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Bim/Bcl-2轴诱导调节性T细胞稳态的优先调控

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发表时间:2019-12-08 18:16作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

Bim/Bcl-2轴诱导调节性T细胞稳态的优先调控

摘要

细胞凋亡在调节T细胞稳态中起着重要的作用,尤其是在免疫反应的收缩期。然而,它对效应者和调节人群之间的平衡的贡献仍然不清楚。我们发现Rag1−/−重新填充的主机BIM−/−常规CD4+T细胞(Tconv)比野生型Tconv小鼠诱导的调节性T细胞(ITreg)数量大。这似乎是由于iTregs在没有Bim的情况下与激活的Tconv相比具有更大的生存优势。在没有IL-2的情况下,bcl-2表达下调和Bim表达上调在WT iTregs中明显高于活化的tconv。离体...的Tconv重组后生成的iTregs。Rag1−/−宿主的bcl-2表达低于tconv,bm/bcl-2比值高于tconv,表明iTregs处于凋亡倾向状态。体内...外周血iTreg池中Bcl-2低表达,提示细胞对凋亡的敏感性增强,这可能是某些Treg亚群的一个普遍特征。综上所述,我们的数据表明,iTregs和Tconv由于Bim/Bcl-2表达比例的改变,对凋亡刺激的敏感性不同。调节凋亡途径可能为改变效应T细胞与Tregs之间的平衡提供新的治疗途径。


调节性T细胞(Tregs)是CD4的重要亚群。+T细胞在维持免疫稳态和耐受性方面具有关键作用。Tregs可分为天然Tregs(NTreg)、胸腺发育Tregs(NTreg)和诱导Tregs(ITreg),后者是从传统的cd4发展而来的。+T细胞(Tconv)在免疫反应的边缘。iTregs可以通过自身抗原表达的增加或感染的结果来诱导。因此,必须严格控制它们的稳态。iTregs分化不足可能导致免疫发病,而这些细胞的长期存活可能影响免疫记忆的建立。虽然对Treg的发育和分化已经有了重要的见解,1对控制nTreg和iTreg存活的分子机制知之甚少。2, 3, 4, 5

仅限于BH3的家庭成员BIM(编码为Bcl2l11)是一种促进凋亡的分子,控制免疫T细胞反应的协调收缩。6, 7, 8, 9它与抗凋亡调节因子Bcl-2和Bcl-XL直接相互作用,使其失活.因此,Bcl-2和Bcl-2/Bcl-XL表达水平之间的细微平衡是细胞生存的一个重要的检查点。10, 11尽管外周T细胞扩张增强,BIM−/−小鼠不发生侵袭性T细胞介导的自身免疫性疾病.12这可能部分是由于中等年龄的Treg人口增加造成的。BIM−/−动物与野生型的小白蚁比较。13, 14有趣的是,BIM在外周WT CD4中的表达自然下降。+T细胞在衰老过程中,15这是与越来越多的Tregs同时发生的。这就提出了Bim在Treg稳态中具有重要作用的可能性。

由于iTregs和nTregs不能在BIM−/−动物,Bim耗竭对两种Treg细胞亚型的影响尚不清楚。Bim的耗尽可能对nTreg的发育有有限的影响,因为胸腺中nTregs的迁出率在WT和BIM−/−老鼠。13观察到BIM−/−然而,nTregs的增殖性更强,这与以下观点相矛盾:BIM−/−T细胞在TCR激活后反应较弱.16在本研究中,我们询问Bim和Bcl-2之间的平衡是否作为控制iTreg稳态的关键生存参数。

结果

iTregs的优先诱导体内在Bim不在的情况下

直接研究Bim耗尽对iTreg稳态的影响体内,通过过继转移CD4诱导小鼠炎症性肠病(IBD)。+CD 25CD45RB特康Rag1−/−主人。在该模型中,转移的Tconv可使宿主淋巴组织再填充,导致一定比例的Tconv受体肠道炎症。因为只有Tconv被转移(补充图S1a),基本上是所有Foxp 3+从受体中恢复的T细胞为德雷沃-生成的iTregs。虽然Bim对T细胞凋亡很重要,但我们只观察到BIM−/−和WT Tconv受体CD4的百分比和绝对数目+T细胞从脾脏和肠系膜淋巴结(MLN)中恢复。图1a和b)。令人惊讶的是,这一比例显著上升(2-3倍)和编号(3-4倍)+CD4+BIM−/−Tconv受体与WT受体在脾、肠系膜上皮内淋巴细胞和固有层淋巴细胞(IEL/LPL)联合群中的比较(图1c和d)。iTregs的增加似乎并不是因为Foxp 3蛋白的表达水平不同,因为iTregs从两者中恢复过来。BIM−/−而WT Tconv受体的Foxp 3表达水平相当(脾脏=1022/958(WT/958))。BIM−/−MIN=1649/1443;肠=1272/1258;图1e)。这一差异也不是由于能力的提高而造成的。BIM−/−Tconv扩大,与WT Tconv在转移到淋巴细胞减少宿主后,CD4摄取BrdU的百分比相比较+Foxp 3细胞在脾脏中相似,而在MLN中WT细胞中则高得令人吃惊(图1f补充图S1b)。然而,这种差异在CD4的数量上是最小的。+Foxp 3BrdU+细胞(补充图S1c)。有趣的是,BIM−/−CD4+Foxp 3+BrdU+脾脏细胞(图1f补充图S1c)。这可能部分解释了BIM−/−脾iTregs和WT iTregs(3倍差)与mln(2倍差)。

图1
figure1

增强型体内iTreg诱导和减少IBD的发生率在没有Bim的情况下。Tconv是从C57BL/6(WT)或BIM−/−小鼠注射静脉注射。进入.的尾静脉Rag1−/−接受者(0.4×10)6(每只老鼠的细胞)。移植后4周,用流式细胞仪分析脾、MLN和IEL/LPL(肠)。CD4的百分比和数量+ (ab)和CD4+Foxp 3+ (cd)细胞。数据是每组5到7只小鼠的2到3个个体实验的平均±S.E.。ad),并使用标准未配对的方法进行统计分析。t-测试(*P<0.05, **P<0.01). (e)CD4的代表点图+Foxp 3+ITregs。(f)BrdU的百分比+TCOV(CD4)+Foxp 3,左)和iTregs(CD4)+Foxp 3+,右)。数据为每组4只小鼠的两个独立实验的平均±S.E.,并采用标准未配对的方法进行统计分析。t-测试(*P<0.05, **P<0.01). (g)TCOV受体IBD的发生率及统计摘要(2×2)χ2-分析)

与这些数据一致的是,BIM−/−特康与WT Tconv接受者相比,IBD的发病率降低50%(以体重下降大于5%的初始体重来衡量)(P=7.52 × 10−5相对危险度=0.491,95%CI(0.346~0.700);图1g)。综上所述,这些数据表明Bim的丢失对iTregs的产生和/或存活有有利的影响,而未转换为Foxp 3的转移的Tconv所占的比例更大。+种群,对IBD有保护作用。

Bim的丢失给iTregs带来了优先的生存优势。

中观察到的iTregs的增加BIM−/−TCOV接收者可能是BIM−/−iTreg转换,有选择的生存优势BIM−/−iTregs引起的IL-2分泌增加BIM−/−由于iTregs固有的生存优势而产生的累积效应对决在Bim不在的情况下。为了解决第一种可能性,我们执行了一个离体iTreg转化试验。多个因素能够调节iTreg转换的效率。众所周知,TCR信号具有关键作用。具有较高增殖能力的TCR激活促进iTreg的高效分化离体 (补充数字S2a和b)和在体内。17最近的研究表明BIM−/−Tconv对TCR刺激反应低,16人们可能会预测BIM−/−与WT Tconv相比,TCOV可能没有表现出明显的分化优势。与这个概念一致,BIM−/−Tconv的iTreg转换效率较低。离体比WT Tconv(补充图S2C),这可能是由于TCR激活效率较低所致。有可能BIM−/−Tconv分泌更多的IL-2,促进了iTregs的转化和存活.然而,这似乎不太可能像WT和BIM−/−Tconv激活离体分泌类似量的白细胞介素-2(补充图S2D)。此外,CD4的百分比+CD 25IL-2+分离细胞Rag1−/−接受WT或WT或BIM−/−Tconv是等价的(补充图S2E).

第三种可能性是Bim耗尽对iTregs的存活有不同的影响。对决特康夫。IL-2受体(CD 25)的本构表达是nTregs的一个标志,众所周知,NTregs的稳态和存活高度依赖于IL-2。18, 19鉴于Bim是生长因子剥夺介导的细胞凋亡的主要成分,我们比较了WT和WT的生存能力。BIM−/−iTregs,在没有IL-2的情况下激活Tconv.iTregs是通过激活Foxp 3中纯化的tconv生成的。绿色荧光蛋白在转化生长因子存在的情况下报告小鼠-βIL-2持续3天。Foxp 3+ITregs(全球伙伴关系司)+)和激活Foxp 3TCONV(绿色伙伴关系))分离培养,在无外源IL-2的条件下培养,并比较其相对存活情况。我们发现Foxp 3+与Foxp 3相比,iTregs在不添加外源IL-2的情况下对细胞凋亡的敏感性提高了两倍。-激活的TCOV(图2a和b)。Foxp 3+iTregs比Foxp 3更容易凋亡。-活化的Tconv在有限的外源IL-2(10 U/ml~100 U/ml)范围内;图2c)。然而,在没有Bim的情况下,iTregs和活化Tconv在这两个细胞群中的生存能力差异被消除了。图2a和b)。这些数据表明,与活化Tconv相比,iTregs对IL-2剥夺介导的细胞凋亡更为敏感.Bim表达缺失给Foxp 3带来更大的生存优势+iTregs,使其对生长因子戒断的敏感性降低。

图2
figure2

Bim/Bcl-2轴在控制iTreg存活中的优先作用。(ab)Tconv是从WT或BIM−/−Foxp 3绿色荧光蛋白小鼠抗CD3/CD 28微球在转化生长因子存在下激活。β(5 ng/ml)和IL-2(100 U/ml)连续3d诱导iTreg分化。iTregs(GFP)+)和活化的Tconv(绿色荧光蛋白))用流式细胞术(FACS)分类,在无IL-2的情况下培养3天。用碘化丙酸丙啶(PI)和抗Annexin V流式细胞仪测定活iTregs和Tconv的百分率。数据是四个独立实验的平均±S.E.,用标准配对进行统计分析。t-测试(*P<0.05). (c)iTregs(绿色伙伴关系司)+)和活化的Tconv(绿色荧光蛋白))在不同浓度的IL-2存在下培养3天,PI和抗Annexin V法测定活细胞百分率,数据代表两个独立的实验。

iTregs Bim、Bcl-2和Bcl-XL平衡改变对细胞凋亡的内在脆弱性

接下来,我们研究了在有限的IL-2存在下,iTreg与激活的Tconv之间存在差异的机制。活化T细胞仅在TCR介入后瞬间表达IL-2。用抗CD 25抗体阻断IL-2信号对外源性IL-2作用下Tconv的活化存活影响不大。因此,激活的Tconv在限制IL-2条件下对iTregs的存活优势可能是由于细胞的内在机制,而不是自分泌的IL-2途径。

由于亲凋亡分子bim的缺失可以减轻iTregs和活化tconv之间的生存差异,我们比较了在没有外源IL-2的情况下,iTregs和活化tconv中几个亲凋亡和抗凋亡bcl-2家族成员的表达水平。图3a)。bcl-2家族的促凋亡基因Bim和bax的表达在iTregs和活化的Tconv(IL-2去除前后的表达变化)中有类似程度的增加。Bid表达水平无明显变化。抗凋亡分子bcl-2和bcl-xl在iTregs中的表达略高于IL-2戒断前的活化Tconv。图3a;以‘PRE’表示)。然而,与活化的Tconv相比,在没有外源性IL-2的条件下培养48h,iTregs中bcl-2的表达明显降低,而Bim的表达也随之增加。图3a;以“POST”表示)。Bcl-XL和Bax的变化相似,但不明显.MCL-1和Noxa在克隆扩增过程中对调节T细胞凋亡具有重要作用。20Tconv和iTregs的Mcl-1和Noxa mRNA的相对表达无明显差异(P>0.0 5)。补充图S3).

图3
figure3

iTregs中Bim、Bcl-2和Bcl-XL平衡的内在脆弱性.(ab)iTregs和活化的Tconv图2...从新分类的iTregs(Foxp 3)中分离出mRNA。+)和激活的Tconv(Foxp 3)),在没有IL-2(POST)的情况下,在培养前(前)或再培养48小时后。用qPCR方法检测基因的表达水平。数据显示的是5个独立实验的平均±S.E.,用标准配对进行统计分析。t-测试(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.005). (c)新分类的iTregs(Foxp 3)细胞内Bcl-2+)和激活的Tconv(Foxp 3))在没有IL-2(POST)的情况下,在培养前(前)或再培养48小时后。数据表示两个独立的实验。

由于细胞存活依赖于亲凋亡分子和抗凋亡分子之间的平衡,而不是它们的绝对表达水平,因此分析相互作用伙伴的相对比率可能是阐明细胞对凋亡敏感性的一个信息参数。新分类的iTregs与活化的Tconv的Bim/Bcl-2、Bim/Bcl-XL、bax/bcl-2和bax/bcl-xl的表达率差异极小。图3b表明它们对细胞凋亡的初始敏感性可能是相似的。然而,在没有IL-2的情况下,持续培养导致iTregs中Bim/Bcl-2的表达率显著增加(7折前对决员额)对决活化TCOV(3倍)。还有一个在iTregs中Bim/Bcl-XL比值增加了3倍,而活化的Tconv(图3b)。Bax/Bcl-2或Bax/Bcl-XL比值也有类似的变化.正如预期的那样,补充IL-2可以阻止Bim/Bcl-2比值的增加,这与他们将iTreg存活提高到与活化Tconv相当的水平有关。补充图S4)。与mRNA分析相一致,我们观察到与活化的tconv相比,IL-2戒断后细胞内bcl-2蛋白表达丧失的iTregs所占比例要大得多。图3c)。总的来说,这些数据表明iTregs在维持亲(Bim/bax)和抗凋亡蛋白(bcl-2/bcl-xl)之间的适当平衡,以确保生存的能力降低。

减少bcl-2在iTregs中的表达体内

扩展我们的发现体内,我们转移了Foxp 3绿色荧光蛋白TCOV或CD4+CD 25CD45RBTconv从WT小鼠进入Rag1−/−并分析移植后4周iTregs和Tconv中Bcl-2家族分子的表达水平。虽然iTreg和tconv之间的Bim、bcl-xl和bax的表达水平相当,但iTregs的表达始终比从脾脏中恢复的bcl-2低4~5倍(图4a)。因此,iTregs的Bim/Bcl-2和bax/bcl-2 mRNA比值显著高于Tconv(图4b和c)。Bax/Bcl-XL比值无显着性差异(P>0.05)。图4c)。有趣的是,bcl-2 mRNA在iTregs和tconv中的表达是相似的,这反映了我们观察到在mln中,iTregs的数量增加的幅度要小一些。对决脾无Bim(图1c和d)。由于MLN是IBD模型中免疫应答的主要部位,与脾脏等远端淋巴组织相比,IL-2等生长因子水平可能更丰富。

图4
figure4

减少bcl-2在iTregs中的表达体内...Foxp 3绿色荧光蛋白TCOV或CD4+CD 25CD45RB来自WT或BIM−/−小鼠(0.5×10)6)转移到Rag1−/−主人。(ac)调动后4周,iTregs(全球伙伴关系司)+细胞)和Tconv(绿色荧光蛋白)用流式细胞仪(FACS)分离细胞,制备mRNA,qPCR检测基因的表达。所显示的数据代表了三个独立的实验,使用Mann-Whitney检验进行了统计分析(*P<0.01). (de术后4周,用流式细胞仪检测细胞内Bcl-2和Foxp 3细胞的iTregs和Tconv、不引流淋巴结(NdLN)、MLN和IEL/LPL。数据为11-12只小鼠的3个个体实验的平均值±S.E.,用标准未配对的方法进行统计分析。t-比较Tconv/iTreg和iTreg在脾脏/mln中的差异(*P<0.05, ***P<0.005)

细胞内bcl-2蛋白染色证实iTregs持续低表达bcl-2(3倍)与Foxp 3的比较Tconv从脾、无引流淋巴结、MLN和IEL/LPL中分离而来Rag1−/−寄主(图4d和e)。这也被观察到分离出的细胞。Rag1−/−重新填充的主机BIM−/−特康夫(图4e)。bcl-2在iTregs中的表达也一直较高。总的来说,iTregs似乎缺乏bcl-2的表达,这可能使他们更容易发生凋亡。体内.

Foxp 3+BCL 2罗氏Treg种群体内

据报道,nTregs表达的Bcl-2水平高于Tconv。21如果bcl-2的低表达是iTregs的特征之一,那么,与nTregs相比,我们询问bcl-2在wtc57bl/6小鼠中是否有可能标记iTregs。体内...与我们的假设一致,有两个明显的tregs种群,可区分为bcl-2。罗氏和Bcl-2分别在脾脏和周围淋巴结(图5a)。虽然Bcl-2在Tregs中的表达水平与helios表达无关,但作为iTregs的一个建议标记,22, 23约50%的bcl-2罗氏Tregs为CD 69罗氏和CD 44,表明这个Treg群体是抗原体验的,但最近没有激活(图5a和b)。因此,尽管我们不能排除一部分Bcl-2的可能性罗氏Tregs来源于nTregs,经过最近的激活,Foxp 3有可能+bcl-2罗氏CD 69CD 44细胞代表新分化的iTregs,而Foxp 3代表+bcl-2罗氏CD 69罗氏CD 44单元格表示内存iTreg总体。24然而,需要进一步的分析才能确定nTregs和iTregs是否可以通过Bcl-2的表达水平来区分。

图5
figure5

Foxp 3的鉴定+BCL 2罗氏调节性T细胞群在体内。 (ab)用Foxp 3、Bcl-2染色及表面标记。(b)CD4+Foxp 3+Bcl-2、CD 44和CD 69染色。五个独立实验的数据表示分析

讨论

以前的研究报告说,有更多的Tregs在BIM−/−老鼠,以及年老的老鼠。13, 14然而,控制Treg种群内稳态的机制仍未完全确定。有人认为Bim的增殖增加罗氏Tregs(在Foxp 3中增加了BrdU的加入+BIM罗氏人口)是特雷集团优先扩张的基础。13然而,这个模型是有争议的,因为研究表明,TCR刺激后的反应在BIM−/−和比姆罗氏T细胞15, 16我们的数据表明,Bim表达降低对iTregs具有优先的生存优势。因此,BIM的耗尽或下调限制了快速外周Treg细胞的周转,25结果导致Treg数量增加。由于iTreg分化需要最优的tcr信号,而增殖能力最强的T细胞群更有效地分化为iTregs,因此在Foxp 3中加入较高的brdu。+BIM罗氏T细胞群体可能是由于bim表达降低而增强了iTreg的存活。体内而不是nTreg扩展。与我们的模型一致,抗凋亡分子bcl-2在T细胞中的过度表达也导致iTregs的比例增加。体内降低自身免疫性疾病的发病率。26

IL-2在nTregs、iTreg和Tconv的开发和稳态维护中的重要性已经有了详细的记录.18, 19, 27IL-2或IL-2R缺乏小鼠的Tregs数量减少了两倍,并患有严重的淋巴增生性疾病.2, 28然而,将白细胞介素2或白细胞介素2R缺乏的小鼠与BIM−/−小鼠消除了这一数量不足,支持我们的数据,证明vBim表达水平是重要的iTreg生存。28然而,恢复Foxp 3+Treg数IL2−/−BIM−/−若不加入外源性IL-2,小鼠并不能预防淋巴增殖性疾病,提示Tregs的功能也需要IL-2。体内.28据报道,IL-2和通过IL-2R的信号转导调控Bcl-2的表达.29我们的数据支持这一观察,因为IL-2剥夺导致bcl-2和bcl-xl表达显著下降。离体...综上所述,这强烈地暗示了Bim和Bcl-2水平之间的IL-2依赖关系,并支持我们的结论,即在没有Bim的情况下,iTregs的存活率增加,从而增加了Tregs的数量。这与IBD发病率下降的关系可能是两倍.首先,在没有Bim的情况下,细胞凋亡可能减少,导致iTregs增多。第二,BIM−/−iTregs使组织中Tconv/iTregs的比值降低(脾脏,WT-.86:1,BIM−/−-22:1;MLN,WT-31:1,BIM−/−-20:1;肠道,WT-303:1,BIM−/−-120:1),这可能会增加Bim缺陷iTregs超过Tconv获得最佳Treg抑制所需的现有IL-2的可能性。体内.28

虽然不同的T细胞亚群可能优先使用不同的促凋亡和抗凋亡途径来调节稳态的观点已经被提出,30没有明确的例子记录在案。我们的数据表明,bm/bcl-2轴内的平衡表达对iTregs的存活的影响比激活的tconv更大。离体体内...家族特异性转录因子可能优先调控Bcl-2家族凋亡调节剂的表达。之前的一项芯片芯片研究显示Foxp 3与Bcl-2基因位点紧密相连,而不是任何其他Bcl-2家族成员。31目前尚不清楚这种结合是促进还是抑制Bcl-2的表达.虽然Foxp 3激活的转录抑制子Eos的缺失导致Bcl-2表达增加,但iTregs自身表达的Bcl-2比激活的Tconv多。21一个更有趣的假设是Foxp 3可能以有条件的方式调节Bcl-2的表达。Foxp 3通过引入不同的核因子,在IL-2过量时可促进Bcl-2的表达,而在IL-2受限时则抑制Bcl-2的表达。这可能是特别相关的特定疾病,如自身免疫性糖尿病,其中有记录有缺陷的IL-2产生。32如果Foxp 3直接调控Bcl-2在Tregs中的表达,nTregs和iTregs一样,是否对凋亡也敏感。

Treg/Tconv细胞比例的降低与自身免疫性糖尿病的发生有关。32事实上,与我们发现的iTregs有更大的凋亡倾向是一致的。离体体内,深远的Treg凋亡已被证明发生在糖尿病发病过程中。32有趣的是,我们的研究表明,Tregs可能有两个亚群体表达不同水平的bcl-2,即bcl-2。在糖尿病发展过程中优先流失的人群。胰岛中可检测到的Tregs大多表现为CD4。+Foxp 3+bcl-2罗氏基67+,它可能代表炎症部位的新分化的iTregs。总之,Tregs和Tconv之间的平衡在维持免疫耐受和促进免疫应答方面起着核心作用。Bim/Bcl-2平衡紊乱可能是调节不同疾病条件下免疫环境的一种新的治疗方法。Bcl-2表达的调控可作为一种促进iTregs存活的治疗方法。

材料和方法

小鼠T细胞制备及抗体

C57BL/6(WT)和Rag1−/−小鼠从杰克逊实验室(美国,美国,巴尔港)获得。这个BIM−/−小鼠由Andreas Strasser(沃尔特和伊莱扎霍尔医学研究所,澳大利亚维多利亚帕克维尔)提供。12这个BIM−/−小鼠与Foxp 3杂交绿色荧光蛋白报告鼠2生成BIM−/−Foxp 3绿色荧光蛋白老鼠。所有小鼠均在圣裘德儿童研究医院饲养。所有动物实验都是按照国家、州和机构的指导方针,在美国实验动物护理认证协会--经认证的特定病原体、幽门螺杆菌和MNV无病毒设施中进行的。动物协议得到了圣裘德动物保护和使用委员会的批准。

IEL/LPL纯化:取肠,切成0.5cm,37°C摇匀20 min,HBSS 45 ml,DTT 1mm。悬浮液是通过一个70的斜度过滤出来的。μM细胞滤器置于50 ml锥形管内,经离心5 min,至下午1200 min。上清液被丢弃,颗粒被保存在冰上。这一过程被重复了两次与应变组织,球悬液在相同的50毫升锥形管。用25 ml RPMI+10%FBS+8000 U胶原酶IV型(Worthington生化,Lakewood,NJ,USA),37°C旋转培养剩余肠组织。这种情况在紧张的肠组织中重复出现。最后用RPMI/10%FBS洗涤,离心,上清液丢弃。细胞颗粒在40×Percoll的4ml(4.0 ml 100×Percoll+6.0 ml RPMI/10%FBS;GE Healthcare,Piscataway,NJ,美国)中重新悬浮,并经过70次拉伸。μM细胞过滤器。细胞悬液在15 ml锥形管中轻轻分层,100×Percoll浓度在5.0ml以上,2500 r.pm离心。室温下不刹车20分钟。在两个Percoll层之间的界面处覆盖IEL/LPL波段的介质被小心去除。用移液管将细胞带转移到一个新的15 ml锥形管中,将RPMI/10%FBS加入到最终体积为10 ml的圆锥形管中,在1500 r.pm时摇动10 min,离心10 min。把细胞打成团。对Tconv和Treg的制备,用荧光标记抗体染色,用抗CD4(克隆GK1.5)、抗CD 25(克隆PC 61)和抗CD45RB(克隆C363-16A)进行单细胞分选纯化。本研究中使用的tconv被定义为CD4。+CD45RBCD 25,或者如果Foxp 3绿色荧光蛋白用报告鼠,CD4+绿色荧光蛋白...所有使用的抗体来自Biolegend(圣地亚哥,CA,美国)或电子生物科学(圣地亚哥,CA,美国)。用克隆10C4检测bcl-2的表达,用eBioscience Foxp 3固定/渗透试剂染色。

IBD模型

IBD的诱导过程如前所述。33简略,0.4×106FACS-纯化的Tconv(CD4)+CD45RBCD 25)通过尾静脉注入Rag1−/−老鼠。对Tconv受体进行监测,并将其临床症状定义为体重减轻5-10%。在Tconv移植后约4周对脾脏、淋巴结和IEL/LPL细胞进行分析。为体外转移后4周对基因表达谱、iTregs和Tconv进行分类。

白细胞介素-2酶联免疫吸附试验及细胞内染色分析

WT和BIM−/−Tconv在96孔圆底板(1×10)中进行了分类和镀制。5用抗CD3/CD 28包被M-450胞嘧啶激活的染料(Invitrogen,Grand Island,NY,USA),每珠2.5个细胞。刺激72h后,收集上清液,用ELISA法检测。上清液用预先涂有1的盘子孵育。μg/ml纯化的抗IL2(克隆人JES6-1A12,Biolegend)在室温下培养2h。然后,用1检测到IL-2。μG/ml生物素化抗IL-2(克隆JES6-5H4生物素,Biolegend),其次为链霉亲和素-HRP(Jackson免疫研究实验室公司,West Grove,PA,美国),并与TMB底物(热费舍尔科学,匹兹堡,PA,美国)。

细胞内染色Rag1−/−已收到WT或BIM−/−于4周前处理Tconv,用PMA/离子霉素(分别为100 ng/ml和500 ng/ml)刺激细胞12h,用Breceldin A(1:1000,Biolegend)刺激细胞。刺激后,细胞表面CD4和CD 25染色,固定并用抗IL-2抗体(克隆JES5-5H4)或IgG亚型对照,采用细胞固定/Cytoperm试剂盒(BD生物科学,圣地亚哥,CA,美国),并进行流式细胞术分析。

Bcl-2和Foxp 3细胞内染色

纯化Tconv(CD4)+CD45RBCD 25)注射静脉注射。经尾静脉进入Rag1−/−老鼠。4周后,用FOXP 3固定/渗滤缓冲液对脾脏和MLN细胞进行表面CD4染色,固定、渗透,用抗体Bcl 2(克隆BCL/10C4)、Foxp 3(克隆150 D)和IgG 1亚型对照进行染色,并进行流式细胞仪分析。

BrdU分析

纯化的Tconv经尾静脉注入Rag1−/−老鼠。移植后4周,小鼠腹腔注射。有200μPBS中BrdU浓度为10 mg/ml。16h后,取脾脏和多克隆细胞,用BrdU-APC流式试剂盒(BD生物科学)进行CD4、Foxp 3和BrdU染色,并进行流式细胞术分析。

诱导调节性T细胞分化及存活分析

Tconv是从WT或BIM−/−Foxp 3绿色荧光蛋白报告小鼠,用平板结合抗CD3(克隆2C11)和可溶性抗CD 28(克隆37.51)或预包被的CD3/CD 28微球在5 ng/ml TGF-1的存在下激活。β100 U/ml IL-2持续3天。绿色荧光蛋白+iTreg与活化GFPTCOV按FACS分类。然后在细胞密度为5×10的条件下,用或不加外源性IL-2培养任何一种细胞类型。4每井96井圆底板为所指示的时间。样品经eFluor-670(EBioscients)、AnnexinV(BD生物科学)和PI(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)染色。活细胞被定义为AnnexinV.

定量实时PCR

RNA是根据制造商的指示使用奇根(美国,美国,巴伦西亚)RNeasePlus Mini或RNeaseMicrokit进行纯化的。采用SYBR Green实时定量PCR技术检测了7900 HT快速实时PCR系统(应用生物系统、福斯特市、CA、美国)的Bim、Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Bid、MCL 1和Noxa的表达水平。采用TaqMan探针定量PCR方法记录肌动蛋白表达水平,以进行正常化。Primer sets were as follows:bcl2-F:5′-ACTTCGCAGAGATGTCCAGTCA-3′,bcl2-R:5′-TGGCAAAGCGTCCCCTC-3′;bcl-xl-F:5′-GAATGGAGCCACTGGCCA-3′,bcl-xl-R:5′-GCTGCCATGGGAATCACCT-3′;bax-F:5′-GCCTCCTCTCCTACTTCGGG-3′,bax-R:5′-TGAGGACTCCAGCCACAAAGA-3′;Bim-F:5′-TGCGCCCGGAGATACG-3′,Bim-R:5′-TTCGTTGAACTCGTCTCCGA-3′;Bid-F:5′-GCTGTCTCCCTATTTCCAGGTG-3′,Bid-R:5′-AGCTGAACGCAGAGATGTCCA-3′;Noxa-F:5‘-GTCGCAAAAGAGCAGGAG-3’,Noxa-R:5‘-TTGACACTCGTCCTTCAA-3’;Mc1-1F:5‘-AACGGACTGCTTGGTCAAA-3’,Mc1-1R:5‘-CTAGGCCTCCTCGTGAAGAACTC-3’。

统计

数据采用配对,未配对的方式进行分析。t-测试或Man-Whitney测试,取决于数据集,并在图图中描述。的疾病发病率分析图1f,2×2χ2-分析。P-价值观分为三个层次:*P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.005, unless stated otherwise.




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