Clec10a调节螨虫引起的皮炎
屋尘螨(HDM)是一种过敏原与多种疾病有关,包括哮喘和过敏性皮炎(AD)。 数控/ Nga鼠标应变发展严重的广告针对HDM Kanemaruet al。现在已经确定了stop-gain突变,Clec10a c型凝集素受体,与此相关的反应。 HDM-induced皮炎是由TLR4-mediated炎症反应,asialoglycoprotein受体1 (Asgr1)函数作为Clec10a同族体在人类身上。 他们还发现了一个mucin-like HDM可以作为配体的分子Clec10a Asgr1。 这些结果提供了洞察与HDM-mediated皮炎相关机制。
屋尘螨(HDM)是一个主要的过敏原引起过敏性疾病,如过敏性皮炎。 然而,HDM-induced免疫反应的调节机制不完全清楚。 数控/ Nga老鼠是一个更容易的近交品系HDM比其他菌株和发展更严重的皮炎。 使用whole-exome测序,我们发现数控/ Nga老鼠携带stop-gain突变Clec10a编码一个c型凝集素受体,Clec10a (MGL1 / CD301a)。 这种基因突变的修复使用CRISPR-Cas9系统HDM-induced皮炎改善,表明Clec10a突变负责过敏症在NC / HDM Nga老鼠。 同样的,Clec10a−−/在C57BL / 6 j小鼠背景显示,加剧了HDM-induced皮炎。 Clec10a表达在皮肤巨噬细胞抑制HDM-induced toll样受体4 (TLR4)介导的炎性细胞因子的生产通过抑制immunoreceptor酪氨酸激活胞质部分的主题。 我们确定了asialoglycoprotein受体1 (Asgr1)作为一个功能的鼠标Clec10a同族体人类。 此外,我们发现一个mucin-like分子HDM人类Asgr1是鼠标Clec10a和配体。 配体的皮肤应用改善小鼠的TLR4 ligand-induced皮炎。 我们的研究结果表明,在小鼠和人类Asgr1 Clec10a发挥重要作用在皮肤内稳态与HDM-induced皮炎相关炎症。
屋尘螨(HDM)的一个主要的过敏原与过敏性疾病相关,如特应性皮炎(AD)、鼻炎和哮喘(1,2)。 大多数广告和哮喘患者高度敏感的HDM (1,3.)。 过敏性的HDM与螨本身有关,包括蛋白质水解和nonproteolytic蛋白质; 骨骼外的组件,如甲壳素和粪球的HDM组成的食物,碎片,和蛋白水解酶; 免疫原性蛋白; 和mite-associated细菌和真菌产品(4)。 这些组件直接激活protease-activated受体和模式识别受体(PRRs)对于其分子模式或间接激活有关的受体分子模式(2)。 HDM包含几个抗原和nonantigenic组件,从而诱导或修改变应性疾病,但确切的机制HDM-induced过敏反应是复杂的,仍然不完全理解。
数控/ Nga老鼠,近交品系建立了从日本一个昂贵的老鼠,是人类最广泛研究的动物模型。 他们自发地发展广告皮肤瘙痒等症状,红斑、出血、缩放、干燥、脱发(5- - - - - -7)提出了在传统的饲养条件下而不是在安置在特定无菌(SPF)条件(8),这表明上皮暴露于某些过敏原诱发的症状可能是一个重要因素在NC / Nga老鼠。 HDM接触数控/ Nga防晒系数条件下小鼠诱发更严重的皮炎比其他老鼠的菌株(例如,只有C57BL / 6,和BALB / c) (5- - - - - -7)。 这个证据表明皮肤内稳态不是控制在数控/ Nga小鼠上皮HDM。 然而,目前还不清楚为什么NC / HDM Nga老鼠更敏感,以及是否发现研究数控/ Nga小鼠可以应用在其他品系小鼠和人类理解皮炎。 在这项研究中,我们解决了这些问题,表明c型凝集素受体Clec10a (MGL1 / CD301a)中扮演一个重要的角色在皮肤内稳态HDM曝光。
确定遗传因素与过敏有关HDM NC / Nga老鼠,我们执行whole-exome NC / Nga基因组的测序和使用C57BL / 6 j基因组作为参考。 在70772年数控/ Nga基因组变异检测,我们发现7个功能丧失基因突变,特别是存在于NC / Nga老鼠而不是其他19个鼠标菌株S1和图S1A)(表。 其中,我们专注于一个stop-gain突变在C位置(C T)。 706 (p.Q236X)Clec10a(NM_010796) (图1一个)根据其相对较高的表情BioGPS造血细胞基于信息数据库(图S1A) (9)。 编码的蛋白,Clec10a (MGL1 / CD301a),是一个II型跨膜c型凝集素受体家族的成员和感官终端半乳糖的半个外源性和内源性抗原(10- - - - - -13)。 c。 706 c > T数控/ Nga的突变基因的编码区位于c -型lectin-like域(CTLD) (图1,A和B)。
(一个和Bstop-gain突变的DNA测序网站(c.706)Clec10a(NM_010796基因身份证:17312)(A)和Clec10a蛋白质(B)的C57BL / 6 j和NC / Nga老鼠。 白框显示的编码区Clec10a。 TM,跨膜域。 N, N末端。 (C)细胞表面Clec10a议员(CD64的表情+MerTK+)、疾病控制和预防中心(CD64−MerTK−),monocyte-derived DCs (CD64−MerTK罗)在皮肤π−CD45+MHCII+血统(CD3、CD19 NK1.1, Ly-6G)−EpCAM−细胞的C57BL / 6 j和NC / Nga老鼠。 阴影直方图显示染色与同形像控制Ab。D)荧光显微镜从背侧皮肤的组织部分,沾一个anti-Clec10a马伯和DNA结合DAPI染色。 E,表皮。 D,真皮。 酒吧,规模100μm。 (E和F)RAW264.7转染子表达Flag-taggedClec10ac.706C(来自C57BL / 6 j小鼠)-IRES-GFP或Flag-taggedClec10ac.706T(来自数控/ Nga老鼠)-IRES-GFP分析细胞表面(E)或细胞内(F)的表达标记流式细胞术。 数据是代表两个独立的实验。
流式细胞仪显示的存在Clec10a巨噬细胞的细胞表面(MPs) (CD64+MerTK+),传统树突状细胞(cdc) (CD64−MerTK−),monocyte-derived DCs (CD64−MerTK罗皮肤CD45)+MHCII+血统−EpCAM−细胞和国会议员在C57BL / 6 j的腹膜腔,但不是数控/ Nga,老鼠(图1 c和无花果。S1, B和C)。相比之下,nonhematopoietic细胞(CD45−)、CD45+MHCII−细胞,CD45+MHCII+(林EpCAM)+细胞,中性粒细胞(CD45+CD11b+Ly-6G+)在C57BL / 6 j小鼠的皮肤缺少Clec10a表达式(无花果。S1, D和E)。免疫组织化学显示的表达Clec10a皮肤细胞的C57BL / 6 j数控/ Nga老鼠(但不图1 d)。 进一步分析Clec10a表达式的特点在NC / Nga老鼠,我们转染议员RAW264.7细胞与C57BL / 6 j -和NC / Nga-derivedClec10a互补的dna(互补)标记Flag-encoding序列和携带内部核糖体进入site-green荧光蛋白(IRES-GFP) 3′末端序列。 国旗是转染子的表达在细胞表面表达C57BL / 6 j Clec10a但不是数控/ Nga Clec10a (图1 e)。 然而,转染子表达NC / Nga Clec10a显示细胞内表达的标志(图1 f)。 这些结果表明,Clec10a突变会损害Clec10a的运输到细胞表面。
检查是否Clec10a数控/ Nga的突变小鼠是参与HDM过敏,我们使用了CRISPR-Cas9系统(14)产生突变NC / Nga老鼠携带的Clec10aC57BL / 6 j小鼠(Clec10ac.706C)而不是本国序列(Clec10ac.706T)(图2一个)。Clec10a信使rna表达在皮肤上的突变NC / Nga老鼠(Clec10ac.706T > C与相比)显著增加Clec10ac.706T老鼠(图S2A)。 数控/ Nga与杂合的老鼠Clec10a等位基因(Clec10ac.706T / C)恢复Clec10a表达在细胞表面的议员在皮肤和腹膜腔(图2,B和C和图开通)。 此外,HDM-induced皮肤炎症的症状,包括红斑、干燥、和表皮厚度增加,改善数控/ Nga的老鼠Clec10a等位基因的C57BL / 6 j小鼠(图2 D G)。 此外,流式细胞术显示,嗜中性粒细胞渗透进入皮肤后6天HDM治疗是减少Clec10ac.706T / C与野生型相比(WT) (Clec10ac.706T / T)数控/ Nga老鼠(图2 h)。 相比之下,血清免疫球蛋白E (IgE)比较两个基因型之间的老鼠(图S2C)。 这些结果表明,Clec10a突变(Clec10ac.706C > T)在NC / Nga老鼠导致过敏症HDM和严重的皮炎但不增加辅助T 2 (TH2)反应。
(一个stop-gain突变的DNA测序网站(c.706)Clec10a数控/ Nga -Clec10ac.706T / C老鼠。 (B)细胞表面Clec10a议员(CD64的表情+MerTK+)、疾病控制和预防中心(CD64−MerTK−),monocyte-derived DCs (CD64−MerTK罗)在皮肤π−CD45+MHCII+血统(CD3、CD19 NK1.1, Ly-6G)−EpCAM−数控/ Nga -细胞Clec10ac.706T / C老鼠。 阴影直方图显示染色与同形像控制Ab。C)荧光显微镜的背侧皮肤组织部分数控/ Nga -Clec10ac.706T / C老鼠,彩色anti-Clec10a马伯和DNA结合DAPI染色。 (D来HHDM药膏是每周两次应用于数控/ Nga -的背侧皮肤Clec10ac.706T / T和Clec10ac.706T / C老鼠。 皮炎分数(D),出现在14天(E),组织学())和表皮厚度(F和G),中性粒细胞的数量(CD11b+Ly-6G+)、嗜酸性粒细胞(CD11b+Siglec-F+),Ly-6C嗨单核细胞(CD11b+Ly-6G−Siglec-F−Ly-6C嗨)在皮肤π−CD45+细胞(H), 100年规模酒吧μm (C、F)。*P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001(单向方差分析与事后测试)。 数据显示平均值±SEM。 数据汇集从四个(D、G和H)实验或代表两个独立的实验。
检查缺陷细胞表面表达Clec10a如何参与HDM过敏,我们使用Clec10a-deficient (Clec10a−−/)对C57BL / 6 j小鼠背景和局部应用HDM背皮肤。 如数控/ Nga小鼠的皮肤,Clec10a−−/老鼠加重皮炎,包括增强的红斑、干燥、表皮厚度,5到6天和增加中性粒细胞的浸润,但不是其他骨髓和淋巴细胞谱系细胞,皮肤在天HDM治疗后1 - 3 (图3 A到E图S3, A到C)与WT C57BL / 6 j小鼠相比。 相比之下,皮肤屏障功能,分析了表层水分损失(TEWL)测试,是WT和之间的可比性Clec10a−−/老鼠(图S3D)。 中性粒细胞的损耗注入anti-Ly-6G抗体皮炎改善的Clec10a−−/老鼠老鼠水平相媲美,在WT (图3,F和G图S3E),表明加重皮炎Clec10a−−/老鼠是依赖于中性粒细胞。
(一个来G)HDM软膏(G)或十二烷基硫酸钠(SDS)单独应用(D)每周两次的背侧皮肤C57BL / 6 j-wt和Clec10a−−/老鼠(F和G)或没有(E)注入控制Ab或anti-Ly-6GαLy-6G Ab。外观(A)和皮炎得分(B)在5天(n= 18)和组织学())和表皮厚度在指定的时间点(C, D, F, G) WT和之间的比较Clec10a−−/老鼠。 酒吧,规模100μm。 流式细胞仪鉴定中性粒细胞(CD11b+Ly-6G+)在皮肤π−CD45+WT细胞和Clec10a−−/老鼠在指定的时间点(E)。H)从WT mRNA的定量rt - pcr分析Clec10a−−/MHCII+国会议员和DCs排序从皮肤在3小时后HDM局部应用程序。 中移动,相对数量。 (我)仪珠阵列(CBA)分析文化的上层清液从HDM-stimulated WTClec10a−−/CD115+纯度的浓缩铀BMMPs (n= 3)。*P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001。 ns,不显著(单向方差分析与事后测试)。 数据显示平均值±SEM。 数据汇集从5 (B和E)或三个(D、G和H)实验或(C)的代表两个或三个(I)独立的实验。
尽管IgG1的血清水平高Clec10a−−/老鼠比WT HDM治疗2周后,小鼠IgE和IgG2c滴度是两个基因型之间的可比性老鼠(图S3F)。 此外,表达Il4和Gata3由CD4+T细胞的淋巴结HDM-treated WT和之间的皮肤相当Clec10a−−/老鼠(图S3G)。 因此,Clec10a可能抑制皮炎通过减少中性粒细胞浸润而不是减少TH2回答。
在真皮MHCII Clec10a表示+国会议员和DCs (图1,C和D)。 相比之下,中性粒细胞和nonhematopoietic皮肤细胞不表达Clec10a HDM治疗后(无花果。S4, A和B)。因此,我们MHCII排序+国会议员和DCs从皮肤细胞WT和样品Clec10a−−/C57BL / 6 j小鼠局部治疗与HDM(图自己)。 我们发现基因表达水平白细胞介素6,处于受控,Cxcl2是高Clec10a−−/比WT议员议员,而这些细胞因子的表达是比较两国DCs的基因型(图3 h)。 这些结果表明,Clec10a议员,而不是DCs,参与镇压HDM-induced中性皮炎。 因为interleukin-17 (IL-17)中性粒细胞性皮炎(15),我们检查了IL-17参与加剧HDM-induced皮炎Clec10a−−/老鼠。 然而,IL-17的比例+主要IL-17-secreting真皮γδT细胞,细胞在皮肤上,可比WT -Clec10a−−/皮肤(无花果。S4, D和E),这表明IL-17没有参与增强中性粒细胞性皮炎Clec10a−−/的皮肤。
对于体外分析,我们生成的骨骨髓来源从WT和巨噬细胞(BMMPs)Clec10a−−/C57BL / 6 j小鼠(图S4F)。 因为HDM包含组2过敏原和内毒素的toll样受体4 (TLR4)配体(16- - - - - -18),我们分析了TLR4的表达水平和MP标记。 他们是两种基因型的CD115之间的可比性+BMMPs(图S4G)。 HDM体外刺激后,Clec10a−−/BMMPs分泌大量的中性粒细胞化学引诱物,如il - 6,处于受控,CCL3,和TNF-α(肿瘤坏死factor-α),比WT BMMPs (图3我)。 此外,尽管结肠议员Clec10a−−/老鼠据报道,产生更少的il - 10在WT老鼠与硫酸葡聚糖sodium-induced结肠炎模型(13),Il10皮肤和皮肤MHCII表达式+国会议员WT和之间的可比性Clec10a−−/HDM应用程序(图S4H)后小鼠。 同样,BMMPs来自Clec10ac.706T / T数控/ Nga小鼠产生更高水平的细胞因子与产量Clec10ac.706T / CBMMPs(图S4I)。 在一起,这些结果说明Clec10a抑制炎性细胞因子的细胞表面表达生产真皮议员和抑制中性粒细胞性皮炎后HDM应用程序。
Clec10a包含一个酪氨酸残(3)的胞质部分,这是一个组件的一个假定的hemi-immunoreceptor tyrosine-based激活主题(hemITAM; YxxL)(图S5A)。 而BMMP转染子表达WT (C57BL / 6 j) Clec10a显示酪氨酸的磷酸化Clec10a与HDM刺激后,酪氨酸磷酸化Clec10a时没有检测到突变残留3 (Y3F),尽管Clec10a细胞表面表达的影响(图S5, B, D)。我们发现酪氨酸磷酸化HDM刺激后大幅减少Clec10a时表示Tlr4−−/BMMPs (图4和图S5E),表明HDM-induced Clec10a依赖TLR4的酪氨酸磷酸化。 此外,tak - 242,一个化合物,特别是抑制TLR4信号通过绑定到人数/ il - 1受体域(图S5F) (19),减少HDM-induced WT和炎性细胞因子的生产Clec10a−−/BMMPs (图4 b)。 值得注意的是,tak - 242降低炎性细胞因子的生产Clec10a−−/BMMPs水平与WT BMMPs (图4 b),这表明,而TLR4介导HDM-induced促炎细胞因子的生产,这也是参与Clec10a-associated抑制细胞因子的生产。
(一个)WT,Tlr4−−/,Clec10a−−/BMMPs被刺激的HDM表示,紧随其后的是免疫沉淀反应(IP)的溶解产物马伯Clec10a和免疫印迹(IB)分析使用Abs phosphotyrosine (pTyr)或Clec10a。 (B)从WT和CBA的分析文化上层清液Clec10a−−/CD115+纯度的浓缩铀BMMPs使用0.5μM tak - 242和刺激HDM 6小时(n= 3)。CWT和Clec10a−−/CD115+纯度的浓缩铀BMMPs被刺激的HDM表示时间,其次是IB使用马伯phospho-Syk (pSyk; Y519/520)或麦克米兰。 (D和E与WT) BMMP转染或Y3F Clec10a或空向量(EV) (D)和WTClec10a−−/第四BMMPs使用或没有麦克米兰抑制剂(E)和HDM刺激,其次是IP的溶解产物马伯Clec10a和IB使用Abs麦克米兰,SHP-1或Clec10a。 箭头表示感兴趣的分子的重链(黑色)或IP-Ab(白色)。 中移动,相对数量。 *P< 0.05和* *P< 0.01(单向方差分析与事后测试)。 数据显示平均值±SEM。 数据是代表三个独立的实验。
Clec10a-associated压制HDM-induced细胞因子的生产让我们问hemITAM序列Clec10a有抑制,而非激活函数。 刺激与HDM导致脾酪氨酸激酶激活(麦克米兰在WT (C57BL / 6 j),但不是Clec10a−−/BMMPs (图4摄氏度和图S5G)。 此外,HDM刺激诱导麦克米兰和Src相同地区的招聘2 domain-containing phosphatase-1 Clec10a (SHP-1),这个招聘是依赖Clec10a的酪氨酸残基(图4 d和图S5H)。 治疗的BMMPs麦克米兰抑制剂抑制HDM-induced SHP-1招聘Clec10a (图4 e和图S5I),这表明这个事件是依赖麦克米兰激活,符合监管信号通过“抑制ITAM”(20.- - - - - -22)。
以前的研究已经表明HDM组件包含糖化蛋白抗原和多糖(23,24)。 测试是否Clec10a承认糖化HDM的组件,我们生成的核转录因子激活的T细胞(NFAT)记者gfp细胞(25)组成细胞外的嵌合融合蛋白表达和跨膜部分鼠标Clec10a CD3ζ的胞质部分熔融。 鼠标Clec10a记者细胞表达绿色荧光蛋白在应对刘易斯X, Clec10a的寡糖配体(10),但不是刘易斯Y(无花果。S6, A和B)。我们发现鼠标Clec10a记者细胞表达GFP在回应plate-coated HDM剂量依赖性的方式(图5)。 此外,记者的预处理细胞anti-Clec10a单克隆抗体(mAb)或半乳糖,但不是葡萄糖和甘露糖,抑制GFP表达(图5 B和C)。 此外,治疗HDM牛乳糖但不是甘露糖苷酶与能力下降导致记者GFP表达细胞(图5 d)。 这些结果表明,通过其galactose-binding网站,Clec10a HDM直接绑定到galactosylated组成部分。
(一个来F和我)GFP的表达细胞刺激后鼠标Clec10a-CD3ζ或父母的记者。 (D)记者细胞被刺激的plate-coated HDM表示浓度(一个); plate-coated HDM(20μg /毫升)的老鼠IgG2a或anti-Clec10a马伯(B); 半乳糖(加)、葡萄糖(相关),或甘露糖(人)(C); plate-coated HDM治疗或不与牛乳糖(GALase)或甘露糖苷酶(MANase) (D)。(E, F,我)记者细胞被刺激与Clec10a-L HDM拆除(PD) Clec10a-Fc或控制人类免疫球蛋白(E),基于每个大小的一部分Clec10a-L (F),或Clec10a-L处理或不PNGase F或氢氧化钠(我)。统计分析是由使用PBS-stimulated样本作为控制(F)。F来H)Clec10a-L与Clec10a-Fc免疫印迹(H F)之前或之后(H)治疗PNGase F或氢氧化钠或沾有或没有阿尔新蓝银(G)。JClec10a-L)凝集素芯片分析。 黑条表明凝集素,结合Galβ(1 - 3)GalNAc (T抗原)。 GalNAc,N-acetylgalactosamine。 GlcNAc,N乙酰氨基葡萄糖。 (K)在HDM Clec10a-L的示意图。 T, T抗原(Galβ(1 - 3)GalNAc]。 Tn, Tn抗原(αGalNAc)。 LacNAc,N乙酰-D-lactosamine [Galβ(1 - 4)GlcNAc]。 *P< 0.05和* * *P< 0.001(单向方差分析与事后测试)。 数据显示平均值±SEM (n= 3)。数据是代表两个(G J)或三个独立的实验。
描述HDM Clec10a配体(Clec10a-L),我们生成的嵌合融合蛋白组成的细胞外部分鼠标Clec10a融合的Fc部分人类IgG1 (Clec10a-Fc),并绑定到路易斯X而不是刘易斯Y(图S6C)。 使用下拉试验从HDM Clec10a-Fc,我们孤立分子大小的Clec10a-L ~ 225 kDa,在鼠标能够诱导GFP表达Clec10a记者细胞(图5中,E和F和图S6D)。 Clec10a-L由阿尔新蓝染色和银,但不是单靠银(图5克和图S6E),表明Clec10a-L是带负电荷的,高度糖基化的蛋白(26)。 解离O-linked聚糖治疗氢氧化钠,废除了Clec10a-Fc绑定表位(图5 h和图S6F)及其活动导致鼠标Clec10a记者GFP表达细胞(图5我)。 相比之下,肽N糖苷酶F (PNGase F)水解N-linked聚糖,对Clec10a-L(没有任何影响图5中,H和I和图S6F)。 这些结果表明,Clec10a承认一个O-linked Clec10a-L多糖。 此外,外源凝集素芯片分析表明Clec10a-L包含T抗原(Galβ(1 - 3)GalNAc]和Tn抗原(αGalNAc),这是普通mucin-type O-glycan核心结构,有或没有LacNAc抗原决定基[Galβ(1 - 4)GlcNAc],高度mucin-type O-glycan (图5 j和表S2)。 值得注意的是,绑定到一个凝集素的Clec10a-L最为强烈Maclura pomifera(MPA),最好是认识到高密度多价T和Tn的抗原(27)。 相反,多糖微阵列分析表明Clec10a-Fc绑定到T和Tn抗原(表S3)。 总之,这些结果表明,Clec10a-L mucin-like分子(图5 k)。
基本的局部比对搜索工具(爆炸;https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)揭示了氨基酸序列相似性最高人类之间的CTLD asialoglycoprotein受体1 (Asgr1)和鼠标Clec10a编码ASGR1(基因身份证:432)CLEC10A分别(基因身份证:10462)。 尽管人类Asgr1 Clec10a HDM刺激记者细胞表达绿色荧光蛋白(图6和图S7A),添加半乳糖抑制HDM-induced GFP表达只在Asgr1记者细胞(图6 b和图S7B)。 此外,hemITAM观察序列(YxxL)只有在人类Asgr1 (图6 c)。 这些结果表明,Asgr1人类是一个结构和功能对应的Clec10a老鼠。 Clec10a-L HDM诱导GFP表达在人类Asgr1记者细胞(图6 d)。 类似于鼠标Clec10a皮肤,免疫组织化学分析表明,Asgr1议员(CD68表示+)和non-MP (CD68−在人类皮肤细胞(图6 e)。Asgr1信使rna被报道有两个剪接变异体,编码膜和可溶性类型缺乏跨膜部分(28)。 我们发现Asgr1 non-cell-associated地区似乎也发现,这可能是来自于可溶性类型。 击倒的ASGR1在人类monocyte-derived培养议员由小型干扰RNA (siRNA)增强炎性细胞因子分泌,以应对HDM (图6 f和图S7C),这表明Asgr1调节人类HDM-induced皮炎。 在一起,这些结果表明,c型凝集素受体如Asgr1在人类和小鼠Clec10a识别HDM mucin-like分子和发挥重要作用在皮肤内稳态HDM入侵引起的炎症。
(一个和B)GFP的表达人类Asgr1-CD3ζ记者细胞刺激后plate-coated HDM没有(A)或(B)存在半乳糖、葡萄糖、甘露糖。 (C氨基酸序列的胞内的部分鼠标Clec10a,人类Asgr1 (hAsgr1),和人类Clec10a。 假定的hemITAM序列是强调。 (D)GFP的表达人类Asgr1-CD3ζ记者细胞刺激plate-coated Clec10a-L推倒Clec10a-Fc从HDM老鼠。 (E)荧光显微镜从人体皮肤组织切片,染色anti-Asgr1帕布,anti-CD68马伯,DNA结合DAPI染色。 酒吧,规模100μm。 (F从人类CD14) CBA分析文化的上层清液+monocyte-derived议员siRNA或阻止特定处理控制ASGR1和刺激HDM 6小时。 *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001(单向方差分析与事后测试(B)或未配对的双尾学生的t测试(F)]。 数据显示平均值±SEM (n= 3)。数据是代表两个独立的实验。
检查的功能角色HDM组件Clec10a-L TLR4-mediated信号引起的皮炎,我们从HDM连同一个局部应用Clec10a-L纯化大肠杆菌派生的脂多糖(LPS)作为WT的背侧皮肤和TLR4受体激动剂Clec10a−−/在C57BL / 6 j小鼠背景。 我们发现治疗Clec10a-L减少表皮厚度和中性粒细胞浸润在WT老鼠而不是Clec10a−−/老鼠(图7 A到C),这表明通过Clec10a Clec10a-L LPS-induced皮炎改善。 值得注意的是,治疗Clec10a-L,有限合伙人一起,增加中性粒细胞招募,但不是表皮厚度,而有限合伙人单独Clec10a−−/老鼠(图7中,B和C),这表明Clec10a-L可能包含组件除了Clec10a-binding分子介导的中性粒细胞招募Clec10a-independent信号。 尽管如此,因为HDM包含TLR4配体,这些结果支持一个场景,在该场景中,一个HDM组件Clec10a mucin-like分子结合,抑制促炎细胞因子引起的生产HDM-derived TLR4配体(图7 d)。
(一个和B)有限合伙人有或没有Clec10a-L应用每天背C57BL / 6 j-wt和皮肤Clec10a−−/老鼠。 组织学())和表皮厚度在5天WT和之间的比较Clec10a−−/老鼠。 酒吧,规模100μm。 (C)中性粒细胞(CD11b+Ly-6G+)皮肤数字(1厘米2WT)和Clec10a−−/小鼠6小时后应用有限合伙人有或没有Clec10a-L。 (D)一个假设的模型Clec10a的作用在皮肤内稳态HDM曝光。 *P< 0.05和* *P< 0.01(单向方差分析与事后测试)。 数据显示平均值±SEM。 数据是代表两个独立的实验。
在这项研究中,我们发现stop-gain突变Clec10a(c。 706 c > T, p.Q236X)数控/ Nga小鼠会损害Clec10a的运输到细胞表面。 这些结果表明,c端地区CTLD(问236到S304)Clec10a中扮演着一个关键的角色在细胞表面表达,与以前的报告,一致C-tail II型的长度短跨膜蛋白损害他们插入到内质网的膜和细胞表面定位(29)。 Clec10a c端地区是如何参与到细胞表面表达不清楚。 我们的发现表明,Clec10a突变负责HDM过敏和皮肤炎症在NC / Nga老鼠。 值得注意的是,尽管NC / Nga老鼠也显示增加血清水平的IgE, Clec10a没有参与IgE抗体反应后HDM应用程序在数控/ Nga小鼠C57BL / 6 j小鼠,与先前的报道一致,皮炎和hyper-IgE生产数控/ Nga老鼠监管不同(30.)。
我们证明缺乏细胞表面表达Clec10a皮肤议员增强炎症细胞因子的生产,导致中性粒细胞增加招聘在皮肤上。 损耗的中性粒细胞HDM-induced皮肤炎症改善,表明中性粒细胞中发挥核心作用皮炎在这个模型的发展。 这些结果与之前的研究相一致,中性粒细胞参与患者的病理生理学的广告在某些情况下严重的广告(31- - - - - -33)。
我们发现Clec10a抑制炎性细胞因子引起的生产TLR4信号在HDM刺激。 这些结果表明,HDM既包含Clec10a和TLR4的配体。 可以与TLR4 Clec10a-L形式复杂的配体在HDM之间的距离,促进Clec10a和TLR4有效信号相声的议员。 在当前的研究结果的基础上,我们提出一个模型HDM-stimulated议员的监管机制激活Clec10a和TLR4。 即,尽管HDM刺激激活Clec10a和TLR4 TLR4信号需要酪氨酸的磷酸化Clec10a麦克米兰和招聘,然后诱导SHP-1招聘和激活。 SHP-1反过来抑制TLR4信号对炎性细胞因子的生产。 因此,hemITAM Clec10a细胞质区域的功能作为抑制ITAM (20.- - - - - -22)。 先前的报道表明,由低亲和力受体的接触或low-avidity配体可能产生瞬态招聘麦克米兰ITAM和抑制信号转导通过SHP-1 (21,22),这表明Clec10a皮肤议员与配体结合HDM亲和力和/或活动性较低。
几个c型凝集素受体,如Dectin-1 Dectin-2,甘露糖受体(CD206)和DC-SIGN表示在肺结合DCs HDM组件和参与过敏性哮喘(23,34- - - - - -36)。 这些受体激活DCs加剧过敏性气道炎症。 相比之下,Dectin-1表达在上皮细胞识别原肌球蛋白来源于节肢动物,包括HDM和抑制IL-33生产(37)。 然而,碳水化合物HDM组件的一部分被这些c型凝集素受体仍未确定。 在目前的研究中,我们表明,Clec10a承认HDM mucin-like分子,抑制,而非激活,议员在皮肤上,导致抑制HDM-induced皮炎的发展。
我们表明,Clec10a-L HDM是一个高度糖mucin-like分子和反LPS-induced皮炎具有抑制作用。 最近的证据表明,mucin-type O-glycans显示不同的生物学性质。 他们通过结构调控免疫反应与各种终端糖调节与细胞表面受体的相互作用和其他分子(38)。 例如,mucin-like O-glycans CA125和标记- 72表达肿瘤绑定到c型凝集素受体与肿瘤有关议员(TAM)和调节细胞因子产品TAM对immune-suppressive概要文件(39)或抑制自然杀伤(NK)细胞介导细胞毒性对肿瘤细胞(40)。 这些观察表明,mucin-like O-glycans表达肿瘤免疫逃逸。 许多原生动物寄生虫的表面,包括鲁兹锥体覆盖着黏蛋白(41),这与Siglec-E通过唾液酸t . cruzi黏蛋白,导致免疫逃避的t . cruzi通过抑制免疫激活(41)。
我们证明了人类Clec10a HDM通过碳水化合物绑定特异性结合不同于鼠标Clec10a,符合以前的报告(10,42)。 相反,我们发现,人类Asgr1和鼠标Clec10a绑定到HDM通过其galactose-binding网站。 考虑到表达谱和分子和人类Asgr1的功能特征,我们认为Asgr1,而不是Clec10a Clec10a是一种人类的老鼠。 尽管人类已知Asgr1表达肝细胞和骨髓细胞(43- - - - - -45),与冠心病和肝硬化的发展和癌症(45,46),Asgr1仍然完全模糊的功能。 我们不仅表明,老鼠Clec10a也是人类Asgr1绑定到同一个mucin-like O-glycan HDM和抑制炎性细胞因子分泌HDM刺激后的议员。 在一起,这些结果表明,老鼠Clec10a和人类Asgr1可能发挥重要作用在皮肤内稳态上皮HDM。 Asgr1是否参与人类AD病理是一个重要的问题。 Asgr1表达降低可能导致HDM-induced皮肤炎症的发展广告。 我们证明Clec10a参与TLR4 ligand-induced中性皮肤炎症,而不是TH2的反应,在老鼠身上。 因此,Asgr1表达的下调也可能参与的发展广告以外的皮炎。 在这些患者以及患者的广告,瘙痒和抓挠损害皮肤的屏障功能,增加TLR4配体的渗透性HDM或革兰氏阴性细菌,进一步加剧了皮肤炎症。 然而,全基因组关联研究显示没有单核苷酸多态性ASGR1与广告相关联。 Asgr1表达的调控机制仍未确定,是一个有趣的问题澄清; 这将促进皮肤炎症的研究在许多类型的皮炎。
在目前的研究中,我们表明,mucin-like分子中包含HDM是Clec10a配体在人类和小鼠和Asgr1抑制TLR4 ligand-induced炎性细胞因子生产的议员。 然而,仍然有几个问题需要澄清:(i)配体是否确实是来自HDM或其他HDM-associated生物,(ii)是否没有核心的糖蛋白或糖基化的分子蛋白质,(3)什么是它的分子和结构特点,并(iv)黏蛋白是否来自其他生物体或细胞有相似属性的HDM配体。 未来的研究需要解决这些重要问题。
本研究的目的是了解HDM引起的免疫反应的调节机制。 对于这个目标,我们的基因组分析数控/ Nga鼠标显示过敏症HDM发现一个因果的突变Clec10a。 因此,我们研究了鼠标的功能Clec10a及其人类相同器官,Asgr1,响应中包含的刺激与配体HDM体内和体外HDM-induced皮炎的上下文中使用转基因小鼠和人类的样本,如本节所述。
数控/ Nga老鼠从查尔斯河实验室购买日本(日本横滨)。 数控/ Nga -Clec10a706 t > C老鼠作为补充材料和方法描述,生成NC / Nga -Clec10a706 T / T(WT)同窝出生仔畜控制被用于实验。Clec10a−−/在C57BL / 6 j小鼠背景生成,如前所述(13,47)。Clec10a−−/老鼠和控制WT防晒系数条件下小鼠饲养动物的同一房间设施筑波大学的。Tlr4−−/在C57BL / 6 j小鼠背景从东方Bioservice购买(日本京都)。 所有的动物实验研究中进行人道收到动物伦理委员会的批准后实验动物资源中心,筑波大学(没有。 18 - 266),按照“基本方针正确开展动物实验及相关活动的学术研究机构”教育部管辖,文化,体育,科学和技术。
外周血单核细胞与健康志愿者的血。 皮肤组织得到健康的区域的皮肤活检标本从患者的皮肤肿瘤筑波大学医院,日本。 获得了书面知情同意的患者和健康志愿者。 本研究伦理审查委员会批准的筑波大学的(没有。 234 - 1,h30 - 127)。
在这项研究中使用的抗体是可用的辅助材料。
DNA提取数控/ Nga小鼠的血用QIAamp DNA血液迷你包(Venlo试剂盒,荷兰)适合老鼠的DNA提取的优化。 外显子组测序根据协议执行中描述SureSelect图书馆准备工具包(post-pool版本4,安捷伦科技,圣克拉拉,CA)和SureSelect鼠标将所有外显子(安捷伦科技)。 DNA库进行乳液聚合酶链反应(PCR)(固体EZ珠乳化剂装备,热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)对珠子产生克隆DNA片段,紧随其后的是珠浓缩(固体EZ珠浓缩设备,热费希尔科学)。 丰富模板珠子测序在固体5500 xl音序器单头,60-base一对(bp)读取(热费希尔科学)。 固体5500 xl输出读取一致反对老鼠基因组参考序列(NCBI37 / mm9)使用LifeScope版本2.5.1(生命技术)来生成BAM文件。 变体调用执行根据协议所描述的基因组分析工具包(GATK),皮卡德(http://broadinstitute.github.io/picard),SAMtools,只读取映射到参考基因组中一个独特的位置。 变体被使用注释ANNOVAR软件(48)。 在近交品系小鼠遗传变异,除了NC / Nga获得释放rel - 1211,根据NCBIm37装配编号(www.sanger.ac.uk /科学/数据/ mouse-genomes-project),老鼠基因组信息学网站(www.informatics.jax.org/)。 桑格测序进行使用BigDye终结者v1.1循环测序工具包(热费希尔科学)ABI 3130 xl基因分析仪(热费希尔科学)。
比较了70772年对C57BL / 6 j小鼠基因组变异的外显子数控/ Nga基因组。 GATK输出所产生的变异与低质量的价值观被过滤掉,导致一个新的共有64518个变异。 丧失变体包括stop-gain和移码突变选择使用ANNOVAR软件。 34816其实或剪接变异包含共有35 stop-gain突变,48移码突变引入停止密码子被确定。 每种83个基因是手动检查,46个基因变异在43个被选为进一步桑格序列验证。 桑格的引物序列的列表验证表所示S1。
在46变异识别,24经Sanger测序(表S1)。 区分潜在的致病性变异与其他变体,我们过滤掉变异存在于17近交品系的实验室老鼠和两种菌株的日本的老鼠,因此专注于剩下的7个基因变异在七(表S1,以粗体显示)。 最后,我们选择Clec10a从七个基因的表达在造血细胞,BioGPS中的信息数据库的基础上(图S1A) (9)。
的pX330质粒(目录号 42230年,剑桥,MA)被用作CRISPR表达载体。 坚持1341英国石油公司上游和下游682 bp的c。T706,我们分别插入20-nucleotide序列(5′-GGATACTGGTGAAGACACGG-3′, 5′-AGAGGATAAATGTTAGATTG-3′)pX330在这些网站,从而获得质粒px330 - - 1314和px330 -下降- 682,分别。 此外,我们构建了捐赠的质粒DNA (p706-donor)诱导单碱基替换(c。 706年数控/ Nga - T > CClec10a)。 的p706-donor质粒携带5′(1255个基点),中央(2024个基点),和3′(1364个基点)同源性武器,c。 706 c序列同源臂中部和限制性内切酶识别序列(Xho我和新人道)在每个边界的同源性武器。
我们注射孕马血清促性腺激素(5 U)到老鼠每个20女NC / Nga(10周的年龄),注射48小时后与人类绒毛膜促性腺激素(5 U),并收集了756年未孕卵母细胞的输卵管。 体外受精的卵母细胞是由使用数控/ Nga精子,和551年原核的阶段获得的胚胎。 因此,DNA的混合pX330-up-1314 (5 ng/μl), pX330-down-682 (5 ng/μl), and p706-donor (10 ng/μl) was injected into their pronucleus; the 276 two-cell embryos that survived were then transferred into pseudopregnant ICR mice, and 28 pups were obtained. A single pup carried the target point mutation without pX330 random integration.
To isolate skin cells from naïve and HDM-applied mice, shaved dorsal skin samples were minced by using scissors and incubated for 60 min in collagenase II (200 U/ml; Worthington Biochemical, Lakewood, NJ) in RPMI 1640 medium containing deoxyribonuclease I (50 U/ml; Worthington Biochemical) and 10% fetal bovine serum (FBS). Additional dissociation and homogenization were performed by using a gentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Cell preparations were filtered through a 55-μm nylon mesh to obtain single-cell suspensions. Peritoneal cavity cells were harvested from naïve mice and then filtered through a 55-μm nylon mesh to obtain single-cell suspensions.
Flow cytometric analyses and cell sorting were performed by using FACS LSRFortessa and FACS Aria flow cytometers (BD Biosciences), respectively. FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR) was used for data analyses. Dead cells were stained and excluded using propidium iodide solution (catalog no. P4864, Sigma-Aldrich).
For histologic analysis, dorsal skin samples from mice were fixed in formalin, embedded in paraffin, and sectioned at 4 μm. Fixed sections were stained with hematoxylin and eosin (H&E) and analyzed by light microscopy. Epidermal thickness was measured at five locations per field and in three or five fields per mouse.
For immunohistochemistry, skin tissues from mice were embedded in Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature Compound (Sakura Finetek Japan, Tokyo, Japan) and stored at −80°C. For immunohistochemistry, 4-μm sections were used. The sections were washed and rehydrated in phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.05% Tween 20 (PBS-T; pH 7.4) and incubated in Blocking One Histo (Nacalai, Kyoto, Japan) at room temperature for 10 min; sections were then washed with PBS-T, incubated overnight at 4°C with anti-Clec10a mAb, washed with PBS-T, and then incubated for 1 hour with Alexa Fluor 546–conjugated anti-rat IgG polyclonal antibody (pAb). After thorough washing with PBS-T, sections were counterstained with the nuclear counterstain 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (VectaShield, Vector Laboratories).
Human skin tissues were resected at the marginal healthy area of biopsy specimen from patients with skin tumor, fixed in formalin, embedded in paraffin, and sectioned at 4 μm. The sections were deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol, and blocked for endogenous peroxidase with methanol; sections were then stained with anti-CD68 and anti-Asgr1 antibodies (Abs) according to the manufacturer’s instructions of the Opal 4-Color Automation IHC Kit (catalog no. NEL820001KT, PerkinElmer, Waltham, MA). Briefly, the sections were incubated for 15 min at 95°C, washed with tris-buffered saline (TBS) containing 0.05% Tween 20 (TBS-T) (catalog no. T9142, Takara Bio, Shiga, Japan), and treated with the blocking solution for 10 min at room temperature. The sections were then incubated with anti-CD68 Ab or mouse IgG1 overnight at 4°C, washed with TBS-T, and incubated with the Opalpolymer horseradish peroxidase (HRP) for 30 min at room temperature in a humidified chamber. After washing with TBS-T, the sections were incubated with Opal Fluorophore Working Solution for 10 min at room temperature in a humidified chamber and washed with TBS-T. Abs for first staining were removed from the sections by heating at 95°C, and the sections were subsequently stained with anti-Asgr1 Ab or rabbit IgG in the same manner as Abs for first staining. Last, the sections were counterstained with spectral DAPI solution.
At the first induction (day 0), the back skin of anesthetized mice was clipped by using electric clippers, and residual hair was depilated by using a hair removal cream. For HDM-induced dermatitis, antigen challenge was performed by using topical application of 100 mg of HDM (Dermatophagoides farinae) ointment (Biostir, Kobe, Japan) on the dorsal shaved skin. From the second induction downward, barrier disruption was achieved by applying 150 μl of 4% sodium dodecyl sulfate to the dorsal skin at 2 hours before HDM ointment application. These procedures were repeated twice each week. Each of several factors—erythema/hemorrhage and scarring/dryness—was scored on days 3, 6, 14, and 21 as 0 (none), 1 (mild), 2 (moderate), or 3 (severe) according to the manufacturer’s instructions (Biostir). The sum of these individual scores was taken as the overall dermatitis score. For depletion of neutrophils, 400 μg of control rat IgG (catalog no. BE0094, Bio X cell, West Lebanon, NH) or anti–Ly-6G Ab (1A8) (catalog no. BP0075, Bio X cell) was injected intraperitoneally 1 day before HDM application.
LPS-induced皮炎,抗原的挑战是执行胶带剥离后的背刮皮肤局部应用有限合伙人(从50μg大肠杆菌O111: B4,目录没有。 L2630 Sigma-Aldrich),模拟中包含HDM TLR4受体激动剂(17,18一起),或没有Clec10a-L推倒从170年μg HDM通过嵌合的融合蛋白组成的细胞外部分鼠标Clec10a融合人类免疫球蛋白的Fc (Clec10a-Fc)。 胶带剥离和抗原的挑战是每天重复。 分析了中性粒细胞招募6小时后第一个抗原的挑战,和皮肤组织学分析使用5天。
TEWL WT的背皮肤和测量Clec10a−−/老鼠Tewameter TM 300(积分、东京、日本)脱毛后使用电动快船和脱毛膏。 为每个鼠标测量进行了一式三份。
Clec10a互补获得C57BL / 6 j小鼠或数控/ Nga和标记Flag-encoding序列subcloned入pMXs-IRES-GFP逆转录病毒载体(49,50)。 RAW264.7转染子稳定表达C57BL / 6 j或数控/ Nga-type Clec10a建立了如前所述(51)。
使用鼠标捕获抗体血清IgE测量IgE (r35 - 72)和生物素化的anti-mouse IgE (r35 - 118),其次是HRP-conjugated链霉亲和素(目录号 RPN1231V,通用电气医疗集团,芝加哥,IL)。 纯化小鼠IgE (C38-2 BD生物科学)是用于标准。 使用鼠标捕获抗体血清IgG1测量IgG1 (A85-3)和鼠标IgG1 HRP-conjugated抗体。 纯化小鼠IgG1 (107.3, BD生物科学)是用于标准。 血清IgG2c被老鼠ELISA定量检测(目录没有设置。 Bethyl e90——136年,蒙哥马利,TX)。
皮肤细胞的幼稚或HDM-applied老鼠孤立的背侧皮肤和孵化完成RPMI 1640包含10%的边后卫和brefeldin(10μg /毫升; Sigma-Aldrich) 3小时。
细胞被收获,resuspended,细胞内细胞因子染色(修复&烫细胞透化作用工具包,目录没有。 GAS004热费希尔科学)根据制造商的指示,并通过流式细胞术分析。
骨髓细胞培养在培养皿(产品没有。 430166(直径6厘米)或430167(10厘米直径),康宁,纽约康宁]完全RPMI 1640包含10%的边后卫的集落刺激因子(gm - csf) (10 ng / ml; 研发系统)和il - 4 (7 ng / ml; 日本大阪,Wako)。 2天,70%的不依从细胞被移除,新的媒介与gm - csf和il - 4是补充道。 5天,100%的不依从细胞被洗与PBS和新鲜培养基与gm - csf补充道。 7天,所有与PBS不依从细胞被洗,和贴壁细胞用于以下实验。 分析细胞因子分泌和麦克米兰磷酸化,CD115+BMMPs被使用anti-CD115 Ab (BioLegend)和浓缩anti-rat免疫球蛋白微(Miltenyi研究)。
CD115+纯度的浓缩铀BMMPs刺激了HDM(100μg /毫升)(d . farinae)提取(Cosmo生物、东京、日本),有限合伙人(1 ng / ml)或Pam2CSK4 (200 pg / ml)的存在与否0.5μM tak - 242 (TLR4抑制剂,默克公司)15分钟。6小时的刺激后,文化收集上层清液,每个细胞因子的浓度取决于使用仪珠阵列分析(BD生物科学)。
总RNA提取利用等基因试剂(日本东京日本基因)通过流式细胞术从皮肤组织或细胞分类:皮肤议员(CD45+MHCII+CD3−CD19−NK1.1−Ly-6G−EpCAM−CD64+)、DCs (CD45+MHCII+CD3−CD19−NK1.1−Ly-6G−EpCAM−CD64−),或者CD3+CD4+细胞skin-draining淋巴结。 互补脱氧核糖核酸合成通过使用高容量RNA-to-cDNA工具包(应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA)。 的表达Clec10a和炎性细胞因子基因通过定量实时聚合酶链反应(rt - PCR)测定分析,由使用SYBR绿色主人混合(应用生物系统公司)和特定的引物。 的Gapdh表达水平是作为内部控制规范化数据。 目标基因的引物序列可用的辅助材料。
WT Clec10a cDNA subcloned进入pMXs-puro逆转录病毒载体(细胞生物学实验室,圣地亚哥,CA)。 生成一个特定站点Clec10a突变,PCR引物设计中含有苯丙氨酸的密码子(TTC)而不是酪氨酸(TAC; Y3F构造)。 WT和突变的互补被测序验证。 逆转录病毒是由使转染293 gp包装细胞生成的WT或突变Y3F cDNA空G水泡性口炎病毒的糖蛋白(VSV-G)表达载体,pCMV-VSV-G (52)。 BMMPs感染逆转录病毒上清液补充聚凝胺(8μg /毫升; 分别Sigma-Aldrich)天2和4。 板离心机在1100年g在32°C 2小时,之后上层的“(分泌物)颗粒被删除,取而代之的是新鲜BMMP培养基。 在第五天,媒介是新鲜BMMP培养基所取代。 7天,不依从细胞被洗了PBS,贴壁细胞用于实验。
鼠标Clec10a-Fc嵌合(Clec10a-Fc)构造是由克隆生成的细胞外部分鼠标Clec10a到pME18S表达载体包含人类IgG1 Fc的一部分。 Clec10a-Fc构造与Lipofectamine 2000(目录没有转染。 11668019,热费希尔科学)在Opti-MEM HEK293T细胞培养(目录号 31985070,热费希尔科学)。 转染介质与GIT中(目录没有取代。 16041000,Kohjin-Bio、埼玉县、日本),然后Clec10a-Fc蛋白质纯化从文化上层清液用蛋白琼脂糖(目录没有。 1536153,Bio-Rad实验室、大力神、CA)。
HDM提取包含150毫米生理盐水溶解在缓冲,50毫米三基地,CaCl 1毫米2,0.01%的渐变20受到一个下拉试验通过融合蛋白组成的老鼠的细胞外部分Clec10a融合人类IgG1 N末端的Fc部分(Clec10a-Fc),这是耦合Dynabeads蛋白G(目录没有。 10009 d,热费希尔科学),其次是洗脱与EDTA 30毫米或200毫米半乳糖。 废水与PBS透析使用离心过滤装置(目录没有。 UFC503024,默克公司)和定义为Clec10a-L。
解决了Clec10a-L SDS-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)。 凝胶电泳后,立即去离子水清洗和10%醋酸缓冲(10%乙酸和30%乙醇在去离子水)和阿尔新蓝染不了的解决方案(pH值2.5)(目录号 和光)013 - 13801,kouichi在室温下2小时,其次是使脱色以3%醋酸缓冲(3%乙酸在去离子水)和10%醋酸缓冲。 凝胶被沾染了银根据制造商的指示(皮尔斯银染色设备目录。 24612年,热费希尔科学)。
解决了Clec10a-L sds - page和凝胶被切断了,分为分数根据它们的大小。 凝胶分离机械粉碎和孵化在PBS使用搅拌器(目录号。300 - 95441和382 - 01271年,Nippi,东京,日本)。 上层清液离心分离后收集在17400年g10分钟和透析使用离心过滤装置(目录没有PBS。 UFC503024,默克公司)。
分析麦克米兰磷酸化,BMMPs刺激了HDM提取(100μg /毫升)为0,10日或30分钟37°C; 细胞溶解1% NP-40裂解缓冲; 通过sds - page来解决; 转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)由electroblotting膜; 和免疫印迹anti-phospho-Syk和anti-Syk Ab紧随其后HRP-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白Ab。
分析Clec10a的酪氨酸磷酸化,BMMPs刺激与HDM(100μg /毫升)为0,3,或10分钟37°C; 细胞溶解1% NP-40裂解缓冲; 并与anti-Clec10a马伯免疫沉淀反应。 免疫沉淀反应被转移到PVDF膜如前所述和免疫印迹HRP-conjugated anti-pTyr Ab和anti-Clec10a帕布,其次是HRP-conjugated抗体免疫球蛋白Ab。
分析Clec10a之间的关联和麦克米兰或SHP-1 BMMPs preincubated与否与麦克米兰抑制剂IV(目录。 574714年,默克公司)(5毫米)30分钟37°C; 刺激与HDM为0(100μg /毫升),3、5或10分钟37°C; 细胞溶解0.2%洋地黄皂苷缓冲区; 并与anti-Clec10a马伯免疫沉淀反应。 免疫沉淀反应被转移到PVDF膜如前所述,与anti-Syk免疫印迹,anti-SHP-1,或anti-Clec10a Ab,其次是HRP-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白抗体或免疫球蛋白Ab。蛋白质都是发现通过使用增强化学发光(热费希尔科学)。
Clec10a-L进行预处理或不是PNGase F(拘谨的,目录不。 NZS1, N-Zyme Szientifics Doylestown, PA)在37°C 16小时或0.05 M氢氧化钠在40°C 16小时在95°C热变性后5分钟,然后决定用sds - page,转移到由electroblotting PVDF膜,并与生物素化的免疫印迹Clec10a-Fc HRP-conjugated链霉亲和素紧随其后。
人类的细胞内部分CD3ζ来自于一位向量由l。尼尔(加州大学,旧金山),和跨膜细胞外部分鼠标或人类Clec10a或人类Asgr1 cDNA subcloned进入pMXs-puro逆转录病毒载体(细胞生物学实验室,圣地亚哥,CA)。 2 b4-nfat-gfp记者提供的细胞h . Arase(日本大阪大学)(25)。 2 b4-nfat-gfp记者转染子稳定表达鼠标或人类Clec10a或人类Asgr1建立了如前所述(51)。 记者细胞孵化了18个小时,有或没有anti-Clec10a马伯,路易斯X (GlycoTech,马里兰州),刘易斯Y (GlycoTech),半乳糖(Sigma-Aldrich)、葡萄糖(Sigma-Aldrich),或甘露糖(Sigma-Aldrich),在plate-coated HDM提取治疗或不治疗牛乳糖(目录号。5704 - gh和5549 - gh,研发系统)或甘露糖苷酶(目录没有。 P0768S,新英格兰生物学实验室)或plate-coated Clec10a-L或size-fractionated Clec10a-L。 NFAT-GFP的激活是通过使用流式细胞仪监测。
凝集素芯片生产使用无触点微阵列印刷机器人(MicroSys4000,基因组的解决方案)和次要的修改(如前所述53)。 荧光标记样本与Cy3 Mono-Reactive染料(GE),和过度Cy3与交联葡聚糖被G-25脱盐列(GE)。 在10倍稀释后与探测解决方案[25毫米tris-HCl (pH值7.5)和140毫米氯化钠(TBS)包含2.7毫米氯化钾,CaCl 1毫米21毫米MnCl2特里同x - 100], 1%, Cy3-labeled样本应用于外源凝集素芯片和孵化20°C。 洗后通过探索解决方案,荧光图像获得使用损耗field-activated荧光扫描仪(Bio-Rex扫描200,Rexxam有限公司)。 一式三份的斑点的凝集素信号平均为每个蛋白质样本和归一化相对于96年的平均值凝集素。 凝集素的列表所示表S5。
Glycoconjugate微阵列包含98 glycoconjugates(表S6)是使用MicroSys4000(基因组解决方案)和次要的修改(如前所述54)。 Clec10a-Fc嵌合体(10μg /毫升)precomplexed Cy3-conjugated山羊反人类免疫球蛋白g(1μg /毫升)和Fc(目录没有。 TBST 109-165-098,杰克逊ImmunoResearch)(20毫米tris-HCl缓冲区,0.15 M氯化钠和1% Triton x - 100)包含CaCl 10毫米2或10毫米EDTA与glycoconjugate孵化微阵列(80μl /)一夜之间在20°C。 清洗后,立即获得使用Bio-Rex扫描200荧光图像。
CD14+单核细胞从外周血单核细胞通过丰富anti-CD14微(目录号 130-050-201,Miltenyi研究),培养与gm - csf (10 ng / ml) 2天,转移和培养Accell siRNA-delivery媒体(目录没有。 b - 005000, Dharmacon)包含gm - csf (10 ng / ml)和1μM siRNA具体ASGR1(目录号 e - 013268, SMARTpool Accell siRNA Dharmacon,拉斐特有限公司)或控制核3天,然后刺激HDM提取(100μg /毫升)进行6小时。 文化上层清液中的每个细胞因子的浓度是由使用仪珠阵列分析(BD生物科学)。
统计分析采用单向方差分析(方差分析)与事后测试或双尾学生的tGraphPad软件测试(GraphPad棱镜5日,拉霍亚,CA)如图传说中指定。
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