受感染的狗是人畜共患病内脏利什曼病的主要宿主。利什曼病是一种广泛存在的寄生虫病。婴儿利什曼原虫...因此，需要控制犬的感染，以减少人类病例的发生。狗的疾病结果取决于寄生虫毒力和免疫系统效能之间的平衡。因此，早期反应的知识可以为诊断和随访提供相关信息。在我们的研究中，20只比格犬被静脉注射10只。8新分离物幼铁线蕨接种后16周监测。感染动物的特异性抗体反应和临床演变变化很大。免疫荧光抗体试验(IFAT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)对检测感染状况有一定的帮助，但只有采用免疫荧光抗体检测(IFAT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)，特别是免疫印迹法(WB)才能早期诊断。用大量肽指纹图谱鉴定出显著抗原。在感染后10周，所有犬均识别伴蛋白HSP 60、32和30 KDa抗原。提示这些抗原可能对早期诊断有价值。晚期感染还表现出对HSP 83和HSP 70的反应性。疾病结局与ELISA或IFAT效价无明显关系。临床状态与对某些抗原的联合反应性之间的相关性，支持了它们在诊断和随访中的应用。

内脏利什曼病婴儿利什曼原虫 (=[医]柴胡)是一种致命的、除非经治疗的媒介传播的人畜共患病，流行于南美洲、南欧和亚洲地区。1,2,3...在北部地区(德国、美国和加拿大)，该疾病的地理分布有所增加，并报告了感染情况。4,5...人类感染的进展与无效的免疫系统有关，因此，这种疾病在儿童、老年人和因自身免疫性疾病、包括hiv感染在内的并发感染和医源性抑制(实体器官移植的接受者)反应受损的个人中更为常见。6,7,8...受感染的狗被认为是人畜共患病内脏利什曼病的主要宿主。2,9,10尽管其他东道主扮演着潜在的角色11,12,13,14...犬利什曼病是在不同年龄、品种和条件的狗身上发现的一种一级动物病理学，可引起全身疾病，包括皮肤和内脏。15...在流行地区，犬类感染非常频繁，发病率从5-8%到30%以上不等。16取决于所采用的分析技术和抽样方法。

目前还没有对人类内脏利什曼病进行免疫预防；已经确定了新的目标人群，如静脉注射毒品使用者。17化疗有重要的缺点1,2...鉴于这种疾病的复杂流行病学，综合控制必须包括减少犬类感染。幼铁线蕨因此，它们的传播潜力。然而，有效的控制受到犬抗-利什曼原虫疫苗18犬利什曼病化疗效果不佳19,20以及环境控制、减少沙蝇传播和猎杀狗只的可争论的影响。21,22,23...很可能，成功需要多种策略的结合，早期诊断系统将是识别新感染(和复发)动物的重要工具，最终目的是减少作为传染源的动物数量。24...认为临床上感染利什曼病的犬Th1(IFN-γ)不足，IL-10活性增强。25，这种情况导致免疫球蛋白的过量产生，这是犬利什曼病的一个关键特征。因此，各种技术(IFAT、ELISA、westernblotting-WB-)具有不同程度的敏感性和特异性。26,27,28，已被用于诊断犬的感染。此外，还检测了几种重组抗原。29,30,31,32.

大部分横断面研究的主要缺点是与其他常同时感染犬只的病原体有潜在的交叉反应。巴贝西亚, 埃利希亚, 新孢子虫, 弓形虫)33,34以及缺乏关于接种后实际时间的信息。这些局限性可以通过分析实验感染的动物来确定早期感染标记物来克服，潜在的是WB的反应性模式在临床随访中的价值。发表的对实验感染犬的纵向研究幼铁线蕨由于不同的感染剂量和接种途径，实验犬的年龄和品种很难与之相比。35...其中大多数都涉及到数量较少的动物。36,37,38,39,40或者实验不包括WB测定26,41,42,43.

在一个不相关的项目中，有相当数量的狗被实验感染幼铁线蕨，在感染过程中连续采集血清标本。测定动物的体液反应(IFAT、ELISA、WB)，以确定早期感染标志物、免疫检测模式、诊断技术与动物临床状况的相关性。

IFAT和ELISA检测血清抗体应答

雌性比格犬(10-11月龄)接种10只。8.的散光体幼铁线蕨刚从自然感染的狗身上获得的(n=20)或作为未感染的对照动物饲养(n=4)。狗被安置在控制的条件下，排除了不受欢迎的节肢动物传播的感染，每天观察，并进行定期的临床探索和生化及免疫学评估，在接种后16周。未受感染的对照犬在实验过程中没有表现出任何特异性抗体反应。为狗只接种疫苗幼铁线蕨感染5周后，5只动物的IFAT效价随感染时间的增加而增加(≥1/80)(图1/80)。15周后(10周)，接种的犬(20只中18只)为IFAT+，12只为WPI，所有动物均有≥1/160滴度。免疫反应不均一，16周时免疫效价在1/320~1/2560之间。可溶性酶联免疫吸附法测定特异性应答利什曼原虫抗原(ELISAsla)2A)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。2B在12周前，所有感染动物均呈阳性。尽管存在个体差异，但两种ELISA检测结果之间有很强的相关性(r=0.9376，P < 0.0001). IFAT values did correlate with ELISAp (r = 0.8632; P < 0.0001) and ELISAsla (r = 0.8487; P < 0.0001). ELISAp allowed an earlier diagnosis of 幼铁线蕨感染自5 WPI以来，检测到8只阳性动物，而IFAT和ELISAsla仅检出5只阳性动物。ELISAp在早期诊断中的优势更明显，因为13只狗是阳性的。对决伊法特动物5只，ELISAsla动物7只。相应地，Cohen的Kappa系数值也有一个π时间变化(表)。1)。结果表明，10周后ELISA与IFAT的一致性良好(κ=0.6 4)，但第一次抽样(5 WPI)由差到低(ELISAsla/IFAT，κ=0.2 0；ELISAp/IFAT，κ=0.4 4)。

血清抗-利什曼原虫实验感染的Beagle犬沿IFAT实验的反应。实心圆圈：感染犬的个体IFAT值(n=20)；空圈：未感染对照动物(n=4)。虚线：切断效价。

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Beagle犬感染Beagle犬个体反应的ELISA分析幼铁线蕨(实心圆)(n=20)和未感染对照动物(空圈)(n=4)。Y轴值：阳性对照动物的光密度百分比。虚线：截止值。(A)可溶性利什曼抗原(ELISAsla)酶联免疫吸附试验(ELISA)。(B)酶联免疫吸附试验(ELISAp)。感染后周：WPI。

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西方印迹模式的纵向研究

选择的狗，代表观察范围的临床表现，分析，以确定抗原识别模式在不同的接种时间(5，7，10和16 WPI)(图)。3)。尽管使用相同的感染剂量和狗的遗传背景相近，但在反应性和免疫显性抗原的识别强度上都存在着显著的个体差异。感染犬血清与mw抗原有广泛的反应性。钙...93、87、85、77、72、70、66、56、50、48、46、44、41.5、40、38、35、32、30、28、25.5、23.5、23、21.5、19.5、17和15 KDa。检测未感染动物血清时，反应微弱，以77 Da和>97 KDa为主(图1)。3，支持信息图。1).

变性还原条件(SDS-PAGE)电泳分离SLA的westernblot分析(SDS-PAGE)A)，7周(B)，10周(C感染后16周。4D)。条上的数字与实验犬的身份相符。#11.未受感染的控制动物。分子量标记。从膜上切出条子，展开和安装。培养的试纸条和发育条件是标准化的。右边的条带对应于蛋白质转移和分子量标记的控制，用酰胺黑染色。

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应用ImageJ软件对WB进行分析，可以定量(表示为DU或密度单位)的总反应性以及感染过程中单个抗原的时间历程识别(支持信息图)。2和3)。WB对犬利什曼病的早期检测非常敏感，因为在第5周，6只犬对SLA有反应(图1)。3A；支持信息图。3,A)。然而，个体识别变化很大，最显著的反应出现在狗#20和#7。两周后(7个WPI)结果与犬#20(9，292.9DU)的反应模式更复杂、反应强度更高相似(见图9，292.9DU)。3B；支持信息图。3,B)。到第10周(如图所示)。3C；支持信息图。3,C)所有动物，特别是早期反应犬(例如#7：23，920.7 DU)的反应性逐渐增加。一些狗在之前的样本(#5，#12，#13，#24)中表现出很少的反应，此时显示出对SLA的广泛认可。WB与16份WPI血清进行比较(见图)。三维空间；支持信息图。3,D)与自然慢性感染犬的血清相比较(未显示)。从10周开始，所有被感染的狗都对某些区域(30，32，特别是56 KDa)产生了特殊和显著的反应，到16周时，所有感染的狗也对41.5，66和85 KDa做出了反应(表)2)。因此，这些抗原可以被使用，如果不是与其他狗的病原体共享，用于诊断和跟踪。尽管进行了有限的分析，但狗的WB总反应性(DU)与ELISAp均有相关性(r=0.9132；P < 0.0001) and ELISAsla (r = 0.805; P < 0.0001) (r > 0.84; P < 0.0001) (Supporting Information Fig. 4).

二维电泳分离幼铁线蕨苏丹解放军(图1.4A)和血清对慢性感染动物的识别作用(图一)。4B)如图所示。4...通过质谱鉴定，筛选出与WB免疫显性抗原相对应的9个斑点。分离的蛋白质分别为1：热休克蛋白83(HSP 83)(Mr 73，939)，2：假定的甲基丙二酰辅酶(Mr 79，948)，3：HSP 70(先生69，981)，4：伴蛋白hsp 60(Mr 59，831)，5：延伸α因子(Mr 44，191)，6：烯醇化酶(Mr 47，095)，7：推测的HSP DNA.J(Mr 44，994)，8：推测的精氨酸激酶(AK)(Mr 42，363)，9：推测的谷胱甘肽过氧化物酶样(Mr 19，587)(支持信息表)。1).

(A)可溶性物的二维电泳分离利什曼原虫抗原(SLA)(B)慢性犬血清SLA的Western印迹(1/50)幼铁线蕨感染。两个2D凝胶并行运行：第一个(A)用考马斯兰染色；第二种转移到PVDF膜上进行westernblot(B)。左边的条带作为SLA和标记的转移控制。分子量标记：KDa；pH 3-11：pH梯度。圆圈：经质谱和指纹图谱鉴定的肽点。

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临床病程与抗体应答的关系

根据16周后动物的临床评分(CS)，观察犬的临床状况。利什曼原虫感染，与IFAT效价无关(支持信息图)。5)。临床状况与ELISA相关(ELISAsla/CS：r=0.6546；P=0.0017；ELISAP/CS：r=0.6614；P=0.0015)(佐证资料图。6)。CS与感染犬WB总反应性相关(r=0.879)；P=0.0091)(佐证资料图。7虽然这种关系不是线性的：在第16周CS最高的狗(#4：19，#13：19)的DU(>36，000 DU)有很大的不同。VS...分别为25，465.55 DU)(佐证信息图。3,D)。对免疫显性抗原的反应性分析表明，30 KDa和32 KDa与CS呈轻度相关(r=0.763)；P=0.0389，r=0.80；P分别=0.025)。但某些抗原的联合反应性表现出较高的相关性，特别是在16周考虑85+66-56+32+30 KDa抗原的DU时(r=0.9092)；P=0.005)(佐证资料图。8).

所有接种的犬均感染利什曼病，并形成与利什曼病相一致的临床症状和病变，并具有很强的抗利什曼病利什曼原虫特异性抗体应答这支持所使用的模型和实验设计，包括幼铁线蕨菌株、感染剂量、接种时间和接种途径。在实验犬利什曼病中，动物在感染过程中的个体变异，无论是在临床过程中还是在免疫反应上都是规律。26,40,41,42,43,44,45尽管实验犬的遗传背景相近。

IFAT被认为是临床诊断犬利什曼病的金标准技术。9,46并与ELISA法相比较，对诊断和随访目的进行了敏感性和特异性的检测。26,39,41,46,47...重组抗原(rK 39，rK 28)等不同酶联免疫吸附试验(ELISA)的诊断价值26,45,48和合成肽30，已在横断面和纵向研究中确定。结果表明，与IFAT相比，ELISA法具有更高的敏感性。47...在我们的情况下，室内IFAT和ELISA检测(elISAp和elisasla)在感染12周后都是充分的诊断程序，正如以前报告的那样。41...然而，对接种犬的随访显示，感染的早期阶段仅用ELISAp检测，该方法的敏感性平均大于标准ELISA和IFAT(7 WPI)的2.5倍。在我们的病例中，ELISAp比标准的ELISA和rK 39免疫层析试验对实验感染的狗(90-120天pi)的诊断更早。26,42,45...IFAT滴定法与ELISA法测定结果在10 WPI时符合较好(κ>0.6)，但不早，而ELISAsla和ELISAp当时的结果比较一致(κ=1.0)。此外，IFAT测试费时费力，需要熟练的人员和昂贵的设备。由于早期诊断对犬利什曼病的临床治疗具有优势，与标准的ELISA和IFAT相比，ELISAp可作为诊断犬利什曼病的方便选择。幼铁线蕨狗感染。

WB是一种高度敏感的诊断犬利什曼病的方法，可作为犬利什曼病的预后指标。49,50,51,52,53...在本研究中，WB的敏感性(感染10周后为100%)优于其他测试技术(IFAT、ELISAp、ELISAsla)，这证实了先前的结果。36,37,38...此外，WB比rtq-PCR(17 Wpi)更早熟(10 Wpi)。43.

在wb识别模式上，目前尚无全球共识。幼铁线蕨被感染的狗。WB条带在实验性感染中的发现36,37,38,39,54比自然感染的狗更简单39,51,52,53虽然，在这些情况下，不能排除与其他抗原共享病原体混合感染的可能性。我们研究的WB对85、66、56、41.5、32和30 KDa的免疫显性抗原的反应与实验感染的同一品种犬相似。36混合品种的动物37...WB在建立中的诊断价值幼铁线蕨感染，随访允许时间相关抗原识别的确定.在本实验条件下，动物间存在较大的差异，仅在感染10周后，所有接种犬对56 KDa抗原的反应性和对32和30 KDa抗原的反应性较不明显。与以前的报告相比，发现的特异性抗体的开发明显延迟是可能的。36,38，可能与不同的实验设计、寄生虫株和感染剂量、个体免疫反应和所采用的方法有关。质谱法允许鉴定幼铁线蕨感染过程中的抗原。三种免疫显性抗原是热休克蛋白(HSP 83、HSP 70和伴侣蛋白HSP 60)，它们的生物学功能鲜为人知。55,56虽然重要的免疫原利什曼原虫感染57...在啮齿动物模型中，HSP 83和HSP 70被认为是一种内脏利什曼病的标志物。58...这些hsp被认为是狗利什曼病的诊断抗原，尽管HSP 70显然与狗利什曼病有交叉反应。克鲁兹锥虫59,60这最终导致了共同疫区的非特异性结果。伴蛋白HSP 60对亚临床自然感染犬血清的诊断价值尚不清楚。53...因为，在我们的例子中，到了第10周幼铁线蕨Hsp 60、32 KDa和30 KDa抗原均被接种犬识别，它们的联合应用有助于犬感染的早期诊断。WB在许多诊断实验室中并没有被常规使用，但是这些抗原可以像人类利什曼病那样以斑点ELISA的形式使用。61...或者，表位定位可以构建重组嵌合蛋白。在横断面和有限的纵向研究中，其他蛋白质(pq 10，pq 20)也采用了这种方法，尽管基于多表位的ELISA法需要4-5个月的感染才能呈阳性。30,31...我们的研究结果，以及目前重组体的可用性利什曼原虫热休克蛋白56,62并对实验感染犬进行了连续血清样本的检测，以确定其在野外条件下的诊断价值。

IFAT滴定法作为一种可靠的监测临床进展的方法，在兽医实践中得到了广泛的应用。幼铁线蕨受感染的狗，包括化疗后的反应。我们的结果表明，与这一假设相反的是，IFAT与动物的临床状态(Cs)没有任何显著的相关性，因此它在疾病随访和治疗后监测中具有一定的价值。44,63应该重新考虑。然而，值得指出的是，IFAT的结果不是线性的，血清滴定在1/2560稀释时停止，而在ELISA中考虑实际OD值。酶联免疫吸附试验(ELISA)与动物临床状况的相关性优于IFAT，但相关性中等。(R)钙...0.65)。几种报告有相关的WB模式(IgG，IgG)1、IgG2)自然和实验感染犬的临床状况36,38,40,51,52,64一些抗原被认为是预后的标志。对免疫显性抗原(HSP 83、HSP 70、HSP 60、32 KDa和30 KDa)的联合反应性与临床疗效相关。这表明它们在诊断和临床随访中的潜在价值，并与犬利什曼病中发现的高球蛋白血症相一致。准确测定犬免疫球蛋白亚类的进一步研究65沿幼铁线蕨感染过程将阐明它们在疾病结局中的作用。实验犬利什曼病的研究结果是否也存在于不同犬种的自然感染、年龄和管理条件等方面，需要在野外条件下进一步研究。

婴儿利什曼原虫株

接种菌是一株新鲜的.幼铁线蕨从一只被自然感染的狗的脾脏中获得临床和血清学诊断(西班牙格拉纳达，奥斯卡)。安乐死后，脾脏被无菌切除，并被运送到我们的制冷设施。这个器官被切成小块。钙...5毫米3)，并在玻璃组织磨床(磷酸盐缓冲溶液5mL，pbs)中进行匀浆。悬浮液离心两次(50×g10分钟；1100×g，10 min，4°C)。用细胞裂解缓冲液(SDS 0.05%)处理细胞球粒30秒，再悬浮于PBS中，在改良Neubauer室计数。在无菌条件下进行冰凉分离，在4°C下保存散体，24h后接种狗，用已发表的动质体引物对分离物进行鉴定。66并通过PCR-ELISA技术克隆了196 bp的幼铁线蕨kDNA67...两项分析均证实该分离物为幼铁线蕨，暂定为McAn/ES/2016/Granada-UCM。

犬实验性感染幼铁线蕨以及后续行动

雌性比格犬(24只)是在Envigo(法国)4至5个月大时从Envigo获得的，它们被安置在兽医学院(马德里)(动物设施Nr ES 280790000091)。动物设施安装了蚊帐，防止沙蝇进入。定期完整的物理探索、生化、血液学和免疫学检查显示生理正常，IFAT试验阴性。幼铁线蕨...当动物达到10-11月龄时，随机选取20只动物进行静脉(头静脉)接种10只。8.的散光体幼铁线蕨/动物，给药1mL。四只动物作为未感染的对照犬被饲养。接种后，每天观察狗，每2周，称重，并接受兽医对实验设计视而不见的全面临床检查。取头静脉采血，外部实验室(实验室)进行常规免疫应答试验(IFAT)。(巴尔巴，马德里)。犬血清IFAT效价≥1/80呈阳性。于第16周对接种动物进行窝淋巴结取样和染色涂片(5~5 Grünwald-Giemsa)的光镜观察，评价接种动物的感染状况。受感染的动物表现出一系列与病程有关的利什曼病临床征象和病变特征，包括淋巴结肿大、脾肿大、皮损(e.g...红斑，脱发，眼部病变(e.g...结膜炎)，粘膜苍白和肌肉萎缩。动物的临床状态用基于Manna的临床评分(CS)进行量化。等人.68和Foglia-Manzillo等人.69包括临床征象、病变及血液和生化异常(最多35分)(支持信息表)2).

抗原制备

以原感染分离物为原料，经反转化获得原鞭毛母细胞，在175 cm内培养。2在RPMI 1640改良培养基(BioWhittaker)中加入10%热灭活(56℃下30 min)胎牛血清(吉布CO)、100 U/mL青霉素+100μg/mL链霉素(BioWhittaker)、1%L-谷氨酰胺(BioWhittaker)和1%人尿在27°C条件下培养。为获得双抗体夹心法和WB中原生质体，在−80°C下进行5次冻融循环(37℃液氮水浴)，18000×离心。g室温下持续20 min。收集上清液，用RC-DC蛋白法(BioRad)测定蛋白浓度.ELISAp，Promastigotes(109细胞/mL用0.025%甲醛(Panreac)固定2 h，在改良Neubauer室计数，涂布微滴度板。

ELISAsla和ELISAp条件

用棋盘法确定了ELISA的最佳检测条件。对ELISAsla，96孔板(Nunc Maxisorp，Thermo Fisher Science)在4℃下隔夜涂布20μg/mL(50μL/孔)的SLA，阻断(PBS-2%BSA)1h、37°C和稀释的犬血清(1/400)(50μL/孔)和孵育(2 h，37°C)。二次抗体(1/5000，50μL/孔)(山羊抗狗IgG H+L，B乙基实验室)在37°C下孵育1h，用1mg/mL显色。O-苯二胺(Sigma)和H2O2(1/1000)(100μL/井)。反应用50μL_3N_H停止。2所以4吸光度(OD)在492 nm处读取。

对于ELISAp，在4°C下涂上5×10的微板。6预产士/嗯。阻断平板(1h，37°C，PBS-2%BSA)。加入稀释后的犬血清(1/800，50μL/孔)，孵育2 h，37°C。二次抗体孵育、显色及吸光度均如上。测定至少一式三份。感染前犬血清OD+2标准差(SD)为截断值。

电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(WB)

1D SDS-PAGE及WB

SLA用12.5%SDS-PAGE(150 V，150 mA)进行分析。WB是按照前面描述的方法执行的。70...在150 V，400 mA的固定化P(微孔)上进行凝胶转移。阻断膜条(2.5 mm宽)与犬血清(1/50)在37°C下孵育3h，加入抗犬IgG(B乙基实验室)(1/1000)，37℃，1h孵育，用氯-1-萘氟酚+H显色。2O2在RT和反应停止与MilliQ水。应用ImageJ软件对WB进行免疫识别分析。https://imagej.nih.gov)测定反应性(密度单位，DU)。低分子量(MW)标记来自GE保健公司。

2D电泳、2D WB和多肽鉴定

第一维度(50μg SLA)并行运行在EttanIPGphor 3 IEF系统(GE保健)中的两个3-11 NL pH梯度8cm带(GE Healthcare)上，直到5 KVH。在100 V的Laemmli缓冲液中，在10%丙烯酰胺凝胶(BioRad凝胶连铸机和MiniProtean II室)上进行了第二次实验。一种凝胶用胶体考马斯兰G 250染色，另一种在Towbin缓冲液中转移到PVDF膜(BioRad，Mini Trans-Blot细胞)(150 V，4°C下2h)。WB用1/50稀释后的长期感染犬血清进行。幼铁线蕨...通过与2dWB反应活性的比较，筛选出多肽，用胰蛋白酶对凝胶进行还原和消化。71...在马德里UCM蛋白质组学单元使用4800 PLUS MALDI TOF/TOF质谱仪分析仪(应用生物系统，MDS Sciex)对多肽进行分析。结合肽质量指纹图谱和肽碎片谱，对吉祥物v2.3(http://www.matrixscience.com)通过针对NCBI数据库的全球蛋白质服务器软件(应用生物系统)。在不受分类学限制的情况下进行搜索，其参数为：甲氨酸为固定修饰，氧化蛋氨酸为可变修饰，肽质量耐受性为80 ppm，一个缺失胰蛋白酶切割位点，MS/MS片段耐受性为0.3 Da。在所有蛋白质鉴定中，概率分数大于吉祥物确定的显著分数(P < 0.05).

统计分析

统计分析：≤1/40=1；1/80=2；1/160=3；1/320=4；1/640=5；1/1280=6；≥2560=7)。ELISA值以20份自然感染犬血清OD值的百分比(%)表示。幼铁线蕨、血清学和寄生虫学证实，从兽医学院临床服务处获得，UCM(样本OD/阳性对照人群平均OD x 100)。以Cohen‘s Kappa指数确定诊断技术的一致性。用非参数Spearman相关法评价了不同诊断技术、CS诊断技术与诊断技术之间的关系。72...用Mann-WhitneyU非参数检验，检测了感染犬与对照犬在WB中识别的单个抗原的DU之间的差异。在所有统计分析中，显着性水平设定为P < 0.05. Statistical analysis and figures were done with Graphpad Prism 6.01.

遵守道德标准

欧洲联盟委员会立法(第63/2010/EU号指令)和西班牙国家换位(第53/2013号皇家法令)确立的关于保护用于科学目的的动物的原则和3R原则得到遵守。实验设计和程序得到道德委员会(马德里兽医学院)、动物实验委员会(UCM)和马德里地区政府动物卫生主管部门的批准(参考文献)。(PROEX 329/15)。所有与动物直接接触的人员都具有动物处理和实验的正式资格(ECC/566/2015)。