排事件所引起的。由于MRV基因组的分段,可以通过重组得到不同片段的组合,从而形成新的基因型。有几项研究报告了MRV的重组。5,7,13,25,26...其他成员病毒科轮状病毒等家族也有这种特殊的进化途径。28...重要的人类和动物病原体,如甲型流感病毒和轮状病毒A株的重新插入能力,对其持续的进化和对全球健康的影响具有重要意义。2,8,10,26,27,29.

由于缺乏宿主特异性,mrvs感染是人畜共患病的一个主要问题,因为我们都会在人和动物宿主中传播感染。27,30...在目前的研究中,我们进行了系统发育分析。我们的研究建立了巴西至-151/BR MRV-3株与从不同物种(主要是从猪中)分离的菌株之间的密切关系,强调了人畜共患病的高可能性。根据目前的研究,我们预测在人类宿主传播之前,可能已经在动物宿主中发生了基因组重组。然而,此时我们无法确定传播事件的确切方向,也无法明确确定人类发现的MRV-3毒株的来源。有必要进行进一步的研究,以便有信心地解决这两个问题。值得注意的是,在目前的研究中报告并分析了MRV-3株,在一名住在农村地区的儿童中检测到。在农村人口中,种间传播倾向较高。27,30...农村人口种间传播的高倾向是由于居民卫生条件差、接近动物和饮用水的共同来源。孩子们与宠物有着密切的互动关系,但他们的卫生习惯有限。因此,与成人相比,儿童更容易受到感染。6,9,17,18,31.

与报道相矛盾的报道未能明确确定MRV-3的病原体作用。7,8,10,12,25,31,32,33...MRV-3感染可能是无症状或有症状的。7,8,10,12,31,33...此外,与人和动物中的其他病原体一起感染MRV-3使复杂性更加复杂.在我们的研究中,病人观察到肠胃炎症状为-151/BR,可能与一种(或多种)肠道病毒(即轮状病毒A、腺病毒和诺维病毒)有关,这些病毒是在粪便样本中检测到的(见图中的读数数)。S10)14,15,17,18...此外,粪便中亦有mrv-3的存在,这可能是由于进食受感染的猪肉所致。34...尽管病毒分析是一个强大的工具32由于缺乏病人的医疗记录或可能与动物接触或食用受污染食物的流行病学背景资料,无法准确地进行这种检查。目前的研究也未能建立起患者与病毒之间的流行病学联系。

总之,本研究采用了NGS分析方法,以确定从南美洲获得的人类标本中的MRV-3感染。目前的研究有助于建立MRV的地理分布和分子多样性数据库。为了了解MRV的生态学、流行病学和进化,需要结合功能研究生成额外的序列数据。




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