最常见的软组织肉瘤是胃肠道间质瘤(GIST)。治疗和预防这种疾病需要了解所涉及的分子机制。然而，BRD 4在GIST进展中的作用尚不清楚。虽然已知肿瘤微环境中存在大量浸润性肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)，但这些细胞的确切作用尚未得到研究。本研究显示BRD 4在GIST中的表达与GIST预后有关。通过功能的得失研究，发现BRD 4在体外和体内均能促进GIST的生长和血管生成。BRD 4通过激活NF-κB信号通路增强CCL 2的表达。此外，这种CCL 2的上调导致巨噬细胞进入肿瘤，导致肿瘤生长。本工作概述了GIST微环境中可能的相互作用机制，以显示BRD 4作为GIST治疗目标的作用和潜在用途。

在软组织肉瘤中，最常见的肿瘤是胃肠道定位的胃肠道间质瘤(GIST)。1,2...先前的研究表明，Cajal间质细胞(间充质起搏器细胞)的kit和PDGFRA致癌突变在疾病转移、增殖和肿瘤发生中的作用。3,4...GIST的这些突变被伊马替尼等分子药物所靶向。5,6...尽管这些特殊药物的使用改变了治疗方案，但耐药性会导致大量患者复发。另一个挑战是当上述基因未发生突变时，对GIST缺乏有效的治疗。7,8,9...这些不足需要对疾病机制进行分析，以考虑新的治疗方法。

在肿瘤微环境中有多种非恶性的细胞，例如最丰富的肿瘤相关巨噬细胞(Tams)，它们是普遍存在的具有迁移性质的造血细胞。10,11,12...有许多临床和流行病学研究突出了与GIST和TAMS数目有关的不良癌症预后。13,14...癌症的进展涉及影响不同细胞(如巨噬细胞)的微环境的离散信号。15,16...影响巨噬细胞定向和分化的肿瘤微环境受肿瘤部位趋化因子分布的影响。一个例子是趋化因子(C-C motif)配体2(CCL 2)在包括GIST在内的许多癌症中的上调和作用。17,18.

溴域蛋白包括哺乳动物的溴结构域和外生结构域(Bet)家族，包括BRD 2、3和4。研究的重点是BRD 2和4在细胞周期的转录和调控过程中的伸长过程中的功能，但其参与炎症的可能性尚未发现。19,20...BRD 4最近被证明通过CDK 9激活P-TEFb复合物来调节rna聚合酶II的延伸和与NF-κB相关炎症相关基因的表达。21,22.

在目前的研究中，我们发现BRD 4基因在GIST患者中明显上调，并与其病理和生存密切相关。BRD 4通过NF-κB信号通路增加CCL 2的表达，最终促进肿瘤的生长。这些发现表明BRD 4通过TAMS参与了GIST。

细胞培养

JonathanFletcher(Danafarber癌症研究所，波士顿，MA)好心地提供了GIST 882细胞株(来自K642E：kit外显子13纯合错义突变)。23...Biowit技术公司(中国深圳)是获得的GIST-T1细胞系的来源(来自于V560Y579del：Kit外显子11中的57个核苷酸下突变)。24...用Dulbecco改良鹰培养基(DMEM)加10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素链霉素在5%CO条件下培养。2在37°C。

病人及诊所样本的详细资料

2012年2月至2015年3月期间在吉林大学第二医院接受手术的患者(经书面知情同意)是本研究使用的20个GIST样本的来源；样本用福尔马林固定，石蜡包埋。样品在液氮中快速冻结，保存在−80°C，直至测定。两名病理学家用HE染色对标本进行病理证实。吉林大学第二医院人类研究伦理审查委员会发布了“伦理同意书”。

免疫组织化学

采用福尔马林固定石蜡包埋4μm切片.个别，BRD 4，CD 31和CD 68抗体染色用选定的玻片进行分析，然后由两位经验丰富的病理学家进行分析。细胞核和细胞质染色正常化后，染色强度评分按以下评分系统进行：0=NO染色；1=弱染色；2=中度染色；3=强染色。结合这些评分和阳性细胞百分比得出最终免疫组织化学(IHC)评分。

定量实时PCR

定量实时聚合酶链反应(qrt-pcr)按前面所述进行。25,26...简要地说，用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA，然后根据制造商的协议用SuperScriptⅡ反转录酶(Invitrogen)进行逆转录。采用ABI 7300实时PCR系统(应用生物系统)对BRD 4和GAPDH特异引物进行分析。二−ΔΔCT方法以GAPDH mRNA为对照，检测BRD 4基因表达的变化。

WESTERNBLOTTING

WESTERNBLOTTING按前面所述进行。27,28...Ripa缓冲液(皮尔斯，罗克福德，IL，美国)加一种蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏，普莱桑顿，CA，美国)用于裂解细胞。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。在4°C下进行一次抗体的隔夜培养，然后与辣根过氧化物酶(HRP)结合的相应的次级抗体暴露。然后，用相应的HRP结合的次级抗体孵育印迹。ECL摄取器(Thermo Science)观察所得条带。本研究使用的抗体如下：BRD 4(Ab128874)、β-actin(Ab8226)、MMP 9(Ab38898)、LOX(Ab174316)、VEGFA(Ab52917)、p65(Ab16502)、p-p65(Ab86299)、LaminA/C(Ab108595)和CCL 2(ab9851；ABCAM)。

细胞活力测定

将细胞接种到96孔板中，隔夜培养1h后，用CCK 8交换培养基(10μ1，10μl)。在不同时间点(24、48和72h)，用波长450 nm测量光密度(OD)。

BrdU/PI法

本协议与以前的一项研究中所使用的协议是一致的。29...总之，采用六孔板隔夜培养细胞，然后用10μg/ml BrdU孵育20 min。然后用70%乙醇在−20°C进行洗涤和隔夜固定，室温下2 N HCL和FITC二次抗体染色45 min，再加入40 g/ml RNase A和200 g/ml PI 30 min，流式细胞仪分析。

细胞的分离与分化

从健康体积中分离出人单核细胞。采用Ficoll-Hypaca公司分离外周血单核细胞，在400℃下进行密度梯度离心50 min。g...细胞接种于密度为2×10的24孔板中。6在RPMI 1640培养基中加入10%热灭活人AB血清、50 U青霉素和链霉素/ml、2mm L-谷氨酰胺和100 ng/ml人巨噬细胞集落刺激因子，可促进巨噬细胞的分化。培养6天后，用温热培养基冲洗不粘附的细胞。CD 14+采用这种方法，巨噬细胞占粘附细胞的95%以上。体外活化M1巨噬细胞，2×106用25μg/mlLPS(脂多糖；Sigma)处理上述分离细胞1d，用45 ng/ml重组人白细胞介素4(IL-4，R&D)活化M2极化巨噬细胞。流式细胞术检测单核细胞分化的巨噬细胞。下一轮体外实验用的条件培养基是用PBS洗涤细胞，然后在培养基中减去补充剂培养24h。

内皮细胞管形成的测定

内皮细胞管的形成如前所述。30...GIST细胞在DMEM阴性血清中孵育一夜。用Matrigel在96孔板上播种了20，000 HUVECs/孔，以及上述条件培养基.孵育后，用显微镜对形成的HUVEC管进行成像，并对其分支数进行量化。

酶联免疫吸附试验

经DMEM阴性血清治疗后，按厂家规定的方案，从细胞中提取条件培养基进行VEGFA酶联免疫吸附试验(ELISA)分析。测定OD值在470 nm处的吸光度。

伤口愈合和侵袭试验

伤口愈合试验涉及用于种植GIST细胞的六孔板。在细胞汇合率为95%时，用无菌200μm塑料吸管尖轻轻划伤单层，然后用照片记录伤口。4×10播种的Transwell入侵试验4细胞悬浮在缺乏血清的培养基中的上腔膜中，不包被基质(BD生物科学)。下腔接受6 0 0μ1培养基加10%FBS。24h后，对膜底进行30 min固定和0.1%结晶紫染色.在使用棉签擦拭膜内部后，用显微镜对细胞进行了定量。

菌落形成

用六孔板培养500~1000个细胞/井，这些细胞暴露于上述化学物质和组合中。每3天更新一次，至第14天，细胞固定后用结晶紫染色。将曾接触过药物的细胞与接触DMSO的对照细胞进行比较，并一式三份完成检测。

小鼠异种移植瘤的研究

吉林大学第二医院动物保护和使用委员会批准了以下实验。Balb/c裸鼠(4周龄)随机分为两组(n=6)。动物皮下注射表达表达载体或BRD 4的GIST-882细胞，用Matrigel(1：1)在PBS中重新悬浮。肿瘤体积的计算公式如下：(长度×宽度)2(2)注射后第19天处死动物。

统计分析

采用棱镜5.0(GraphPad软件)进行分析。平均±S.D.被用来计算至少三个独立实验的数据。未配对的双尾学生t-检验用于分析两个数据集，对更多数据采用单因素方差分析。显着性p < 0.05.

BRD 4在GIST中的表达

如所述，对临床样本进行了BRD 4水平的检测，以检查BRD 4在GIST中的作用。观察到与正常对照组相比，BRD 4 mRNA和蛋白表达增加(图一)。1A，b)。IHC检测到的BRD 4水平也符合这一观察结果(图1)。1C，d)。结果显示，患者总体生存率(OS)和无病生存率(OS)较低(P < 0.01; Fig. 1E)。这些数据表明BRD 4可能参与GIST的进展。

aWestern印迹法检测BRD 4在正常组织和GIST组织中的表达。bBRD 4 mRNA在正常组织和GIST组织中均有表达。c和d用IHC分析BRD 4蛋白在正常组织和GIST组织中的表达。标尺：25μm。eBRD 4低表达和高表达的GIST患者OS的Kaplan-Meier曲线；**P < 0.01.

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BRD 4对GIST细胞增殖、迁移和侵袭的刺激作用

一旦观察到BRD 4在疾病进展中的作用，将进一步研究BRD 4在疾病进展中的作用。构建转染GIST-882和GIST-T1细胞的对照pcDNA-3.1(+)和pcDNA-3.1(+)-BRD 4载体，评价BRD 4的作用。G 418引起表达载体BRD 4。pcDNA-3.1(+)-BRD 4载体转染GIST-882和GIST-T1细胞比单纯转染pcDNA-3.1(+)增加BRD 4。2A)。CCK 8分析表明，表达BRD 4的细胞比表达控制载体的细胞具有更高的生长模式。2B)。与这些观察相一致的是，BrdU/PI检测结果显示，表达BRD 4的细胞系中含有BrdU的细胞数高于对照载体转染细胞(如图所示)。2C)，这表明BRD 4导致DNA合成增加。集落形成实验显示细胞内有较高的集落数和大小，表达BRD 4的细胞明显高于对照载体转染细胞(见图4)。二维空间)。这些观察表明BRD 4刺激了GIST细胞的增殖。

a获得稳定表达载体或BRD 4的GIST 882和GIST-T1细胞。Western印迹法检测BRD 4蛋白的表达。bCCK 8法检测GIST 882和GIST-T1细胞稳定表达载体BRD 4的活性。c用BrdU/PI法检测稳定表达载体细胞和稳定表达BRD 4细胞的DNA合成。d将稳定表达载体或BRD 4的GIST 882和GIST-T1细胞接种于6孔板上进行集落形成试验。e和f将稳定表达载体的GIST 882细胞和GIST-T1细胞或BRD 4细胞在上腔内放置或不加Matrigel培养24h，观察移行细胞的迁移和侵袭情况。标尺：25μm。g采用创面愈合试验检测GIST 882细胞中稳定表达载体BRD 4的细胞迁移情况。h用创面愈合试验检测GIST-T1细胞稳定表达载体BRD 4的细胞迁移情况；*P < 0.05; **P < 0.01.

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由于GIST治疗受到临床转移的阻碍，我们评估了BRD 4在转移中的作用。BRD 4过表达导致细胞迁移增加，在跨井检测中观察到(见图)。2E，f)以及增加迁移能力，如在伤口愈合试验中观察到的那样(如图所示)。2G，h)。提示BRD 4在GIST的迁移和侵袭中起着关键作用。

BRD 4在GIST血管生成中的作用

肿瘤的进展涉及到新生毛细血管的重要形成，这种新生毛细血管被称为血管生成。这一过程涉及肿瘤细胞分泌的bFGF、PDGFB和VEGF等血管生成因子。这一认识引导我们下一步评估BRD 4对GIST血管生成的影响。表达BRD 4的细胞系表达VEGFA、LOX和MMP 9的水平高于转染对照载体的细胞。3A)。与这些观察相一致，shBRD 4细胞的VEGFA水平低于shNC细胞(图1)。3C)。ELISA用BRD 4的表达证实了VEGFA的高表达(图一)。3B)，在敲除BRD 4的同时，显示了相反的观察结果(如图所示)。三维空间).

a获得稳定表达载体或BRD 4的GIST 882和GIST-T1细胞，Westernblotting检测表达。b将稳定表达载体或BRD 4的GIST 882和GIST-T1细胞与不含血清的DMEM联合培养。取条件培养基进行ELISA检测VEGFA的分泌。c获得稳定表达shcon或shBRD 4的GIST 882和GIST-T1细胞，Western印迹法检测表达。d将稳定表达shcon或shBRD 4的GIST 882和GIST-T1细胞与不含血清的DMEM联合培养。取条件培养基进行ELISA检测VEGFA的分泌。e将稳定表达载体或BRD 4的GIST 882细胞条件培养基与HUVECs细胞孵育于96孔板中。用每个场的分支点来观察管状的形成。f将稳定表达shcon或shBRD 4的GIST-T1细胞条件培养液与HUVECs细胞孵育于96孔板中。根据每个场的分支点数来观察管状的形成。标尺：100μm；**P < 0.01; ***P < 0.001.

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表达载体BRD 4、shRD 4或shNC的条件培养基分别与内皮细胞孵育。BRD 4表达细胞的培养液与单独表达载体的细胞相比，肾小管的形成增加，而敲除细胞则表现为与shNC细胞相反的观察(图一)。3E，f)。总之，我们的发现表明BRD 4可能参与了GIST的血管生成。

BRD 4过表达促进体内生长和血管生成

上述效应在材料部分所描述的动物模型中进行了评估。表达BRD 4的细胞的生长，以及肿瘤的重量和大小，明显大于单独表达载体的细胞(如图所示)。4A，b)。肿瘤微血管密度在表达BRD 4的细胞中增加，这是由IHC测定的CD 31升高所提示的。4C)。这一发现也被更高水平的VEGFA所证实，正如Westernblotting所测量的，表达BRD 4的动物的VEGFA水平高于只有载体肿瘤的动物(如图所示)。4D).

a在Balb/c裸鼠皮下注射GIST 882对照细胞或BRD 4细胞。给出治疗后第1~19天肿瘤体积生长曲线。b19天后处死小鼠，观察两组小鼠的肿瘤重量。c两组均有代表性的BRD 4和CD 31的IHC染色。标尺：25μm。d采用Westernblotting分析MMP 9、LOX和VEGFA在异种移植瘤中的表达；P < 0.05.

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BRD 4通过CCL 2发挥致瘤作用

其次，我们分析了BRD 4的潜在靶基因。我们的qRT-PCR结果显示，BRD 4基因敲除细胞中CCL 2的表达与shControl细胞相比有所下降(图1)。5A)。酶联免疫吸附试验(ELISA)进一步证实了CCL 2的下调。5B)。此外，BRD 4的过表达增加了CCL 2的表达。5C)。提示BRD 4在GIST中诱导CCL 2的发生。

a采用RT-PCR方法检测稳定表达shcon或shBRD 4的GIST 882细胞中细胞因子的表达。b稳定表达shcon或shBRD 4的GIST 882和GIST-T1细胞CCL 2表达的ELISA检测。c稳定表达载体或BRD 4的GIST 882和GIST-T1细胞CCL 2表达的ELISA检测。d在Balb/c裸鼠皮下注射GIST 882对照细胞或BRD 4细胞。用IgG或αCCL 2抗体治疗小鼠。给出治疗后第1~19天肿瘤体积生长曲线。e在Balb/c裸鼠皮下注射稳定表达shcon或表达BRD 4的shCCL 2的GIST 882细胞。用IgG或αCCL 2抗体治疗小鼠。给出治疗后第1~19天肿瘤体积生长曲线。*P < 0.05; **P < 0.01.

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这些实验之后，使用一种抗体来抑制趋化因子信号，这是在体内评估的。CCL 2中和抗体明显降低肿瘤的生长。5D)。此外，BRD 4促进的肿瘤生长被CCL 2下调所阻断。5E)。提示GIST细胞产生CCL 2在BRD 4所致转移中的作用。

NF-κB参与BRD 4诱导的CCL 2表达

下一项分析是研究上述结果背后的潜在机制。BRD 4对NF-κB通路的调控已在前期工作中得到证实。NF-κB通路涉及p65磷酸化和核易位，影响基因的激活.GIST-882和GIST-T1细胞的BRD 4表达与p65上S536磷酸化程度成正比(如图所示)。6A)。p65的磷酸化在BRD4-Kockdown细胞中被下调。6A)。用siRNA敲除p65可阻断GIST-882细胞对CCL 2的诱导(图1)。6B)。Westernblotting显示p65易位于细胞核，BRD 4高表达(图4)。6C)。另一项解释NF-κB作用的尝试是用NF-κB抑制剂BAY 11-7082预处理细胞，以防止向细胞核的移位(如图所示)。6C)。这种治疗可以通过BRD 4的过度表达来消除CCL 2的表达和p65的磷酸化(如图所示)。6d)。提示p65在BRD 4激活CCL 2中起一定作用。

aWesternblotting分析p65在所指示细胞中的磷酸化。b用Westernblotting分析稳定表达shcon或shp 65的GIST 882细胞中CCL 2的表达。c将稳定表达载体或BRD 4的GIST 882细胞用10μ/l BAY 11-7082处理1h，从细胞中分离核组分，Westernblotting分析p65的表达情况。LaminA/C和β-actin分别在细胞核和细胞质中表达，作为加载和分馏的对照。d将稳定表达载体或BRD 4的GIST 882细胞用10μ/l BAY 11-7082处理1h，Westernblotting检测p-p65(S 536)和BRD 4水平。

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CCL 2激活的巨噬细胞刺激肿瘤进展

CD 68(巨噬细胞标记物)在GIST瘤内和瘤周区高水平检测，与小鼠模型观察显示巨噬细胞浸润与BRD 4水平相关(图4)。7A)。这一关联表明BRD 4和TAMS之间存在联系。接下来的实验包括分析BRD 4过表达对TAMS的影响。如材料部分所述，这涉及人类单核细胞的培养。转染BRD 4的细胞条件培养液可使单核细胞活化为巨噬细胞，CD 206-高/HLA-DR-低表型可见于对照组条件培养液处理的细胞(图1)。7b)。流式细胞术检测M1和M2特异性标记物的表达。转染BRD 4的细胞培养液中CD 206和CD 163(M2标记)的表达明显高于对照组(P<0.05)，而转染BRD 4的培养液中HLA-DR和CD 86(M1标记)的表达明显低于对照组(见图)。7b，c)。这些发现提供了证据，BRD 4水平的增加激活TAMS。接触CCL 2中和抗体在体内对这些巨噬细胞有明显的抑制作用，表明CCL 2在BRD 4激活TAM中的重要作用(图4)。7D).

a不同BRD 4表达水平的瘤内组织中CD 68阳性细胞高、低表达的GIST组织的典型图像。标尺：25μm。b流式细胞术分析和定量CD 206/HLA-DR在巨噬细胞中的表达。c流式细胞术分析和定量CD 163/CD 86在巨噬细胞中的表达。dIHC染色评价抗F4/80的巨噬细胞在裸鼠肿瘤中的作用。标尺：25μm；**P < 0.01.

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尽管最初使用靶向治疗(如伊马替尼)的gist患者(如伊马替尼)的试剂盒或PDGFRA突变型gist患者取得了有限的成功，但主要的挑战是药物耐药性的发展。31,32...另一个因素是对分子靶向治疗缺乏这种突变的GIST没有反应。33,34...这些问题要求我们对GIST的病理机制有一个全面的了解。35...需要适当的新方法来治疗这种疾病(晚期或无法切除的病例)。本研究显示BRD 4在临床GIST标本中的过表达，与相应的健康标本相比，提示BRD 4在GIST中的表达与表观遗传学和翻译后修饰有关。BRD 4作为肿瘤微环境的调节因子，通过NF-κB通路参与GIST的进展，导致CCL 2的激活。这反过来又导致TAMS的浸润，从而影响肿瘤的微环境。在体内使用抗CCL 2抗体来抑制BRD 4所致肿瘤的生长，这种浸润受到了明显的抑制。因此，对于BRD 4在GIST发病机制中的作用，本研究有了新的见解。

BET家族蛋白(包括BRD 4和导言中列出的其他蛋白质)是以炎症为靶点的小分子靶向的。36,37...虽然每个成员在体内的作用还有待探索，但迄今为止还没有在任何工作中检测到GIST中BRD 4的水平。因此，我们对BRD 4的致病特性进行了评价，发现BRD 4可以增强GIST细胞的增殖、侵袭和迁移能力。因此，一种潜在的治疗方法是将BRD 4作为GISTS的治疗靶点。

研究表明VEGFA参与了血管生成，血管生成是肿瘤发生和转移的一个复杂途径。38,39...本工作探讨了BRD 4是否与此途径相关，并报道BRD 4水平的升高导致HUVEC管的体外和体内形成。

TAMS在肿瘤微环境中的重要参与引起了人们的广泛关注，因为这些累积的细胞产生了几种生长因子，这些细胞对人类肿瘤的发生和血管生成都有影响。40,41...早期关于促进胶原降解的研究表明，巨噬细胞与肿瘤细胞是共生的。42...本工作显示TAMS在动物模型中的肿瘤发生中的作用，以提供对GIST机制的了解。BRD 4在提高CCL 2表达中的作用43(这是大量的肿瘤产生的影响肿瘤发生，以及从循环中招募单核细胞成为TAMS)。最近的研究表明，CCL 2在许多Ⅰ、Ⅱ期的临床试验中，用卡鲁马抗体(一种单克隆抗体)在实体肿瘤中具有靶向作用。44...CCL 2的这种靶向性也可用于治疗GIST和预测GIST患者的预后。这项工作显示BRD 4刺激NF-κB通路以提高CCL 2水平，使用抗CCL 2抗体可显著降低这些水平。这些抗体还能延长BRD 4高表达动物模型的存活时间，这可能是因为CCL 2阻断CCL 2治疗高水平BRD 4的GIST。这项工作既揭示了一种机制，也探索了一种潜在的治疗方法。

转录因子NF-κB对免疫系统两个分支的调节作用被认为是调节炎症的作用。45,46...这一因素导致许多对炎症至关重要的基因的诱导，如趋化因子和细胞因子，以及影响免疫细胞和炎症T细胞的活化、存活和分化。47,48...因此，NF-κB的调节失调转化为几种与炎症有关的疾病。49,50...本研究表明该通路参与了BRD 4诱导CCL 2表达的增加。

总之，这项工作概述了BRD 4在GIST进展中的作用。这项工作清楚地证明了高水平BRD 4在GIST中的作用，BRD 4通过CCL 2完成其改变肿瘤微环境的作用，这些发现与临床和功能分析相一致。这种TAMS通过BRD 4诱导的CCL 2参与，可以进一步揭示GIST的进一步机制，并解决GIST的治疗问题。