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登革热NS1酶联免疫吸附试验不能检测寨卡病毒感染

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发表时间:2019-12-09 17:07作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

登革热NS1酶联免疫吸附试验不能检测寨卡病毒感染

摘要

在巴西,登革热病毒(DENV)、寨卡病毒(ZIKV)和奇孔肯雅病毒(CHIKV)的存在可能导致由于这些病毒的体征和症状而难以诊断。此外,由于DENV和ZIKV属于同一家族,血清学检测可能显示出较高的交叉反应率。在此,我们评估了一种登革热NS1捕获试验,以便在2016年巴西寨卡流行期间对登革热进行早期和鉴别诊断。218名病人的227份样本包括先前证实的急性寨卡病毒、登革热和寨卡/登革热混合感染患者的血清、血浆和尿液。其中九名病人提供了两份标本。登革热NS1试验对登革热的诊断有很高的特异性(99.32%),甚至在与ZIKV的共循环中也是如此,在未检出急性寨卡病毒方面具有较高的准确性(92.43%)。我们的发现表明,这里分析的登革热NS1捕获试验无法识别ZIKV NS1及其交叉反应的可能性。

导言

登革热病毒(DENV)和寨卡病毒(ZIKV)属黄病毒并对公众健康产生相关影响。埃德斯蚊子是主要的媒介,是这些虫媒病毒在世界热带和亚热带地区传播的罪魁祸首。1...DENV感染可由四种抗原不同的血清型(DENV 1至4)中的任何一种引起,可从非特异性发热疾病到以血小板减少、转氨酶升高和血浆漏出为特征的更为严重的疾病,这些都可能导致并发症和死亡。2...ZIKV感染患者,主要表现为发热、皮疹、关节痛、肌痛、疲劳、头痛、结膜充血等症状。3,4...尽管与寨卡病毒有关的先天性综合症可能会影响胎儿和婴儿,但感染者通常会完全康复,而且死亡人数很少。5.

DENV/ZIKV混合感染可能发生在这些病毒共同传播的地方,但是那些在疾病严重程度上的病毒的影响还不完全清楚,需要进一步的研究。一些研究报告说,树突状病毒共感染的病人在轻微的临床病程后恢复正常。6,7,8,但有些可能伴随着严重的神经症状而演变。9...尽管如此,登革热与其他树突状病毒的鉴别在流行地区是至关重要的,因为早期诊断可能有助于监测登革热严重程度的潜在标志。

一般来说,这些树突状病毒引起的症状和体征非常相似,可能会给鉴别诊断和病人治疗带来麻烦。10...由于临床诊断这些感染的困难,实验室起着重要的作用。然而,这些检测应该具有最大的敏感性、特异性和简单性,通过准确鉴别登革热与寨卡和其他发热疾病,为患者提供早期支持。11,12...登革热和寨卡病毒的实验室诊断主要依赖于病毒的分子检测。11,12,13但是,阴性结果并不排除由于病毒滴度低而导致的感染,这取决于样本收集的时间框架。酶联免疫吸附试验(ELISA)仍然是目前最简单、应用最广泛的诊断试验。11然而,市场上仍缺乏足够敏感和特异的血清学检测方法来区分这两种病毒。14,15...此外,人们还发现,在大多数检测中通常检测到的IgM并不是一个很好的验证性标记。12,14,16.

与登革热相似,zIKV非结构蛋白1(Ns1)参与病毒复制、免疫逃避和发病机制。17,18...有几种ns1 elISAs可用于登革热的早期诊断,具有良好的敏感性和特异性。19,20,21,22,23...一些研究也显示出高灵敏度和有限的交叉反应能力,表明ns1可能代表了一种有效的DENV和zIKV感染的差异检测方法。24,25,因为它有特定于群体的表位,有可能区分这些病毒。12...登革热ns1试验与zIKV感染交叉反应将产生重大后果。26...在此,我们旨在评估登革热NS1抗原捕获试验,以便在2016年巴西寨卡流行期间对登革热进行早期和鉴别诊断。

结果

本研究采用分子和血清学方法对218例疑似树突状病毒感染患者的血清、血浆和尿液中227份标本进行了检测。其中60.35%(137/227)经实验室诊断确诊为树突状病毒感染,39.64%(90/227)为阴性。

两种分子检测均证实ZIKV感染,分别为25.11%(57/227)和24.66%(56/227),均与临床标本无关。10.57%(24/227)的样本(DENV-1/ZIKV,n=14,DENV-4/ZIKV,n=8,NS1-DENV/ZIKV,n=2)检出ZIKV/DENV混合感染。1...用实时(RT)RT-PCR法检测CHIKV,抗CHIKV IgM均无阳性.所有标本的MAYV检测结果均为阴性。由于α病毒CHIKV和MAVY病毒在巴西的发生和循环,对其进行了鉴别诊断。

表1通过分子和血清学方法调查巴西中西部地区2016年爆发的树状病毒感染情况。

在ZIKV阳性标本(n=57)中,rtRT-PCR可在血清(43.42%[33/76))、血浆(9.09%[12/132])和尿液(63.15%[12/19])中鉴定病毒基因组。rtRTPCR和/或™登革热实时RTPCR检测的标本中,DENV的分子检测率为9.69%(22/227),均在血浆中检出。两种试验均显示,63.63%(14/22)的阳性标本为DENV-1型,36.37%(8/22)为DENV-4型。所用的分子分析显示,血清和尿液中没有一份登革热呈阳性。1.

抗DENVNS1阳性率为27.75%(63/227)。血浆中阳性率较高(43.93%,58/132)。76例血清标本中有5例(6.57%)阳性,但尿标本中未见阳性。抗DENVIgM抗体仅在血浆和29份标本中检出(21.96%,29/132)。1.

分析结果表明,10.71%(6/56)的DENV单染患者也有抗-DENVIgM阳性。在DENV/ZIKV共感染患者中,抗-DENVIgM阳性率为8.33%(02/24)。2例ZIKV单感染患者(3.50%;02/57)抗-DENVIgM阳性,但对DENV的RTPCR结果为阴性。1例登革NS1试验阴性(0.73%;01/137)的DENV和ZIKV均为阴性,但抗-DENVIgM和抗CHIKVIgM均为阳性。

在此分析中,在确诊登革热病例时,普拉蒂利亚NS1试验的敏感性较高(79.74%)。通过对所有临床标本(血清、血浆和尿液)的分析,该试验的特异性为99.32%。本试验对急性ZIKV感染的诊断准确率较高(92.51%),阳性预测值为98.43%,阴性预测值为90.18%。2.

表2用于登革热诊断的登革热NS1捕获试验的敏感性、特异性、准确性、预测值和似然比值。

使用登革热NS1试验在ZIKV病例检测时没有发现阳性结果,但有1例结果不确定。在所有病例中,有6份血清和尿液样本,其中4份来自寨卡和登革热NS1阴性,2份呈阴性。只有一例登革热病例出现血浆和血清,但登革热NS1试验阴性。

提示登革热NS1试验对登革热有较高的特异性,与ZIKV阳性标本无交叉反应。在登革热NS1抗原捕获试验中,DENV阳性病例的检出率明显高于ZIKV阳性者(49/56对0/57,p=0.000)。同样,与dnv/zIKV共感染的样本比zIKV单感染样本更有可能对ns1检测呈阳性(14/24对0/57,p=0.000)。3...DENV单感染组NS1光密度(OD)明显高于单纯ZIKV感染组(p<0.0001),且与ZIKV/DENV共感染组比较差异有显着性(p<0.0001)。在不同的组和在不同的样本中得到的OD值显示在图中。1.

表3登革热NS1捕获试验对寨卡和登革热、单一感染和混合感染的敏感性。
图1
figure1

登革热NS1捕捉ELISA对寨卡及登革热单一及合并感染的吸光度(A)根据寨卡病毒和登革热阳性病例的不同样本(B)。用非参数Mann-WhitneyU检验评价DENV与ZIKV单、共感染间光密度(OD)的差异。*p<0.0001,ns:无显着性,(-)代表各组的平均值和(-)虚线,即测试的截止时间。

讨论

登革热是世界上热带和亚热带地区的一大公共卫生问题,因此快速诊断对于限制疾病的传播至关重要。11...然而,随着zIKV在许多地区的引入,由于这些树突状病毒的交叉反应率很高,实际感染的发生率尚不清楚。13...这种感染是短暂和轻微的,但具有强烈的神经原性,可能会对感染的母亲的胎儿造成致畸作用。18,27.

ZIKV和DENV不仅由同一载体传播28并且有相似的体征和症状,但也有共同的结构相似性,因为他们属于同一个家庭。因此,它们诱导了高度交叉反应的抗体反应。29,30,31对于大多数用于诊断的血清学方法来说都是麻烦的。对于登革热的诊断,ELISA仍是应用最广泛的诊断试验,除了用于检测抗DENVIgM抗体外,还用于捕获感染宿主细胞产生的DENVNS1糖蛋白。此外,有证据显示,ELISAs价格低廉,灵敏度高,足以检测低浓度的分析物质。11,32...然而,对一项抗登革热IgM测试的分析表明,zIKV感染的患者可能会出现阳性结果。33...在这种情况下,通过其他诊断技术的重新测试是必要的,以提供一个更可靠的结果,并使用病毒分离和分子方法是有用的。在这里,rtRT-PCR的使用是确认ZIKV和DENV单抗和混合感染的必要条件,应该是实验室检测算法的一种策略。

与其他血清学检查(如mac-elisa)相比,DENV ns1是登革热早期诊断的独特指标,因为它是在症状出现后不久在患者血清中检测到的。12,19...在此,通过对所有临床标本(血清、血浆和尿液)的分析,普拉蒂利亚NS1试验在确诊登革热病例方面具有较高的敏感性和特异性,对急性ZIKV感染的诊断准确率较高(92.51%)。

对于寨卡病毒,大多数的诊断依赖于rtRT PCR和mac-elisa在尿液、血清、血浆或脑脊液中的应用。13,29,34然而,由于与DENV的交叉反应35对部分市售的寨卡病毒IgM ELISA检测,推定阳性结果的确诊率可能低于50%。36.

ZIKV ns1可诱导病毒特异性的非中和抗体应答,是一个可靠的诊断靶标。24...此外,研究还表明,大多数来自原发感染患者的抗zIKV ns1抗体都是针对zIKV的,但超过50%的患者对登革热有反应。37...事实上,人抗-ns1抗体的交叉反应性在DENV和ZIKV感染后增加。24...尽管如此,使用ZIKV ns1的ELISA能够区分寨卡病毒和登革热。14,33...最近,四种DENV和ZIKV NS1蛋白在ELISA中的联合使用,能够区分DENV和ZIKV感染。38.

我们的研究结果表明,登革热NS1捕获试验无法在用于登革热和寨卡病毒诊断的不同标本中识别ZIKV NS1,这一信息对于选择可靠的流行病学监测测试和对这些感染的鉴别诊断具有重要意义。尽管如此,在不同情况下进行更广泛的评价也是值得欢迎的,需要对这些意见加以证实。

方法

本研究分析的样本来自OswaldoCruz基金会伦理委员会批准的一个正在进行的项目(CAAE 57221416.0.1001.5248)。所有登记的病人都签署了知情的书面同意。传染病医生使用结构化问卷收集病人的数据,在获取数据之前,病人的个人信息是匿名的。这一横断面和观测研究于2016年2月至3月在位于巴西坎波格兰德的健康单位UPA Coronel Antonino进行。病人的临床和实验室特征在其他地方发表。8...所有树状病毒疑似病例都是在巴西里约热内卢国际奥委会/Fiocruz病毒免疫学实验室积极监测期间获得的,所有实验室方法都是根据相关准则和条例进行的。

实验室诊断

临床标本227份,血清76份,血浆132份,尿标本19份。对218例疑似树突状病毒患者进行了DENV、ZIKV和CHIKV的分子和血清学检测,作为鉴别诊断。其中9个病例显示了2个不同的样本。简单地说,对于登革热的血清学诊断,登革热病毒IgM捕获了Dx选择™(焦点诊断,美国加利福尼亚州)和普拉蒂利亚。采用登革热NS1抗原酶联免疫吸附试验(BioRad Lab,California,USA)。普拉蒂利亚登革热NS1抗原ELISA检测采用一步夹心法微板酶联免疫法检测DENV NS1抗原。本试验采用小鼠单克隆抗体进行捕捉和揭示。如果样品中存在NS1抗原,将形成免疫复合物单克隆抗体-NS1-单克隆抗体/过氧化物酶。简单地说,样品被允许解冻到实验室环境温度(21-22℃)。样品稀释剂(50μl)、样品和对照组(各50μl)和100μl稀释共轭物在37°C下用纯化的小鼠抗NS1单特异性抗体包被的微板井中孵育90 min。洗涤6次后,加入160升底物,在室温下在黑暗中孵育30 min。免疫复合物的存在是通过显色来证实的,而酶反应则是通过添加100μl的1 nH而停止的。2所以4...用分光光度计在450~620 nm处测得NS1抗原的光密度(OD)读数,并将样品的OD值与切断对照的OD值进行比较,确定NS1抗原的存在量。

用常规RT-PCR方法进行DENV分子检测和血清学分型。39和rtRT-PCR40如前所述。为进一步排除假阴性病例中的DENV感染,所有样本均按照制造商的检测协议,采用单纯形™登革热实时RT-PCR(Focus Diagnotics,USA)进行定性检测和分型。由于黄病毒在血清学检测中的交叉反应性,为了进行寨卡病毒的调查,对病例进行了一步rtrt-pcr检测,如前所述。29...用其他地方描述的rtRT-pcr协议对基孔肯雅感染进行评估。41...为了检测抗CHIKVIgM抗体,根据制造商的程序,使用了抗CHIKVIgM ELISA(Euroimmun,Lubeck,德国)。所有样本也进行了Mayaro病毒(MAYV)的测试,如以前在其他地方所描述的那样。42.

仅当rtRT-PCR阳性,所有其他鉴别诊断试验阴性时,才考虑寨卡病例。登革热病例只有在经分子检测呈阳性时,伴随或不伴有阳性血清学结果(登革热NS1和/或抗DENVIgM),而其他被检测的树突状病毒呈阴性时,才被认为是登革热病例。1例基孔肯雅病例仅在rtRT-PCR阳性,伴或不伴阳性血清学结果(抗-CHIKV IgM),而对其他虫媒病毒检测阴性时才考虑。本研究以登革热和寨卡病毒为特异性的rtRT-PCR同时检测ZIKV/DENV混合感染,同时检测登革热血清学阳性(登革NS1和/或抗DENV IgM),不进行寨卡血清学检查。当样品在这里进行的所有测试中呈现阴性结果时,都会考虑阴性的情况。经筛查后,采用寨卡病毒、登革热病毒、ZIKV/DENV及阴性病例进行™登革热NS1抗原-ELISA(BioRad实验室)检测。

统计分析

使用GraphPad Prism软件8.0版(GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)进行统计分析。用非参数Mann-WhitneyU检验评价DENV组与ZIKV组间的差异。经统计学分析,P<0.05值均有显着性意义。

数据可用性

在本研究中产生的所有数据都包含在本文中。




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