活化人CD4+T细胞表达半胱氨酸和胱氨酸转运蛋白

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发表时间：2019-12-08 19:26作者：武汉新启迪Xinqidi来源：www.qidibio.com

活化人CD4+T细胞表达半胱氨酸和胱氨酸转运蛋白

摘要

由于天真的T细胞由于缺乏胱氨酸转运体而无法导入胱氨酸，提示T细胞的激活依赖于抗原提呈细胞产生的半胱氨酸。本研究的目的是确定在T细胞活化过程中需要哪些阶段需要外源性胱氨酸/半胱氨酸，以及T细胞如何满足这一要求。我们发现T细胞的早期激活与外源性胱氨酸/半胱氨酸无关，而T细胞的增殖与外源性胱氨酸/半胱氨酸的摄取密切相关。天真的T细胞不表达或很低水平的胱氨酸和半胱氨酸转运蛋白。然而，我们发现这些转运蛋白在T细胞活化过程中会发生强烈的上调，并向活化的T细胞提供T细胞增殖所需的胱氨酸/半胱氨酸。因此，T细胞具有使T细胞独立于抗原提呈细胞产生半胱氨酸的激活和增殖的机制。

导言

三肽谷胱甘肽(GSH)是一种普遍存在的细胞内肽，具有抗氧化防御、维持硫醇状态和调节细胞增殖等多种功能。GSH在T细胞功能中起着至关重要的作用，一些研究发现T细胞活化过程中细胞内GSH的增加是T细胞增殖的必要条件。1,2,3,4...谷胱甘肽是在胞浆中以严格调控的方式合成的，半胱氨酸(Cys)是一种限制性氨基酸。5...理论上，T细胞可以通过Cys的转运或被称为胱氨酸(Cys)的氧化的二聚体形式获得Cys。2)来自细胞外空间，或通过转硫途径从蛋氨酸(Met)内源产生Cys。6...T细胞中是否存在转硫途径是一个有争议的问题。一些研究证实T细胞中存在转硫途径。6,7而其他研究认为T细胞缺乏这一途径8,9.

由于氧化环境，约90%的Cys被发现为氧化Cys。2在细胞外空间。因此，等离子体含有50-100 mCys。2，而与其他氨基酸相比，Cys的浓度很低。10,11...CYS主要通过中性氨基酸转运体ASCT 1和ASCT 2在质膜上运输，而Cys则主要通过2只由x运输c−胱氨酸/谷氨酸转运体12,13...进口Cys2由于细胞内环境的减少，细胞液中的Cys迅速减少。通过测量Cys和Cys的吸收量2以前的研究间接表明T细胞表达ASCT 1和/或ASCT 2转运蛋白，而不是x。c−14,15...在此基础上，提出活化抗原提呈细胞(APC)可向T细胞提供足够高浓度的外源性cys，而活化T细胞则需要这种acc生成的cys。16,17...最近证实，天真的未受刺激的T细胞不表达x。c−胱氨酸/谷氨酸反转运体，但有趣的是，T细胞的激活也诱导了x的表达。c−6,18...这表明T细胞在激活后早期就不再需要apc生成的cys，提示atc生成的cys是启动T细胞活化的关键。18...因此，该模型预测，在免疫反应的早期阶段，APC通过摄取氧化的Cys来培养T细胞。2释放赛斯。释放的Cys然后被天真的T细胞通过其ASCT转运蛋白内化。随后，活化的T细胞可以通过摄取Cys来满足对Cys的要求。2通过x的诱导表达c−从而独立于APC生成的Cys19,20...然而，关于依赖apc生成的cys来早期激活T细胞的提议与其他研究相矛盾，这些研究表明，在没有apc的情况下，纯化的T细胞可以完全激活。4,21...本研究的目的是确定纯化的T细胞Cys在激活过程中的哪个阶段是必需的，以及T细胞如何才能满足这一要求。我们发现CD 25和CD 69检测的早期T细胞活性与Cys无关，而T细胞增殖则严格依赖于Cys。T细胞的激活导致了对两种细胞的强烈上调。2运输机xc−Cys转运蛋白ASCT 1和ASCT 2与Cys无关。T细胞完全独立于APC，完全独立于Cys。2或通过激活诱导的xc−、ASCT 1和ASCT 2转运蛋白。

结果

早期T细胞的激活与Cys和Met无关，而T细胞的增殖则严格依赖于Cys。

为了研究T细胞的同质性，我们纯化了抗原-无经验的天真的CD4。+从健康献血者血样中提取T细胞。由此产生的细胞群体包括∼98%CD4+、CD45RA+、CD 25−、CD 69−T细胞(补充图1s)。为了研究Cys和Met对T细胞活化的要求，我们用抗CD3和抗CD 28包被Dynabeads的方法，在不添加或不添加Met、Cys的无Met培养基中刺激纯化的T细胞。2或者两者的结合。我们发现CD 25和CD 69表达的早期T细胞活化与cys无关。2和Met，虽然在添加Cys的培养基中CD 25在刺激细胞中的表达较高。2 (图1 a-D)。同样，IL-2的生产也独立于cys。2和大都会(图1英、法)。相反，T细胞增殖的测量3胸腺嘧啶核苷掺入严格依赖于cys。2在两个赛斯都在场的情况下是最优的2和大都会(图1g)。测定Cys的最低浓度2最优T细胞增殖所需的Met，我们接着进行了Cys的棋盘滴定。2还有大都会。我们发现Cys的最低浓度2最佳T细胞增殖所需的Met分别为66和33μm。图1H)。因此，正常的血浆Cys250-100 M的浓度似乎完全满足了Cys的要求。2T细胞增殖的要求。在没有赛斯的情况下2T细胞增殖不受Met浓度的影响。相反，在没有Met的情况下，只添加22 M的Cys2导致T细胞显著增殖(图1H).

活化T细胞强上调Cys转运蛋白2和赛斯

上述实验表明，早期T细胞的激活与Cys和Met无关，而T细胞的增殖则严格依赖于Cys。这表明T细胞具有或获得转运Cys的能力。2和/或Cys在质膜激活过程中。此外，实验证明，如果T细胞具有转硫途径，这是不够有效的，以满足对Cys在T细胞增殖过程中的要求。xc−胱氨酸/谷氨酸转运蛋白2在质膜上是由重亚基4f2hc(Cd 98)和轻亚基xct(基因名称)组成的二硫键杂二聚体。SLC7A11)13...CD 98参与将异二聚体转运到质膜，而xct则赋予cys特异性。2...CD 98是各种氨基酸转运蛋白的亚基，因此是普遍表达的。鉴于xc−是Cys唯一已知的传送者2，Cys的几种转运体存在，其中最重要的是中性氨基酸转运蛋白ASCT 1(基因名称)。SLC1A4)和ASCT 2(基因名称)SLC1A5)22,23...确定x的表达式级别c−、CD4上的ASCT 1和ASCT 2+T细胞在X-体15培养基中刺激细胞0~72h，检测这些转运体的蛋白和基因表达水平。我们发现未经刺激的天真CD4+Westernblot分析显示T细胞不表达XCT和ASCT 2或表达极低水平的XCT和ASCT 2。图2A)。我们不能确定ASCT 1的蛋白水平，因为没有合适的抗ASCT 1抗体可用于westernblot分析。T细胞刺激对XCT和ASCT 2均有较强的上调作用(图2A)。基因表达分析表明，转运体基因在幼稚T细胞中弱表达，T细胞活化后，转运蛋白基因明显上调。图2B&C)。特别是XCT基因相对于管家基因gapdh(图2C)。与此相一致，我们发现fcs分析显示CD 98有显著的上调(图2D).

都是xc-胱氨酸/谷氨酸转运体和中性氨基酸转运体可向T细胞提供所需的Cys。

上述研究表明CD4+T细胞开始表达高水平的cys。2激活后的Cys转运蛋白。由于氧化环境的原因，绝大多数的Cys被发现为氧化的Cys。2在细胞外空间和大多数细胞生长培养基中，大约10%的细胞在这些部位被发现为cys。10...通过摄取Cys来确定T细胞是否主要满足Cys的要求2或者，通过对Cys的摄取，我们抑制了Cys的摄取。2通过细胞在X-体内培养，15种培养基中添加大量谷氨酸(Glu)。Glu是x中的主要交换基板。c−胱氨酸/谷氨酸反转运体介导的Cys摄取2是Cys的高特异性抑制剂2摄取13...我们发现20 mM Glu对T细胞增殖的抑制率超过90%。图3A)。这表明T细胞的增殖依赖于Cys的摄取。2经xc−胱氨酸/谷氨酸反转运体排除观察到的抑制T细胞增殖的可能是Glu的毒副作用，并检验中性氨基酸转运蛋白是否能替代x。c−转运体在x-体15培养基中，以固定浓度的Glu(20 Mm)与增加2-巯基乙醇(2-ME)的量相结合，使细胞的cys减少。2在给Cys的媒介里。因此，如果细胞不受高浓度Glu的影响，如果中性氨基酸转运蛋白发挥功能，则T细胞增殖应随着2-ME浓度的增加而重建。事实上，我们发现2-ME重组的T细胞增殖和T细胞增殖完全可以通过加入浓度为50~100 mM的2-甲醚来挽救。图3B)。同样，添加含20 mm Glu的含20 mm Glu的含N-乙酰基-L-半胱氨酸形式的游离硫醇的X-体15培养基或添加GSH可完全挽救T细胞增殖。补充图2s)。因此，在正常情况下，T细胞的增殖严格依赖于x。c−-介导Cys的摄取2...然而，如果细胞外环境中存在足够高浓度的Cys，则ASCT 1和ASCT 2可以为T细胞增殖提供足够的Cys摄取。

为了进一步研究T细胞活化过程中对Cys的需求，我们在添加大量Glu的X-体15培养基中刺激细胞，用流式细胞术检测活化标记CD 25、CD62L、CD 69和CD 98的表达。我们发现，即使是完全消除T细胞增殖的Glu浓度也不影响活化标记物的表达。图3C)。Glu也不抑制活化诱导的XCT、ASCT 1和ASCT 2转运蛋白的表达。图3d)。这些实验证实了早期T细胞活化，包括cys的上调。2Cys转运蛋白与Cys无关，而T细胞增殖则严格依赖于Cys。

讨论

在这项研究中，我们证明了人类天真的CD4+T细胞不表达或表达极低水平的cys。2运输机xc−Cys转运蛋白ASCT 1和ASCT 2在T细胞活化过程中表达明显上调。这是第一个直接测量ASCT 1和ASCT 2在人T细胞上表达的研究。关于ASCT 1和ASCT 2的表达，我们的结果与以前的研究结果一致，发现静止的T细胞摄取Cys的潜力很低，并且随着T细胞的激活而显著增加。14,15,24...关于x的表达式c−关于T细胞，已经报道了相互矛盾的结果。基于Cys的测量2Glu对Cys的摄取及抑制作用2一些研究间接地发现了x缺乏表达的证据。c−静止T细胞和活化T细胞的研究14,15...然而，在这些研究中使用的Glu浓度可以抑制x。c−是相当低的(0.5-2.5毫米)，在一项研究中对Cys的吸收2在静止的T细胞中观察到，活化的T细胞中增加了三因子14...另一项研究发现了x的间接证据。c−用Glu介导的抑制T细胞增殖的方法观察活化T细胞的表达25...与我们的发现一致，最近的研究发现xc−不在静止T细胞上表达，而是在T细胞活化后表达6,18...基于这些和我们的研究，我们认为天真的T细胞不表达或很低水平的x。c−，ASCT 1和ASCT 2，这些转运蛋白的表达在T细胞活化过程中被强烈诱导。与此一致，我们发现早期T细胞的激活不依赖于cys，因而不依赖cys。2和Cys通过x的摄取c−、ASCT 1和ASCT 2转运蛋白，即T细胞在激活早期不表达。与早期的T细胞活化相比，我们发现T细胞的增殖严格依赖于Cys。这与以前的研究非常吻合，之前的研究发现T细胞的增殖，特别是从G的进展1细胞周期到S期，依赖于GSH合成的增加，其中Cys是限速氨基酸。2,3,4,5...GSH的产生和转运到细胞核中的增加可能为dntps的合成提供了所需的减少能力。26,27.

乍一看，激活的T细胞能合成像激活标记物Cys和Cys这样的蛋白质，这似乎令人费解。2在不含外源Met、Cys和Cys的情况下，本研究报道了转运蛋白和IL-2。2...然而，蛋白质合成所需的氨基酸可能是由(一)细胞内氨基酸库，(二)蛋白质分解代谢和(三)谷胱甘肽(GSH)降解所提供的。据报道，静止T细胞含有大量的GSH，并迅速降解。2,14并可能通过γ-谷氨酰循环进行重建。28,29...降解GSH可能是Cys的重要来源。细胞用于蛋白质合成的途径与谷胱甘肽合成的途径有根本的不同，在细胞缺乏的情况下，GSH的重建被最小化，有利于蛋白质的合成。

理论上，T细胞也可以通过转硫途径将Met转化为Cys来获得Cys。6...然而，我们发现Cys在T细胞增殖中不能被Met所取代，我们认为如果T细胞中确实存在转硫途径的话6,7它不能向T细胞提供T细胞增殖所需的大量Cys。

据推测，天真的T细胞在代谢上依赖APC来满足他们的Cys要求，因为Cys是胞外空间中氨基酸含量最少的细胞，天真的T细胞无法导入Cys。2由于x的缺位c−6,16,17,18,19,20...然而，我们发现幼稚T细胞的早期激活包括激活标记物、Cys和Cys的表达。2转运体和IL-2的产生不依赖于Cys。此外，我们还证明了除了xc−，活化T细胞表达ASCT 1和ASCT 2。2Cys转运蛋白是一种功能性转运蛋白，能向T细胞提供T细胞增殖所需的大量Cys。因此，人类天真的CD4+T细胞完全具备使T细胞独立于抗原提呈细胞产生半胱氨酸的激活和增殖机制。

方法

细胞和试剂

用Lymphoprepp密度梯度离心法分离单个核细胞(Nycomed，Roskilde，丹麦)。天真CD4+T细胞随后被阴性选择分离，使用天真的CD4。+T细胞分离试剂盒II(CAT)。第130-094-131号，Miltenyi Biotec GmbH，Bergisch Gladbach，德国)。纯化的T细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基中培养，不含L-蛋氨酸和L-胱氨酸(CAT)。编号：21013，Invitrogen，paisly，UK)或在X体内15培养基(CAT)中.编号1041，Lonza，Verviers，比利时)2Met分别为290和200 M。用Dynabeads人T-激活因子CD3/CD 28(CAT)刺激细胞。(编号：111.31D，Invitrogen)37°C，5%CO2细胞浓度为0.25~1.0×106细胞/毫升的时间指示为珠与细胞的比率为2：5。L-蛋氨酸(M 5308)、L-胱氨酸二盐酸盐(C 6727)、L-谷氨酸(G 5889)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(A 7250)和L-谷胱甘肽(G 4251)来自于Sigma-Aldrich(丹麦Brondby).

流式细胞术和westernblot分析

为了检测各种表面标记物的表达水平，我们用抗CD_4(克隆SK3)、抗CD 25(克隆2A3)、抗CD45RA(克隆HI100)、抗CD62L(克隆Dreg 56)、抗CD 69(克隆L78)或抗CD 98(克隆UM7F8)单克隆抗体孵育。这些细胞随后在FACSCalibur(BD生物科学)上运行。数据分析采用Flowjo软件(TreeStar，Ashland，OR，USA)。Westernblot分析人T-激活因子CD3/CD 28在37℃下刺激细胞，裂解缓冲液(50 mm Tris碱pH7.5，150 mm NaCl，1mm mg)。2添加1%TritonX-100、1mg/mlPefabloc SC、10μg/ml亮肽素、10μg/ml肽抑素和5mM EDTA，在10%聚丙烯酰胺凝胶上运行。将这些蛋白转移到乙酰胆碱ECL硝基纤维素片(GE Healthcare，Brondby，丹麦)，并用抗XCT(CAT)观察。NO NB 300-318，Novus生物制剂，Littleton，CO，USA)，抗-ASCT 2(克隆G11，细胞信号传递，技术，丹佛斯，MA，美国)或抗TCRζ(克隆6B10.2，圣克鲁斯生物技术，圣克鲁斯，CA)，其次是HRP-猪抗兔Ig或HRP-兔抗小鼠Ig(CAT)。没有。P 0399和P 0260，达科，Glostrup，丹麦)，使用阿梅舍姆ECL技术(GE保健)。

定量RT-PCR分析

采用反转录结合聚合酶链反应(RT-PCR)方法对基因表达进行定量。从纯化的天真CD4中提取总RNA+T细胞或受刺激的CD4+T细胞利用Revertaid™First Strand cDNA合成试剂盒(CAT)，将每个样品的总RNA中的1 g反转录成™。没有。K 1621，Fermentas GmbH，St.Leon-Rot，德国)。XCT(SLC7A11)，ASCT 1(SLC1A4)，ASCT 2(SLC1A5)和GAPDH采用TAG哥本哈根引物和Stratagene Brilliant SYBR绿色QPCR主混合引物(Agilent Technologies，Horsholm，丹麦)进行mRNA检测。通过记录SYBR绿色荧光强度，得到PCR扩增谱，该荧光强度与形成PCR产物的数量与PCR循环数呈线性关系。这个SLC7A11, SLC1A4和SLC1A5相对于GAPDH家务事基因和归一化控制条件下使用的2。−ΔΔCT方法30...我们使用了以下引物：XCT-正向5‘-GCT GTG ATA TCG CTG GCA TT-3’，XCT-反向5‘-CAG AAT TGT GGT CTT-3’，ASCT 1 5‘-ATT GGT CCT TCT TCT-3’，ASCT 1反向5‘-TGG GAA GAA TAA ACC TGC TG-3’，ASCT 2前向5‘-TAC ATT G TGC TGC CTCT-3’，ASCT 2反向5‘-ATG CGG CTG ATG TGC TGC-3’，GAPDH前进5‘-AAG GTG AAG GTC AA-3’，GAPDH反向5‘-AAT GGG GTC ATT GAT GAT GG-3’。