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动物组织总RNA的提取

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发表时间:2019-05-07 09:56作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

动物组织总RNA的提取


【基本原理】

组织中的RNA主要分布在胞浆中,包括mRNA、tRNA和rRNA三种。mRNA含量最低,半衰期短,易于降解。在RNA 的提取过程中,主要采用强变性剂,如异硫氰酸胍等破坏细胞结构,失活RNA酶。细胞碎片、蛋白质等经酚、氯仿等有机溶剂抽提被去除。RNA提取的关键是防止内源性和广泛存在的外源性RNA酶,如器皿、试剂和手上等存在的RNA酶对核酸的降解作用,所用材料、器皿均需经DEPC处理(包括0.1%溶液浸泡过夜,蒸馏水冲洗及高压灭菌15min去除残存的DEPC)。真核生物中18S rRNA、28S rRNA经琼脂糖电泳后,在紫外灯下可观察到两条清晰的条带。


【器材】

电子天平、匀浆器、Ep 管、冰盒

【试剂】

1.TRIzol试剂(GIBCO BRL)

2.氯仿

3.异丙醇

4.75%乙醇

5.0.1% DEPC处理水


【操作步骤】

1.RNA提取  

(1)称取0.2g新鲜肝组织, 加1ml TRIzol试剂制备肝匀浆,4℃孵育5min。

(2)加0.2 ml氯仿,盖紧盖后用力振摇15Sec ,然后在冰上放置5min。

(3)4℃,12 000×g, 离心15min。

(4)将上层水相移入另一管,加0.5 ml异丙醇,并在冰上孵育10min。                                     

(5)4℃ 12 000×g 离心10min。

(6)弃上清,在沉淀(含RNA)中加1ml 75%乙醇洗涤,旋涡混匀。

(7)4℃,10 000×g 离心5min,得到RNA沉淀。

(8) 空气干燥后,用适量TE或无RNase水溶解备用。

2.RNA含量和纯度测定

分别测定所提取RNA样品的A 260 和A 280,并计算其比值。

3.电泳鉴定。


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