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T细胞衍生的γ干扰素在免疫介导的肠道损伤中导致干细胞死亡

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发表时间:2019-12-09 16:13作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

T细胞衍生的γ干扰素在免疫介导的肠道损伤中导致干细胞死亡

保护肠道干细胞

肠上皮细胞是每周更换,维护这个组织需要快速自我更新 是由肠道干细胞。 这个体内平衡是中断的设置,包括同种异体 骨髓移植。 同种异体骨髓移植后,同种异体T细胞攻击 和杀死肠道细胞interferon-γ(IFNγ)端依赖的方式。 在这里,高岛et al。使用两个 体内移植模型和体外瀑样系统定义的目标IFNγ肠,他们发现IFNγ肠道干细胞的直接目标。 他们进一步表明,JAK / STAT抑制剂可以用于保护肠道干细胞舱从T细胞介导损伤在此设置。

摘要

尽管肠道干细胞的重要性(isc)上皮维护,了解免疫介导的损伤影响的有限isc和他们的利基。 我们发现干细胞舱受伤是一个共享的特性alloreactive和autoreactive肠道免疫病理反应,减少isc和损害他们的复苏在T细胞介导的损伤模型。 尽管成像显示一些T细胞在健康小鼠干细胞室附近,供者T细胞浸润后肠粘膜同种异体骨髓移植(BMT)主要局部地下室地区固有层。 进一步建模与体外上皮文化表示ISC枯竭和人类以及小鼠受损瀑样生存在coculture激活T细胞,并筛选效应途径确定interferon-γ(IFNγ)作为主要中介ISC室损坏。 IFNγ诱导JAK1和STAT1-dependent毒性,发起proapoptotic干细胞基因表达程序和死亡。 BMT IFNγ-deficient供者T细胞,接受者缺乏IFNγ受体(IFNγR)特别是在肠道上皮细胞,并与药物抑制木菠萝信号导致干细胞间的保护。 此外,上皮文化与Paneth cell-deficient瀑样,IFNγR-deficient Paneth细胞,IFNγR-deficient isc,和纯化干细胞殖民地都表明isc的直接目标,并不依赖于损伤Paneth细胞利基。 T细胞激活特异表达和IFNγ生产因此ISC的有力介质损伤,以及封锁JAK / STAT信号在靶组织干细胞可以防止这种T细胞介导的病理反应。

介绍

上皮干细胞的关键生理自我更新以及损伤后的再生(1)。 跨膜蛋白富亮氨酸repeat-containing G protein-coupled受体5 (Lgr5就)标志着地下室基础柱状(isc)肠道干细胞能够再生的细胞在小肠上皮细胞(SI)和大肠(李)(2)。 isc Paneth细胞的后代,Lgr5就提供了一种上皮利基+isc如果通过产生生长因子包括Wnt3和表皮生长因子(EGF) (3.,4)。 尽管重要性上皮干细胞间的维护和胃肠道(GI)损伤后再生(5,6),尽管越来越多的证据表明免疫影响组织再生(7- - - - - -9),几乎没有理解免疫介导的损伤组织干细胞的影响。

胃肠道是一个频繁的组织损伤后同种异体造血和骨髓移植(BMT)和肠道隐窝上皮损伤的特点发现移植物抗宿主病(GVHD)在移植受者(10,11)。 移植物抗宿主病是一种免疫介导的并发症BMT供体攻击T细胞受体的组织。 隐窝包含肠上皮干细胞和祖细胞,据报道,isc和他们Paneth细胞利基减少小鼠GVHD (8,12- - - - - -15)。 然而,导致损失的机制,这些细胞群之间的关系在组织损伤,和这些结果的相关性以外的组织损伤移植设置都知之甚少。

细胞毒性和细胞因子的生产主要效应T细胞的功能,和两个函数研究了在GVHD模型(16- - - - - -29)。 尽管T细胞可以调节胃肠道强有力的组织损伤,细胞因子信号传导和细胞毒性的影响ISC舱并不明确。 炎性细胞因子如interferon-γ(IFNγ)和肿瘤坏死factor-α(TNFα)与损害Paneth细胞利基(30.- - - - - -32),IFNγ有助于减少上皮增殖在小鼠结肠炎(33)。 相比之下如何组3先天淋巴细胞和interleukin-22 ISC (il - 22生成)信号保护、促进上皮再生,也有可能直接ISC和炎性细胞因子之间的相互作用在病理性免疫反应妥协ISC隔间。 我们因此试图检查特定的细胞相互作用和分子机制ISC损失在免疫介导的胃肠道损害。 使用表型和功能的组合特征的ISC舱alloreactive和autoreactive肠道损伤体内之后,加上T细胞的体外模型交互与ISC及其Paneth细胞利基在瀑样文化中,我们发现ISC可以直接的目标T细胞衍生的细胞毒性细胞因子信号。

结果

Alloreactive和autoreactive免疫反应损害ISC隔间

我们第一次评估ISC动力学的临床相关的主要组织相容性复合体(MHC)移植物同种异体BMT模型。 移植后三天,独自BMT接受者接受骨髓(GVHD)或骨髓和T细胞移植物抗宿主病(感应)演示了如果Lgr5就减少+isc与正常小鼠相比图1,A和B,最高)。 BMT后10天,Lgr5就+ISC数字T细胞在移植接受者没有恢复,但ISC数字仍减少GVHD受者移植供者T细胞,证明ISC复苏免疫介导的胃肠道损伤的损伤发生BMT后(图1,A和B,底部)。 相比之下,溶菌酶+Paneth细胞移植后早期数字完好无损,但减少了在小鼠GVHD BMT后第十天(图1 c和图S1A),表明isc之前减少Paneth细胞同种异体BMT后。 测试一个独立的同一性MHC-mismatched模型还演示了快速Lgr5就+ISC减少紧随其后的是实质性的复苏在小鼠GVHD但Lgr5就的持续减少+在T细胞接受者isc (图1 d)。 再一次,减少Paneth细胞在这个模型中仅发生在减少isc (图1 e和图S2)。

图1 Alloreactive和autoreactive免疫反应损伤ISC隔间。

(一个C)LP-into-Lgr5-LacZ-B6 MHC-matched BMT。 (一)代表图像的SI(回肠)Lgr5-LacZ染色BMT后3和10天。 酒吧,500μm(上)或50μm(底部)。 (B) SI ISC频率(n= 8至25独立部分每组)和(C) SI溶菌酶+Paneth细胞频率(n每组)= 6到15个独立部分BMT后3和10天。 (DE)B6-into-Lgr5-LacZ-BDF1 MHC-mismatched BMT, SI ISC频率(D)n每组)= 5到15个独立的部分,和SI溶菌酶+Paneth细胞频率[(E)n每组)= 6到13个独立部分BMT后3和10天。 (FG对待DT) Foxp3-WT Foxp3-DTR老鼠。 如果ISC频率(F)和SI溶菌酶+Paneth细胞频率(G) DT治疗后5天(n每组)= 19到20个独立部分。 NS,不重要。 (H)代表图片和数量的第五天如果从接受者天瀑样3 (H)和10 LP-into-B6 BMT后(I)。 从150年隐窝瀑样文化。 酒吧,500μm(上)或200μm(底部)。n= 3老鼠每组。 (J)第五天SI瀑样数量从150 DT治疗后隐窝收获9天(n每组)= 4老鼠。 数据意味着和扫描电镜; 比较与t测试(两组)或单向方差分析(方差分析)(多个组); *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001。 数据代表的至少两个独立的实验或结合两个实验(E)。

确定这些影响alloreactive损伤和BMT需要具体问题具体分析,我们检查了ISC舱在系统性自身免疫跨越Foxp3白喉毒素受体(DTR)小鼠(34)与Lgr5-LacZ记者。 突变FOXP3基因在人类导致整个(免疫失调,polyendocrinopathy、肠病x连锁)综合症,经常与肠道病理相关(35),Foxp3的消融+调节性T细胞(T海军学校规则)在老鼠身上也会导致快速系统性和肠道免疫反应(36)。 系统性自身免疫的感应DT-mediated T注册消耗很快导致Lgr5就少了+isc,而Paneth细胞数据维护(图1,F和G)。 减少isc因此alloreactive和autoreactive免疫介导的胃肠道损伤的一个共同的特性,和之前发生上皮利基障碍所体现的Paneth细胞缺乏症。

我们下一个评估免疫介导的损伤影响的ISC舱功能,评估体外organoid-forming能力后体内的挑战。 肠隐窝是含有上皮干细胞的功能单元,祖,和小细胞,孤立的隐窝可以生成肠道瀑样体外。 这些瀑样概括与crypt-villus体内肠道组织结构和中央流明(37)。 符合Lgr5就+ISC频率(图1 A, B, D),如果隐窝孤立移植后早期证明显著障碍organoid-forming能力与正常小鼠相比图1 h)。 生成瀑样的功能能力迅速恢复的隐窝老鼠没有移植物抗宿主病,但是瀑样形成仍然受损与同种异体T细胞(BMT后10天图1我)。 同样,与文化从控制老鼠相比,T注册消耗体内明显受损体外瀑样形成孤立的隐窝(图1 j)。 此外,我们还研究了isc的体内功能BMT后利用基因标记的干细胞和他们的后代。 除了Lgr5就,Olfm4也标志着鼠标isc SI, Olfm4-driven Cre表达已被证明是比这更健壮Lgr5就(38)。 我们因此异种BMT执行Olfm4-CreERT2xRosa26记者老鼠,用它莫西芬治疗BMT收件人移植当天激活Cre-driven血统追踪(图S3)。 与正常对照组相比,小鼠移植了从Olfm4降低跟踪+细胞,即使没有供者T细胞,表明ISC损害由于移植前调节。 此外,BMT T细胞导致进一步大幅减少跟踪,提供额外的功能验证的损失的isc移植物抗宿主病(图S3)。 总的来说,alloreactive和autoreactive体内免疫反应导致减少isc和干细胞间的功能障碍。

同种异体T细胞优先入侵BMT后隐窝地区固有层

检查intramucosal本地化的T细胞介导上皮损伤和减少ISC BMT后,我们接下来进行三维(3 d)完整的包埋肠道组织的共焦显微镜。 这种方法最近已确定优先渗透地穴地区同种异体BMT后粘膜(39),但这定位没有区分粘膜的上皮内和固有膜组件,它没有定义在体内平衡。 染色后CD3、细胞核和细胞膜,成像的全层回肠允许精确测定黏膜结构以及精确定位和量化的T细胞上皮和固有层区域如果地下室和绒毛的隔间。 正常B6小鼠表现出类似的T细胞密度在地下室和回肠固有层绒毛地区稳定状态(图2 A和B)。 相比之下,上皮内T细胞丰富得多比在稳态隐窝上皮绒毛上皮细胞(图2 A和B)。

图2 供者T细胞浸润层上皮和固有层BMT后隐窝地区。

3 d包埋immunofluorescent共焦成像的鼠标回肠。 (一个B)T细胞在正常B6小鼠anti-CD3免疫荧光法鉴定。 左(A):代表三维投影图像的全层如果组织分为绒毛和地下室区域,与细胞膜染色(亲脂性的染料; 蓝色)指示组织架构用于区分上皮内淋巴细胞(IELs)和lpl回肠内; 黄色,CD3+IELs; 红色,CD3+lpl。 右:3 d CD3的预测+IELs和CD3+lpl的绒毛和隐窝地区,删除了细胞膜染色和组织取向(因此T细胞内定位3 d组织)所示2 d切片上显示后投影墙。 (B) CD3的量化+IEL和CD3+在正常B6 LPL密度(n每组)= 6独立3 d视图。 (CF使用WT B6) B6-into-LP同种异体BMT进行骨髓和纯化GFP+B6 T细胞,与供者T细胞在上皮所示紫色和供者T细胞在固有层所示绿色。 (C)代表3 D投影和供者T细胞(D)量化的绒毛和地下室区域BMT后4天(n= 24个独立的3 d视图每组从两个移植相结合)。 (E)代表3 d投影和(F)量化供者T细胞的绒毛和地下室区域BMT后7天(n每组)= 12个独立的三维视图。 组织取向和T细胞定位再次表示2 d切片上显示3 d预测的后壁。 图形表示方法和扫描电镜; 比较与t测试; * *P< 0.01和* * *P< 0.001。 数据代表除非另有提到两个独立的实验。

我们下一个评估供体T细胞受体的位置肠道粘膜同种异体BMT后,利用B6-GFP老鼠供者T细胞的来源。 移植后4天,绿色荧光蛋白阳性(GFP的早期浸润+)供体T细胞受体回肠主要是位于地下室的固有层地区,和一些绒毛供者T细胞可以识别(图2,C和D)。 三天后,供者T细胞入侵的粘膜更可观,再一次,大多数供者T细胞是位于地下室地区固有层(图2,E和F)。 与上皮内T细胞在稳态B6回肠,上皮内供者T细胞BMT后1周更频繁的隐窝的绒毛(图2,E和F)。 这些结果表明,供者T细胞调节移植物抗宿主病主要是渗透到地下区域的固有层,在靠近ISC隔间,大多数供者T细胞入侵肠道上皮BMT后也出现在地下室。

激活T细胞产生IFNγ目标肠道上皮细胞,减少isc,消除瀑样体外

调查T细胞衍生的分子调节组织损伤可以通过冗余复杂的效应途径和众多的潜在目标,可能表现出不同的反应类似的分子(16- - - - - -29,40,41)。 此外,一些相互矛盾的实验结果可能是由于,在某种程度上,缺乏模型为研究特定免疫效应器和主细胞之间的相互作用以及挑战破译反应对组织中的特定细胞的子集。 因此,我们试图建立一个模型来研究T细胞之间的相互作用和ISC舱与T细胞体外培养肠道瀑样。 尽管coculture天真的同种异体T细胞没有影响从分离老鼠瀑样细胞再生,alloactivated T细胞显著降低同种异体SI和李瀑样数量浓度的方式(图3和图S4A)。 Coculture多克隆激活同种异体T细胞也受损瀑样的形成,和CD4细胞+和CD8+T细胞能够调解瀑样抑制(无花果。S4, B和C)。除了小鼠cocultures,人类T细胞也抑制基因不同的增长人类十二指肠瀑样(图3 b)。

图3 肠上皮细胞导致T细胞衍生IFNγ目标减少Lgr5就+干细胞。

(一个)如果瀑样量化和代表图像与天真B6瀑样细胞的共培养后或alloactivated BALB / c T细胞(文化7天,n每组)= 3到6井; 酒吧,规模500μm; alloactivation是由培养BALB / c T细胞瀑样之前与B6树突细胞共培养。 (B)代表图片和数量的人类与人类同种异体CD8 SI瀑样培养+T细胞(文化7天,n每组)= 7到13井; 酒吧,规模1000μm。 (C)数量的B6 SI瀑样后文化与anti-CD3 / CD28-activated B6同源的T细胞(文化7天,n每组)= 3井。 (D)人类文化与人类CD4自体后李瀑样+和CD8+T细胞(文化7天,n每组)= 3井。 (E)代表图像和数字文化与后B6 SI瀑样anti-CD3 / CD28-activated BALB / c T细胞和anti-IFNγ中和抗体(文化7天,n每组)= 4井; 酒吧,规模500μm。 (F人类如果瀑样)在文化与人类同种异体T细胞和anti-IFNγ(文化7天,n= 9井每组)。 (G)WT或Ifngr−−/B6 SI瀑样用BALB / c T细胞培养(文化7天,n每组)= 4井。 (H与rmIFNγ)B6 SI瀑样后文化(文化7天,n每组)= 3井。 ()代表图像经过coculture BDF1瀑样细胞,GFP+同种异体B6 T细胞。 顶部具有亮(BF)、荧光(中间),或显示重叠图像(底部); 酒吧、规模50μm。 (J)IFNγ酶联免疫吸附试验的上层清液从文化B6 SI瀑样与BALB / c T细胞(n= 4到8井每组; ND,没有检测到)。 (KLgr5-GFP)流式细胞仪分析isc与rmIFNγ瀑样培养16或72小时(n= 3 - 5井每组)。 数据意味着和扫描电镜; 比较与t测试(两组)或单向方差分析(多个组); *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001。 数据代表的至少两个独立的实验或结合两个或三个(B, F, J)独立的实验。

因为瀑样形成和生存被激活的同种异体T细胞受损,但不是天真的同种异体T细胞(图3),我们假设抗原差异是重要的T细胞激活,但不需要为目标抑制T细胞一旦已经激活。 同系的cocultures alloactivated T细胞或多克隆刺激T细胞受损的老鼠瀑样的可行性(图3 c和图S4D)。 此外,coculturing T细胞和瀑样从同一个捐赠者,激活人类CD4+和CD8+T细胞抑制自体的增长人类结肠瀑样(图3 d)。 这些发现表明,T细胞激活可以影响肠道上皮细胞体外的可行性,即使没有遗传差异与上皮的目标。

定义T细胞毒性效应途径调解瀑样,我们执行cocultures几个条件下与T细胞基因缺陷或中和抗体。 抑制穿孔素、FasL小道,IL-1β,il - 6, IL-17A, il - 22生成时,瀑样数量和TNFα没有影响(无花果。S5, F)。相比之下,T细胞与anti-IFNγcoculture中和抗体恢复小鼠SI瀑样增长(图3 e),IFNγ封锁与中和抗体也保护人类十二指肠瀑样从人类同种异体T细胞(图3 f)。 Anti-IFNγ抗体可以保护瀑样通过防止自分泌/旁分泌IFNγ活动中T细胞或抑制IFNγ瀑样中的信号。 然而,Ifngr−−/T细胞显示完整瀑样抑制(图S5, G和H),而Ifngr−−/瀑样明显抵抗同种异体和同源的T细胞(图3 g和图S5I),表明IFNγcoculture期间针对上皮。

IFNγ就足以调停瀑样毒性,增加重组小鼠IFNγ(rmIFNγ)文化没有T细胞表现出浓度抑制瀑样数字(图3 h)。 跟踪在cocultures用GFP T细胞动力学+T细胞,我们发现,T细胞的频率减少了第四天的文化(图3我和图S4E),这表明IFNγ-mediated瀑样抑制开始头几天内的文化。 与此一致的是,IFNγ检测培养基中coculture的第3天,而浓度降低了第五天(图3 j)。 此外,流式细胞仪分析显示Lgr5-GFP的显著减少ISC与IFNγ瀑样经过16个小时的孵化,这ISC损耗大幅进展72小时后接触IFNγ(图3 k)。

IFNγ项目干细胞死亡,抑制JAK / STAT信号保护isc IFNγ

我们接下来研究信号通路参与IFNγ-mediated瀑样和ISC抑制。 Ruxolitinib是Janus激酶1/2 (JAK1/2)抑制剂能够阻止T细胞的功能,由CD4抑制炎性细胞因子的分泌+T细胞,促进增加Foxp3的频率+T海军学校规则BMT设置(42)。 最近的工作建立了ruxolitinib作为移植物抗宿主病的治疗选择,尤其对于类固醇难治性疾病,它已经获得美国食品和药物管理局批准这个指示(43- - - - - -45)。 然而,潜在的影响ruxolitinib T细胞和目标组织尚未划定。 我们发现ruxolitinib显著保护肠道瀑样从同种异体T细胞体外(图4)。 Ruxolitinib也保护老鼠(图4 b)和人(图4摄氏度)从IFNγ肠道瀑样。 此外,ISC频率明显保存在瀑样培养IFNγruxolitinib的存在,包括在第一个16小时,几乎完全保留部分保存72小时(图4 d)。

图4 从IFNγJAK / STAT抑制保护isc。

(一个)代表图像和数字后B6瀑样的文化与BALB / c T细胞和ruxolitinib (Rux)(文化7天,n每组)= 4井; 酒吧,规模500μm。 (B)数量的B6 SI瀑样细胞与rmIFNγ文化后,ruxolitinib(文化7天,n每组)= 4井。 (C人类如果瀑样培养rhIFNγ(文化)7天,n每组)和ruxolitinib = 3井。 (DLgr5-GFP)流式细胞仪分析isc瀑样培养rmIFNγ和ruxolitinib 16或72小时(n每组)= 3 - 4井。 (E)Jak1-deficient B6 SI瀑样Jak1fl / flxRosa26-CreERT2老鼠用BALB / c T细胞培养或rmIFNγ(文化7天,n每组)= 4井。 (F)地下室pSTAT1西方墨迹30分钟后孵化rmIFNγ±ruxolitinib。 (G)WT或Stat1−−/B6 SI瀑样培养rmIFNγ(文化7天,n每组)= 4井。 图形表示方法和扫描电镜;t测试(两组)或单向方差分析(多个组); *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001。 数据代表至少两个独立的实验。

保护从IFNγ瀑样T细胞的缺失表明ruxolitinib是作用于瀑样自己,调节电阻通过抑制上皮木菠萝信号。 使用瀑样Jak1fl / fl×Rosa26-CreERT2老鼠,我们发现,通过使用4-hydroxytamoxifen瀑样细胞(4-OHT)删除Jak1抵抗同种异体T细胞和IFNγ(图4 e和图S6)。 此外,ruxolitinib阻止磷酸化信号传感器和转录激活1 (Stat1) IFNγSI隐窝(图4 f),Stat1−−/瀑样也耐IFNγ(图4 g)。 我们因此得出结论,同种异体T细胞和IFNγ针对肠道上皮细胞通过Jak1 / STAT1信号和抑制上皮Jak1可以保护肠组织体外免疫介导的损伤。

除了减少isc确认通过流式细胞术(图3 k),定量聚合酶链反应(qPCR)肠道瀑样的分析表明,基因表达与isc (Lgr5就Olfm4)减少迅速在老鼠和人类文化中对待IFNγ(无花果。S7, A和B)。目标基因Wnt信号(Axin2)和Notch信号(Hes1)降低(图S7C),基因表达与Paneth细胞(Lyz1Defa1),肠上皮细胞(支队伍),杯状细胞(Muc2),enteroendocrine细胞(Chga),以及簇细胞(Trpm5)也减少(图S7、D和E)。与这些结果一致,qPCR分析隐窝的GVHD接受者证明降低基因表达与isc (Lgr5就Olfm4),Paneth细胞(Lyz1Defa1),杯状细胞(Muc2),enteroendocrine细胞(Chga),以及簇细胞(Trpm5)与non-GVHD控制相比,而enterocyte-associated支队伍BMT后表情跌甚至没有T细胞(图S7F)。 总的来说,这些基因表达模式建议isc没有迷路,因为增加isc的分化到他们的后代。

我们下一个评估程序性细胞死亡的作用。 基因表达与IFNγ鼠标如果瀑样培养了多个转录变化符合诱导细胞凋亡,凋亡基因的表达Bcl2和Bcl2l1(Bcl-xl)减少和proapoptotic基因的表达贝克增加(图5)。 相似的转录变化观察人类十二指肠瀑样对待IFNγ(图5 b)。 没有观察到凋亡基因表达的变化Mcl1或proapoptotic基因伯灵顿(图S8A)。 此外,膜联蛋白V分析显示膜联蛋白增加+DAPI和膜联蛋白+DAPI+Lgr5-GFP+细胞IFNγ治疗后,符合早期凋亡和死亡ISC增加,尽管已经有统计上显著的减少在ISC频率点(图5中,C和D)。 增加细胞凋亡也发现在人类肠道瀑样与IFNγ孵化,由caspase-3/7活动增加,证实了增加检测裂解caspase-3 (图5中,E和F)。 此外,ruxolitinib抑制proapoptotic转录改变肠道瀑样对待IFNγ(图5克),因此专门木菠萝信号与凋亡表现型。 因此,总的来说,体外实验表明,T细胞诱导瀑样通过IFNγ毒性,它激活JAK1-dependent STAT1上皮细胞内的激活,导致凋亡转录程序以及isc的损失。

图5 IFNγ项目干细胞死亡。

(一个)Apoptosis-related基因表达与rmIFNγ鼠标SI瀑样培养6小时(n每组)= 6井; Mann-WhitneyU分析。 (B)Apoptosis-related基因表达在人类如果瀑样培养rhIFNγ24小时(n= 9到10井每组数据来自三个不同的SI捐助者); Mann-WhitneyU分析。 (CD)流式细胞仪的情节(C)和量化Lgr5-GFP (D)细胞和膜联蛋白V SI瀑样的分析与rmIFNγ培养16个小时(n每组)= 4井。 (E)相对caspase-3/7活动Caspase-Glo分析评估; 褶皱增加了基线与rhIFNγ治疗后24小时(n每组)= 6井。 (F)人类瀑样裂解caspase-3免疫印迹和rhIFNγ经过48小时的潜伏期。 (G)Apoptosis-related基因表达在鼠标SI瀑样培养rmIFNγ和ruxolitinib 24小时(n每组)= 6井; 克鲁斯卡尔-沃利斯的分析。 图形表示方法和扫描电镜; 比较与t测试(两组)或单向方差分析(多个组),除非另有说明; *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001。 数据是代表两个或两个组合来自两个独立实验(E)。

T细胞衍生IFNγ促进干细胞凋亡和肠道病理免疫介导体内胃肠道损害

我们接下来试图评估IFNγ作用的T细胞介导干细胞损伤体内。 Anti-IFNγ抗体治疗后同种异体BMT显著保护ISC数字Lgr5-LacZ记者老鼠(图6)。 此外,anti-IFNγ中和抗体增加ISC频率在自身免疫T后发生注册损耗(图6 b)。 此外,ruxolitinib治疗显著保护isc移植受者同种异体BMT后(图6 c和图印地)。

图6 T细胞衍生IFNγ减少isc体内。

(一个后10天)isc LP-into-B6 BMT同形像或anti-IFNγ抗体。 代表图像和SI Lgr5-LacZ的频率+isc (n每组)= 15到27个独立部分; 酒吧,500μm(上)或50μm(底部)。 (B)如果Lgr5就+isc在Foxp3-DTR+或Foxp3-DTRLgr5-LacZ记者老鼠DT治疗后5天一起同形像或anti-IFNγ抗体(n每组)= 29到31个独立部分。 (C)如果Lgr5-LacZ的频率+isc与车辆或ruxolitinib LP-into-B6 BMT后10天(n每组)= 6到10的独立部分。 (D)如果Lgr5-LacZ的频率+isc B6-into-BDF1 BMT WT或后10天Ifng−−/骨髓(n每组)= 5到13个独立部分。 (E)B6-into-BDF1 BMT WT或Ifng−−/T细胞。 (E) SI Lgr5-LacZ的频率+isc (n每组)= 5到11个独立部分。 移植物抗宿主病(F)肠组织病理学评分BMT后10天(n= 6到12老鼠)。 (G)地下室数字(n每组)= 6 - 21个独立部分,绒毛削弱组织病理学评分(n= 6到12老鼠BMT后10天每组)。 (H)代表Ki67的图像和定量免疫组织化学(包含IHC)地下室面积BMT后10天(n= 47 77隐窝每组); 酒吧,规模100μm。 (我)Apoptosis-related基因表达在鼠标SI BMT后10天隐窝(n= 10老鼠; Mann-WhitneyU分析)。 (J)图像和量化的地穴裂解caspase-3包含IHC BMT后10天。 箭头表示裂解caspase-3+凋亡隐窝细胞(n每组)= 489 - 974隐窝; 酒吧、规模50μm。 (K)量化的地穴TUNEL染色BMT后10天(n每组)= 251 - 491隐窝。 (L)的双重immunofluorescent染色β-Gal(绿色)和裂解caspase-3(红色)从Lgr5-LacZ接受者老鼠BMT后10天。 代表图像和平均频率caspase-3分开+每只老鼠回肠凋亡isc Lgr5就总数的百分比+isc检测显示; 酒吧、规模50μm。 (M)第五天SI瀑样数量每100隐窝培养BMT后10天(n= 5到7小鼠每组)。 图表展示方式和扫描电镜; 比较与t测试(两组)或单向方差分析(多个组),除非另有说明; *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001。 数据是代表两个或两个组合从两个(A, B, F, G,和我)独立的实验。

减少体内源的识别IFNγ促进ISC BMT后,我们首先表型IFNγ+细胞移植受者的粘膜。 机械分离绒毛丰富后隐窝地区组织,固有层淋巴细胞(lpl)孤立和孵化前与高尔基体抑制剂IFNγ分析。 实质上,更多IFNγ+在收件人肠粘膜细胞识别同种异体BMT比同系的BMT后,和绝大多数的IFNγ+细胞识别供者T细胞(图S9, A和B)。进一步分析T-bet表示+TH1(辅助T 1) T细胞的活化表型(无花果。S9, C和D)。

我们下一个评估donor-derived IFNγ功能。 而移植Ifng−−/捐献骨髓并不影响ISC数字(图6 d),同种异体BMTIfng−−/供者T细胞导致大大增强ISC恢复(图6 e),确认供者T细胞减少IFNγ导致ISC的重要来源。 此外,更广泛的组织病理分析BMT后Ifng−−/供者T细胞显示显著减少整体移植物抗宿主病病理,包括减少SI地穴损失和绒毛削弱(图6,F和G,图就是S1C)。 此外,我们观察到增加上皮增殖和组织损伤发生移植物抗宿主病,也大大降低了接受者IFNγ-deficient T细胞(图6小时)。

类似于基因表达变化引起IFNγ体外,qPCR BMT后隐窝孤立的分析显示,增加Bcl2,增加Bcl2l1,减少Bak1在接受Ifng−−/T细胞(图6我)。 此外,anti-cleaved caspase-3和TUNEL末端原位脱氧尿苷三磷酸尼克结束标签)染色都表示显著降低小鼠移植隐窝细胞凋亡Ifng−−/T细胞(图6中,J L)。 此外,anti-cleaved caspase-3和anti-β-galactosidase(β-Gal)双immunofluorescent染色证明凋亡Lgr5就+isc GVHD, caspase-3分开的频率+isc显著降低小鼠接受Ifng−−/T细胞(图6 l和图S10)。 最后,如果隐窝隔绝的接受者Ifng−−/瀑样形成T细胞表现出显著大于隐窝与野生型小鼠移植(WT) T细胞(图6米),指示功能改进除了组织学改善。 总体而言,体内研究从而减少支持ISC的体外研究结果引起T细胞衍生IFNγ和JAK / STAT信号。

isc IFNγ直接目标和凋亡

鉴于IFNγ受体广泛表达(IFNγR)在很多细胞,T细胞衍生IFNγ体内可能有许多目标,从而间接影响干细胞的隔间。 检查是否T细胞衍生IFNγ是针对接收者上皮直接体内,我们进行同种异体BMTIfngr1fl / fl×Villin-Cre(IfngrΔIEC老鼠)。 染色从接受者Olfm4表明目标删除IFNγR肠上皮明显Olfm4保护+isc从同种异体T细胞(图7和图S1D)。IfngrΔIEC收件人还演示了减少整体移植物抗宿主病病理,大地穴数字,减少绒毛削弱,隐窝细胞凋亡明显较低(图7 B D)。

图7 isc IFNγ直接目标和凋亡。

(一个D)同种异体B10。 Br-into-B6(喂)或同源的B6-into-B6 (Syn) BMT使用Ifngrfl / fl×Villin-Cre(IfngrΔIEC)或Cre-negativeIfngrfl / fl(IfngrWT)同窝出生仔畜控制。 (一)代表图像和SI(回肠)包含IHC Olfm4频率+isc BMT后7天(n每组)= 6到17个独立部分; 酒吧,规模100μm。 移植物抗宿主病(B)肠组织病理学评分BMT后9天(n= 3 - 5老鼠每组)。 (C)地下室量化(n每组)= 9到17个独立部分,绒毛削弱病理评分BMT后9天(n= 3 - 5老鼠每组)。 (D)量化的地穴裂解caspase-3 (cCaspase-3)包含IHC BMT后9天(n每组)= 489 - 974隐窝。 (E流式细胞仪分析CD119 (IFNγR1)表情isc和Paneth细胞。 (F)数量的B6 SI瀑样后7天文化与BALB / c T细胞±Wnt3a和Jagged1 (n每组)= 3井。 (G)Paneth cell-deficientAtoh1ΔIEC如果瀑样培养在WNT3-supplemented ENR媒介±7天BALB / c T细胞或IFNγ(n每组)= 4井。 (H)从sort-purified SI Lgr5-GFP SI瀑样isc和sort-purified Paneth细胞培养7天±BALB / c T细胞(n= 3到6井每组)。 ()RNA序列指示排序Lgr5-GFP IFNγ-responsive基因表达isc孵化与IFNγ1.5小时。 (J)从排序WT或瀑样Ifngr−−/Lgr5-GFP如果isc培养6天±BALB / c T细胞(n= 7到8井每组)。 (K)ISC殖民地培养与组蛋白脱乙酰酶WENR GSK3β抑制±IFNγ。 (K)的代表共焦图像裂解caspase-3 (cCaspase-3)免疫荧光ISC殖民地培养±IFNγ(文化6天; 箭头表示凋亡isc细胞层; 箭头显示凋亡isc的殖民地腔); 酒吧、规模50μm。 (L)的频率cCaspase-3上皮细胞层+isc (n= 40到72每组)殖民地。 腔地区(M) cCaspase-3染色强度(n每组)= 76年至136年殖民地。 盟,任意单位。 (N) qPCR apoptosis-related分析基因在小鼠SI ISC殖民地培养rmIFNγ24小时(n= 6井每组; Mann-WhitneyU分析)。 (阿Q)代表图像和生存能力量化与IFNγISC殖民地培养。 图像显示亮场(上),赫斯特染色(中间),或propidium碘(底部); 酒吧,规模200μm。 (O) Lgr5-GFP的图像+SI ISC殖民地培养与rmIFNγ±半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPh(文化天7)。(P)的图像如果ISC殖民地开始从排序WT或贝克/伯灵顿双淘汰赛(DKO) SI ISC培养IFNγ(文化天7)。(Q)量化ISC殖民地生存与IFNγ培养后(n每组)= 3殖民地;t在每个IFNγ浓度测试。 图形表示方法和扫描电镜; 用单向方差分析进行比较,除非另有说明。 *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001。 数据代表的至少两个或两个结合三个独立实验(I)。

这些结果表明,IFNγ可以直接作用于肠上皮细胞,但它仍可能影响isc是次要目标其他肠道上皮细胞群。 地下室基础isc Paneth等肠道上皮细胞上增殖细胞,产生许多支持性因素如Wnt3、EGF和切口配体(4)。 因为Paneth细胞频率和基因表达减少我们的实验(图1,C和E和无花果。 开通和S7、D和F)和IFNγ可以诱导细胞凋亡和损失Paneth细胞(30.,31),ISC减少和消除瀑样可能是由于间接影响造成损害Paneth细胞利基。 Fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)分析证实表达IFNγR1 CD119 Paneth细胞和isc (图7 e和图S2A)。 鉴于ISC-restricted Cre-driven体内基因删除是不可能的因为基因操纵isc迅速传递给后代(比移植物抗宿主病病理生理学,有时更快更快动力学动力学比遗传操纵清单isc内的蛋白质水平的变化),因此,我们研究了体外T细胞介导损伤是否由于isc的目标或Paneth细胞。 反对Paneth细胞定位的重要作用,补充的培养基Paneth Wnt3细胞衍生因子和Jagged1没有保护肠道瀑样从T细胞(图7 f)。 同样,预防Paneth细胞目标通过使用Paneth cell-deficientAtoh1ΔIEC瀑样没有保护从T细胞或IFNγ瀑样(图7 g)。 我们接下来cocultured纯化isc和纯化Paneth细胞这样瀑样形成从isc依赖Paneth细胞提供的支持。 然而,文化和WTIfngr−−/Paneth细胞仍然敏感的T细胞(图7 h)。 此外,RNA序列排序Lgr5就细胞接触后1.5小时IFNγ显示几个IFNγ-related基因的上调,确认直接活动IFNγisc (图7我)。 此外,瀑样增长显著降低了WT isc coculture与同种异体T细胞,但是Ifngr−−/isc演示完整organoid-forming能力,因此对T细胞介导的抑制(图7 j)。

排除的可能性WT ISC的文化敏感IFNγ因为损害他们的直接后代和进一步评估的直接影响IFNγISC上,我们使用niche-independent高纯ISC文化系统几乎完全由Lgr5就组成+细胞(46)。 结合糖原合成酶激酶3β(GSK3β)和组蛋白脱乙酰酶抑制剂使同质文化对称分裂Lgr5就+从净化ISC ISC殖民地,尽管强有力的Wnt和切口途径激活维护Lgr5就很高+频率(图S8B), IFNγ直接诱导细胞凋亡在ISC殖民地(图7 k)。 染色就是明证caspase-3裂解,凋亡isc确定细胞层内的殖民地8小时后(达到顶峰图7中,K和L在殖民地腔),随后积累(图7中,K和M)。 基因表达分析显示相同的凋亡程序中确定瀑样接触IFNγ,下调的Bcl2Bcl2l1,老年病贝克的表达,并没有明显的变化Mcl1伯灵顿(图7 n和图S8C)。 IFNγ-induced ISC细胞凋亡也导致大量殖民地死亡证实了propidium碘吸收(图7中,O和P)。 此外,添加pan-caspase抑制剂Q-VD-Oph WT ISC殖民地(图7中,O和Q)或基因删除贝克伯灵顿使用来自double-deficient ISC殖民地(贝克−−//伯灵顿fl / fl×Rosa26-CreERT2)小鼠(图7,P和Q)维持生存能力尽管接触IFNγISC殖民地。 总之,T细胞衍生IFNγ直接针对肠道上皮细胞,导致ISC减少肠道病理,IFNγ诱导贝克/ Bax-dependent ISC凋亡通过直接作用于干细胞本身。

讨论

T细胞介导的组织损伤,特别是在BMT设置,是系统性的顶点的过程涉及细胞活化、迁移、和效应功能。 鉴于这种复杂性和众多的参与细胞类型在不同组织在特定的时间点,它是具有挑战性的,全面而准确地阐明具体的T细胞和个体之间的相互作用发生的子集肠道上皮细胞。 为了克服这些限制,我们建立了体外coculture肠道瀑样和T细胞体系。 使用这个系统模型T cell-induced ISC损坏,我们发现了一个直接作用的T细胞衍生IFNγ和随后的JAK / STAT信号ISC凋亡发生在免疫介导的胃肠道损伤。 符合这个cytokine-mediated病理学,包埋三维显微镜同种异体BMT后表明,移植后供者T细胞入侵SI主要渗透的固有层地下室隔间。 供者T细胞因此入侵肠道黏膜干细胞附近但大多是不正是有针对性的上皮内。 进一步分析这些T细胞的证实,他们IFNγ的主要来源。 令人惊讶的是,一些T细胞存在内隐窝上皮在基线,因为大多数在绒毛上皮内T细胞被发现。 固有层显示大致相似的地穴内T细胞密度在基线和绒毛地区,所以优先渗透后隐窝地区同种异体BMT代表大量的重新分配本地化回肠粘膜内的T细胞。 最近的一项研究表明,CD4献血者的损耗+BMT后立即T细胞导致增加血清IFNγ和减少肠道移植物抗宿主病病理捐赠CD8较少+T细胞在冒号(47从供者T细胞),这表明IFNγ接近隐窝室,而不是IFNγ出现在循环,可能是至关重要的,它直接上皮毒性。

虽然幼稚T细胞在上皮生长没有影响体外培养,激活T细胞诱导isc的毒性和大幅下降。 这并不需要T细胞和上皮细胞之间的基因差异目标T细胞被激活后,导致抑制同种异体和同系的小鼠肠道瀑样。 在人类模型也是如此,人类T细胞消除同种异体瀑样甚至消除自体瀑样。 这是由T细胞衍生IFNγ,也诱导ISC减少观察体外和体内。 抗原特异性的体外模型依赖于初始T细胞活化,导致大量IFNγ的生产。 这些结果符合实验表明炎性细胞因子可以调解组织损伤诱导同种异体T细胞无论由上皮细胞抗原表达(48),尽管由上皮细胞抗原表达包括isc可能某些免疫反应的关键(49- - - - - -51)。

IFNγ对胃肠道的影响一直在研究各种实验模型,并据报道诱导上皮毒性通过细胞自动和时滞负监管反馈循环(33,52,53)。 IFNγ也被发现诱导损失Paneth感染细胞模型和自身免疫(30.,31)。 移植模型的研究已确定,病理和保护角色IFNγ移植物抗宿主病,如下面所讨论的。 然而,几乎没有探索isc和IFNγ之间的直接交互。 这里的独家使用的主要细胞,包含完整的谱系多样性出现在正常上皮组织,允许识别isc T细胞介导cytokine-dependent胃肠道损伤的直接目标。 这将不可能与典型的细胞系缺乏干细胞隔间。 我们发现,减少isc之前任何Paneth细胞免疫介导的胃肠道损伤的减少。 减少isc使用两个不同的功能验证方法:培养瀑样从隐窝孤立后体内的挑战和子代干细胞谱系追踪。 功能性方法符合动力学由ISC量化表示。 此外,这些动力学表明,isc是主要目标,尽管isc下降也可能是由于细分功能障碍,而不是损失的利基。 尽管Paneth细胞干细胞利基的并不是唯一的组件,其中包括基质和免疫成员(8,9,14,54,55),并考虑也应该支付给祖细胞和成熟的上皮细胞,全面了解肠道免疫病理(56- - - - - -59),体外模拟显示IFNγR-deficient isc抗T细胞和IFNγ,而niche-dependent文化的isc IFNγR-deficient Paneth niche-independent干细胞的细胞以及文化殖民地都没有。 因此这些发现表明isc是T细胞的直接目标和IFNγ。

干细胞间的进一步调查表明IFNγ可以直接程序ISC死亡。 bcl - 2和BCL-Xl凋亡bcl - 2家族成员,下调可能导致激活proapoptotic效应器伯灵顿和贝克(60)。 激活伯灵顿和贝克可以形成低聚物,permeabilize线粒体外膜和释放细胞色素c激活还存在,进一步传播凋亡级联(61)。 的下调Bcl2Bcl2l1的老年病贝克,以及稳定的表达伯灵顿,表明细胞凋亡的起始isc IFNγ的主要直接影响。 此外,我们观察到caspase-3活动增加和裂解caspase-3蛋白质在人类瀑样IFNγ对待。 体内IFNγ信号与中和抗体,封锁IFNγ删除从供者T细胞,从肠道上皮IFNγR删除,ruxolitinib所有保护isc T细胞体内。 尽管IFNγ的特定角色可能GVHD模型之间的不同和自身免疫,这些结果表明,IFNγ是T的强有力的中介cell-induced ISC障碍,分泌细胞因子可以杀死干细胞通过激活JAK / STAT信号和程序性细胞死亡。

因为它的多效性的影响,IFNγ在各种BMT模型演示了明显不同的影响。 缺乏donor-derived IFNγ导致移植物抗宿主病死亡率增加CD8和有限的抗肿瘤免疫+T细胞移植的实验模型(28)。 随后研究表明反对IFNγ的影响在不同的组织中,肺部IFNγ发挥防护作用,但在小鼠GVHD调解胃肠道毒性(18),另一项研究表明,IFNγ可以减少肠道后移植物抗宿主病病理CD4的损耗+T细胞(47)。 这些研究说明的复杂作用IFNγBMT后,和不良的并发症可能针对临床IFNγBMT的结果。 IFNγ信号并由JAK / STAT通路(62),它可以代表另一种方法干扰IFNγ-mediated GI isc的伤亡和损失。 Ruxolitinib治疗保护isc从T细胞介导损伤体外和体内。 尽管木菠萝抑制可以抑制T细胞活动(42),我们发现它也保护肠上皮细胞从T细胞介导损伤组织通过抑制T细胞的反应。 木菠萝抑制移植物抗宿主病的临床(已被调查43- - - - - -45),它最近被批准用于类固醇耐火GVHD。 木菠萝抑制剂提供一种很有前途的方法保护ISC舱的病理性免疫反应。 此外,这些发现表明,在GVHD木菠萝抑制的效果,尤其是在设置其他免疫抑制剂已经失败了,可能是由于抑制移植物抗宿主病靶器官内的病理细胞因子信号。

总之,我们发现损坏ISC GVHD舱是一个共享的特点和自身免疫,和T细胞衍生IFNγISC减少的一个重要中介在免疫介导的胃肠道损伤。 肠道瀑样文化被用来测定上皮功能在体内免疫介导的损伤和询问具体来自体内的T细胞和上皮细胞之间的相互作用的目标。 肠道粘膜内T细胞定位实质上不同稳态与环境具有重要的意义,与供者T细胞主要是本地化的固有层地下室地区IFNγ的主要生产商。 直接有针对性的isc IFNγ,诱导基因表达程序导致干细胞凋亡,和木菠萝抑制保护isc IFNγ抑制T细胞的反应。 IFNγ从而发挥了核心作用的T细胞介导干细胞损伤,和木菠萝抑制剂可能提供临床有效的免疫抑制部分通过抑制组织病理信号从免疫系统的反应。

材料和方法

研究设计

这项研究的目的是探讨T细胞机制对isc在免疫介导的胃肠道损伤的影响。 我们使用两种类型的体内动物模型:同种异体BMT和T注册depletion-induced自身免疫。 进行详细的评估直接T细胞之间的相互作用和isc,我们建立了一个coculturing T细胞与肠道瀑样的方法。 分析与组织学染色实验,3 d成像,流式细胞术,qPCR和免疫印迹。 下面将描述统计问题。 没有预定义的研究终点。 试验一般至少执行两次,图传说中描述和统计方法。 要想知道更多的细节,请见补充材料和方法。


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