丁香酚是从[医]芳香Syzygium aromaticum精油。由于其酚类基团的存在，它具有抗炎和化学保护作用，并具有很强的抗氧化活性。在本研究中，我们研究了丁香酚对中性粒细胞超氧化物生成的影响，这是天然免疫和炎症的关键过程。采用细胞色素c还原法测定人中性粒细胞中超氧阴离子生成。Westernblotting分析NADPH氧化酶激活的关键蛋白p47phox、MAPKinase(p38和ERK 1/2)、MEK 1/2和Raf的磷酸化。增加浓度(2.5g/mL~20g/mL)丁香酚预处理中性粒细胞30 min，显著抑制趋化肽甲酰基-蛋氨酸-Leu-Phe诱导的超氧阴离子生成(p<0.001)，IC 50为5g/mL。磷酸肉豆蔻酸酯(PMA)刺激O2−丁香酚浓度最高(20g/mL)对产量有影响。结果表明，丁香酚降低了p47phox对Ser-345和Ser-328的磷酸化，降低了p47phox向膜的转运，降低了Raf、MEK 1/2和ERK 1/2蛋白的磷酸化。结果表明，丁香酚通过抑制Raf/MEK/ERK 1/2/p47phox磷酸化途径抑制中性粒细胞产生超氧阴离子。

天然外源分子已被用作治疗氧化应激相关健康问题的替代治疗方法，如动脉粥样硬化、糖尿病、癌症和炎症性疾病。1...这些分子主要来源于食物和药用植物。植物可以产生范围广泛的非酶抗氧化剂，它们具有减轻ros引起的氧化损伤的能力。2...这些天然分子特别是多酚类和类胡萝卜素，具有多种生物活性。3...丁香酚(C)10H12O2)是一种酚类化合物，是[医]芳香Sysygiumaromaticum(L.)默尔。)，占挥发油的45%至90%。4...丁香酚是一种无色或浅黄色的液体，微溶于水，溶于有机溶剂。5...丁香酚作为一种天然产品，在临床应用中得到了广泛的关注。许多报道表明，它具有多种药理活性，包括抗菌活性。6、抗真菌7局部麻醉8、抗肿瘤9抗炎作用10...然而，丁香酚对炎症免疫细胞的影响较少。

中性粒细胞(PMN)是第一批被趋化因子C5a、白细胞介素-8、血小板活化因子和细菌肽N-甲硫氨酰-亮氨酸(FMLF)等趋化因子所吸引的感染或炎症部位的细胞。11...它们的基本活性是吞噬和随后杀死微生物。12...刺激中性粒细胞通过激活NADPH氧化酶复合物产生大量活性氧13...这种激活是通过一系列复杂的蛋白质相互作用产生的，导致膜蛋白(gp91phox，p22phox)和细胞质组分(p40phox，p47phox，p67phox)的组装。因此，催化快速的电子转移从NADPH通过配合物生成氧的超氧阴离子(O2)。−)14...超氧化物是其他活性氧(ROS)的前驱体，如过氧化氢(H)。2O2)和由血红素酶髓过氧化物酶产生的次氯酸(HOCl)15...在生理浓度下，ros参与宿主的防御反应，并作为信号分子调节细胞的生长、与其他细胞的粘附、分化、衰老和凋亡。16...此外，增强的活性氧生成被认为是炎症性疾病进展的核心。17...NADPH氧化酶的激活机制复杂多样。然而，NADPH氧化酶的激活需要两个主要步骤：p47phox在多个丝氨酸上的磷酸化和胞质亚基转移到膜上。18...在此背景下，我们的工作旨在研究丁香酚对中性粒细胞超氧化物歧化酶产生的影响以及参与这一过程的信号通路。

丁香酚对FMLF诱导中性粒细胞产生超氧阴离子的抑制作用

Cyochroc还原法是测定NADPH氧化酶第一产物超氧阴离子含量的一种特殊方法。为探讨丁香酚对人中性粒细胞产生超氧阴离子的影响，在37℃条件下，用不同浓度的丁香酚孵育30 min，用FMLF或PMA刺激细胞产生超氧阴离子，用550 nm分光光度计检测细胞色素c对细胞产生超氧阴离子的影响。结果表明，丁香酚(2.5g/mL~20g/mL)剂量依赖性地抑制FMLF刺激中性粒细胞产生超氧阴离子。1A，B和补充文件)。在低浓度2.5g/mL的IC中，这种抑制作用有统计学意义(p<0.001)。505μg/mL。然而，对中性粒细胞的抑制作用不太重要。PMA是一种中性粒细胞的激活因子，通过直接作用于PKC(图1)。1C，D)。结果表明，PMA刺激中性粒细胞产生的超氧阴离子明显减少(17%)，丁香酚浓度最高(20g/mL)。

丁香酚对FMLF刺激的人PMN产生超氧物有明显的抑制作用.人PMN(10例)6/ml)在37°C条件下，在有或不增加Eug浓度的情况下孵育30 min，然后用FMLF(10℃)刺激。−6m)或加入PMA(100 ng/mL)。在550 nm处用细胞色素c还原法测定超氧阴离子生成。(A,C在FMLF-和PMA-刺激的PMN作用下，随着Eug浓度的增加，细胞色素c的还原动力学。(B,D)由几个实验得到的反应的初始速度表示为控制百分比(由FMLF或PMA刺激的PMN)。3个实验的平均值±扫描电镜显示：与对照组比较，P<0.005(EYG未处理细胞，100%)。R：静息细胞。

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丁香酚对人中性粒细胞无毒性。

用台盼蓝染色法测定中性粒细胞活力的降低，测定丁香酚的细胞毒性作用。如图所示。2即使最高剂量为100μg/mL，不同浓度的细胞活力也不受影响。

丁香酚的细胞毒性。人PMN在不同浓度丁香酚存在或不存在时，在37°C下孵育30 min，用台盼蓝拒染法测定细胞活力，结果以对照组未处理细胞百分比表示。数据表示为三个或三个以上独立实验的平均±扫描电镜。与对照组比较，P<0.005。

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丁香酚降低Ser-328和Ser-345的p47phox磷酸化

超氧阴离子是参与微生物杀灭的其他毒物活性氧(ROS)的前驱体。ROS的产生需要通过磷酸化各种残基上的p47phox来激活NADPH氧化酶。p47phox亚基丝氨酸Ser-328和Ser-345的磷酸化对中性粒细胞NADPH氧化酶的激活及其对激活信号产生强烈氧化爆发的能力至关重要。为此，我们研究了丁香酚对此过程的影响。中性粒细胞经不同浓度丁香酚(2.5mg/mL~20g/mL)孵育后，用FMLF或PMA刺激。用免疫印迹法检测p47phox残基(Ser-345，Ser-328)的磷酸化。结果表明，丁香酚可降低FMLF刺激的中性粒细胞Ser-328和Ser-345的磷酸化。3A-C在PMA刺激的细胞中的程度较小(如图所示)。4A-C和补充文件)。

丁香酚对FMLF刺激中性粒细胞p47phox磷酸化的影响。细胞在37°C下孵育30 min，不加Eug(0，2.5，5，10，20g/mL)，FMLF刺激15s，用抗磷Ser 328 p47phox，抗磷Ser 345 p47phox和抗p47phox抗体对细胞裂解物进行SDS-PAGE和westernblot分析。(A对不同实验中的Westernblots进行扫描，其条带强度相对于p47phox总量表达。磷Ser-328的累积数据B)和磷Ser-345(C在直方图中显示为控制百分比(仅FMLF为100%)。数据表示为三个或三个以上独立实验的平均±扫描电镜。与对照组比较，P<0.005。

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丁香酚对PMA刺激中性粒细胞p47phox磷酸化的影响。细胞在37℃下孵育30 min，不加或增加Eug浓度(0、2.5、5、10、20μg/mL)，然后PMA刺激8 min。用抗膦Ser-328 p47 phox、抗磷Ser-345 p47phox和抗p47phox抗体对细胞裂解物进行SDS-PAGE和Western blot分析。(A)对不同实验中的Westernblots进行扫描，并以p47phox总量表示条带强度。磷Ser-328的累积数据(B)磷Ser-345(C))在直方图中显示为控制百分比(仅PMA为100%)。数据表示为三个或三个以上独立实验的平均±扫描电镜。与对照组比较，P<0.005。

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丁香酚减少p47phox从胞浆到细胞膜的易位

p47phox在多个丝氨酸上的磷酸化导致其从细胞质室转移到细胞膜，这是NADPH氧化酶激活的关键过程。因此，我们研究了丁香酚在这一过程中的作用。中性粒细胞与丁香酚在20μg/mLand浓度下孵育，然后用FMLF或PMA刺激，将中性粒细胞溶解，超离心分离胞浆和膜。采用免疫印迹法检测p47phox的易位。结果表明，丁香酚能显著降低FMLF刺激的中性粒细胞p47phox亚基的易位。5A，B)对PMA刺激的细胞没有影响(如图所示)。5C，D和补充文件)。据我们所知，这是首次报道丁香酚对p47phox易位的影响。

丁香酚抑制FMLF刺激的中性粒细胞p47phox易位。如方法部分所述，从FMLF和PMA刺激的中性粒细胞中制备膜和胞浆组分。(A),c)用SDS PAGE和Westernblotting检测切片中p47phox的含量。(B,D)用图像J软件对条带进行量化。这三个实验的数值表示为±SEM。

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丁香酚强烈抑制ERK 1/2磷酸化，对p38MAPK磷酸化影响较小

为了探讨丁香酚对超氧阴离子生成的抑制作用是否是通过调节MAPKs通路来实现的，我们进一步研究了其对ERK 1/2和p38MAPK磷酸化的影响。我们发现了FMLF-(如图所示)。6A，B)和PMA-(图1.7A，B)不同浓度丁香酚预处理可降低中性粒细胞ERK的磷酸化。在低剂量2.5g/mL时，抑制作用呈剂量依赖性，且有显着性差异。丁香酚p38MAPK的作用。6C和7C)在高浓度(10μg/mL和20μg/mL)时表现显著。

丁香酚对FMLF刺激中性粒细胞MAP激酶激活的影响。细胞在37°C下孵育30 min，不加或增加Eug浓度(0、2.5、5、10、20g/mL)，然后刺激FMLF 15 s，用抗磷脂ERK 1/2、抗磷脂p38和抗β-actin抗体对细胞裂解物进行SDS-PAGE和westernblot分析。(A)对不同实验中的Westernblots进行扫描，并以β-尖峰量表示条带的强度。磷p38的累积数据(B)和磷-ERK 1/2(C在直方图中显示为控制百分比(仅FMLF为100%)。数据表示为三个或三个以上独立实验的平均±扫描电镜。与对照组比较，P<0.005。

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丁香酚对PMA刺激中性粒细胞MAP激酶激活的影响。细胞在37℃下孵育30 min，不加或增加Eug浓度(0、2.5、5、10、20μg/mL)，然后PMA刺激8 min。用抗磷脂ERK 1/2、抗磷脂p38和抗β-桥联抗体对细胞裂解物进行SDS-PAGE和westernblot分析.(A)对不同实验中的Westernblots进行扫描，并以β-尖峰量表示条带的强度。磷p38的累积数据(B)和磷-ERK 1/2(C)在直方图中显示为控制百分比(仅PMA为100%)。数据表示为三个或三个以上独立实验的平均±扫描电镜。与对照组比较，P<0.005。

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丁香酚抑制MEK 1/2和Raf磷酸化

以丁香酚抑制ERK 1/2磷酸化，采用SDS-PAGE和WesternBlot研究了不同浓度的丁香酚对人中性粒细胞上游激酶MEK 1/2和Raf磷酸化的影响。结果表明，与对照组相比，丁香酚处理的中性粒细胞MEK 1/2和Raf的磷酸化水平显著降低。FMLF-浓度为2.5g/mL时，抑制作用呈明显的剂量依赖性(图一)。8A-C)和PMA-(图1.9A-C)刺激中性粒细胞。

丁香酚对FMLF刺激中性粒细胞MEK 1/2和Raf磷酸化的影响。细胞在37°C下孵育30 min，不加或增加Eug浓度(0、2.5、5、10、20g/mL)，然后刺激FMLF 15 s，用抗磷脂MEK 1/2、抗磷脂-RAF和抗-β-桥联抗体进行SDS-PAGE和Westernblot分析。(A)对不同实验中的西方印迹进行扫描，并根据β-尖峰数量来表示条带的强度。磷MEK 1/2的累积数据(B)和磷化氢(C在直方图中显示为控制百分比(仅FMLF为100%)。数据表示为三个或三个以上独立实验的平均±扫描电镜。与对照组比较，P<0.005。

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丁香酚对PMA刺激中性粒细胞MEK 1/2和Raf磷酸化的影响。细胞在37℃下孵育30 min，不加或增加Eug浓度(0、2.5、5、10、20μg/mL)，然后PMA刺激8 min。用抗膦-MEK 1/2、抗磷脂-Raf和抗β-桥联抗体对细胞裂解物进行SDS-PAGE和westernblot分析.(A)对不同实验中的西方印迹进行扫描，并根据β-尖峰数量来表示条带的强度。磷MEK 1/2的累积数据(B)和磷化氢(C)在直方图中显示为控制百分比(仅PMA为100%)。数据表示为三个或三个以上独立实验的平均±扫描电镜。与对照组比较，P<0.005。

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中性粒细胞是人类最丰富的白细胞。它们是生物体中宿主防御的第一道防线。在感染过程中，它们通过氧化和非氧化机制对感染性物质的破坏起着关键作用。19...过量的活性氧生成和积累似乎在组织损伤和炎症性疾病的发展中起着关键作用。20...因此，抑制活性氧的产生和中性粒细胞的过度激活是一个主要的研究兴趣。据报道，黄酮类等植物化学物质具有抗氧化和免疫调节功能。21...丁香[医]青蒿素)众所周知的香料，具有多种生物活性，特别是抗氧化和抗炎作用.其生物活性被归因于丁香酚(Eug)，这是挥发油中最丰富的成分(45-90%)。[医]芳香Syzygium aromaticum22...最近的一些研究证明了丁香酚作为具有不同药理性质的阿片活性分子的重要性。本研究表明，丁香酚对FMLF诱导的人中性粒细胞产生超氧阴离子有明显的抑制作用，且剂量依赖性，IC 50为5g/mL。丁香酚对PMA刺激的中性粒细胞产生超氧阴离子的抑制作用为20μg/mL(p<0.05)，为本研究使用的最高浓度。丁香酚对FMLF和PMA刺激超氧阴离子产生的抑制作用的差异可通过中性粒细胞活化的不同机制来解释。因此，低浓度丁香酚对PKC活性没有影响。我们的调查结果与Kim一致。等人.‘>研究了丁香色素ABTS和DPPH自由基的抗氧化活性。当浓度为20μg/mL时，丁香酚对ABTS和DPPH自由基的去除率分别为76.9%和90.8%。23...超氧阴离子是其他活性氧的前体，它是由活化的中性粒细胞通过NADPH氧化酶复合物产生的。24...这种酶的激活需要在Ser-303和Ser-379之间的丝氨酸上磷酸化其胞浆成分p47phox。25...众所周知，高浓度的趋化肽FMLF或PKC激动剂pma刺激中性粒细胞可诱导p47phox完全磷酸化。14...在本研究中，我们发现丁香酚在5；10和20 g/mL浓度下，对FMLF和PMA刺激的中性粒细胞中Ser-328和Ser-345的磷酸化均具有剂量依赖性。Ser-345对FMLF和PMA均有明显的抑制作用。由于p47phox在每口井中的负载量相同，这些结果表明，受刺激的中性粒细胞对超氧阴离子产生的抑制部分是由于p47phox磷酸化降低所致。此外，已知NADPH氧化酶受p47phox从胞浆转移到膜上的密切调控，我们证明在20g/mL的丁香酚可以减少p47phox向中性粒细胞膜的转运，并阻止功能性NADPH氧化酶酶的组装。据我们所知，这是第一份描述丁香酚对p47phox转运的影响的报告。这些结果都表明，丁香酚降低了p47phox在特定丝氨酸上的磷酸化，从而减少了它在膜上的易位和活性NADPH氧化酶的组装。

通过p47phox亚基磷酸化激活NADPH氧化酶是由蛋白激酶C(PKC)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等激酶进行的。26...丝裂原激活蛋白激酶(MAPKinase)是参与多种生物学过程的丝裂原激活蛋白激酶家族。细胞外信号调节激酶(Erk)1/2，c-jun N端激酶(Jnk)和丝裂原活化蛋白激酶p38是MAPKs研究最多的家族。27...ERK 1/2和p38MAPK在中性粒细胞中被激活，对多种促炎刺激反应，包括生长因子、佛波酯、FMLF和细胞因子。它们与呼吸爆发、粘附、胞吐和启动有关。28...结果表明，丁香酚抑制ERK 1/2磷酸化的剂量依赖性低至2.5g/mL。而p38MAPK在10μg/mL和20μg/mL两种最高浓度下，磷酸化水平明显降低。p38MAPK和ERK 1/2在Ser-345上磷酸化p47phox是必需的。这种磷酸化对NADPH氧化酶的过度激活和启动至关重要。29...根据我们的观察，我们可以认为Ser-345和Ser-328的磷酸化抑制是由于MAPKs磷酸化和活性降低所致。Deepak报告了类似的数据。等人在破骨模型中，RAW264.7巨噬细胞经200 M丁香酚预处理4h，可抑制ERK、JNK和p38的磷酸化。30...另一个离体研究表明，两种合成衍生物丁香酚、甘油异丁香酚和丁香酚均能抑制LPS诱导的巨噬细胞ERK、p38MAPK和jnk的磷酸化。31...ERK的磷酸化和激活是由MEK 1和MEK 2完成的，这两种相关的特异性MAPK是迄今为止唯一有效的raf丝氨酸/苏氨酸激酶的生理底物。32...几项研究报告了RAF和MEK在许多疾病中的意义，这些疾病本质上是癌症的发展。33...因此，基于靶标的治疗被认为是癌症治疗的先进方法，人们对开发raf和mek的药物抑制剂作为阻断erk信号的手段有着浓厚的兴趣。34...我们的结果表明，丁香醇抑制FMLF和PMA刺激的中性粒细胞中Raf和MEK的磷酸化。这些结果表明，丁香酚可能是Raf/MEK/ERK级联的一种很有前途的抑制剂。

总之，本研究表明，丁香酚可能通过抑制Raf/MEK/ERK级联和p47phox磷酸化激活剂残基(Ser-345和Ser-328)，抑制FMLF介导的超氧阴离子产生，从而抑制NADPH氧化酶的活性。我们的发现证明了丁香酚抗氧化特性的分子基础，并展示了其在治疗氧化应激相关疾病中的潜在治疗作用。

试剂

丁香酚、Hanks平衡盐溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)、醋酸纤维素(PMA)、甲硫氨酰-亮氨酸-苯丙氨酸(FMLF)、小鼠单克隆抗β-actin抗体、磷酸酶和蛋白酶抑制剂均来自SigmaAldrich(法国圣昆廷·法尔维尔)。葡聚糖T 500和Ficoll是从通用医疗保健公司(Orsay，法国)购买的。SDS-PAGE和Westernblot试剂分别来自美国加州大力士市的Bio-Rad实验室.抗磷脂-Raf、抗膦-MEK 1/2、抗磷脂-p38和抗磷脂-ERK 1/2抗体来自细胞信号技术(美国波士顿，MA)。抗磷-p47phox抗体(Ser-328和Ser-345)是由我们实验室产生的，如前所述。35...HRP-结合山羊抗兔，HRP-结合山羊抗小鼠，AP结合山羊抗兔抗体和ECL(增强化学发光)试剂来自圣克鲁斯生物技术公司(德国海德堡)。

伦理声明与人血中性粒细胞的分离

Xavier Bichat医院的临床研究委员会(法国巴黎)批准了按照国际准则和条例执行的所有方法。在获得书面知情同意后，从健康志愿者处采集静脉血。采用密度梯度分离法，用2%右旋糖酐(T 500)和Ficoll离心分离人全血中性粒细胞。36...用低渗溶解法去除红细胞。为了防止活化，分离的中性粒细胞被重新悬浮在无钙的HBSS中。2+/毫克2+...用台盼蓝排斥法进行细胞计数和细胞活力测定。

丁香酚的细胞毒性

分离中性粒细胞(1×10)6不同浓度丁香酚(0~100μg/mL)在37℃培养30 min，台盼蓝染色测定活细胞数。结果显示为活细胞与未处理细胞的百分比。

超氧阴离子产生的测定

中性粒细胞(1×10)6细胞悬于含1mg/mL细胞色素c的HBSS 1mL中，丁香酚浓度增加(2.5g/mL~20g/mL)。在分光光度计(法国维尔邦Uvikon)的恒温室37℃下孵育30分钟后，用FMLF(10)刺激细胞。−6m)或PMA(100 ng/mL)。在550 nm波长处测定吸光度变化10 min。

p47phox易位到质膜

实验按先前的描述进行。37...分离中性粒细胞(50×10)6每mL)在37°C下孵育30 min，在20g/mL的浓度下孵育30 min。细胞随后被FMLF(10)刺激。−6m)或PMA(100 ng/mL)。加冰冷PBS后，400×g离心10 min即可停止刺激。在描述的弛豫缓冲器中，细胞颗粒被重新悬浮并在冰上进行超声处理。37，400×g离心10 min。在蔗糖梯度下，15万×g超离心，4°离心45 min。在相同的裂解缓冲液中收集和洗涤胞浆和膜组分，在Laemmli样品缓冲液中进行变性，并将其储存在−80°C中直至使用。

SDS-PAGE和Westernblotting分析

人中性粒细胞经不同浓度丁香酚(2.5g/mL~20 g/mL)处理30 min后，用FMLF(10μg/mL)刺激。−6m持续15秒)或PMA(100 ng/mL持续8 min)。加入5×浓缩Laemmli样品缓冲液，加入12.5mMNa，停止反应。3Vo425 mMNaF，6.25mm-NPP，12.5mmEDTA，12.5mmEGTA，50g/mL肽抑素和50mgmL抑肽酶。样品经旋涡处理后，在100°C下变性3 min，再用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)(10%)分离蛋白质。将电泳分离的蛋白质转移到硝化棉膜上，然后用5%脱脂干乳在三倍缓冲液和吐温-20的混合物中阻断膜。在含特异性初级抗体的4°C溶液中，抗磷脂-S 328-p47phox(1：2500)、抗膦-S 345-p47phox(1：10000)、抗磷-Raf(1：1000)、抗磷-MEK 1/2(1：1000)、抗磷脂-ERK 1/2(1/2000)、抗磷脂-p38(1：2000)和p47phox(1：5000)，继之以辣根过氧化物酶共轭二次抗体(德国圣克鲁斯，圣克鲁斯)。增强型化学镀液ECL(圣克鲁斯生物技术公司)将德国海德堡(Heidelberg)添加到膜上，并利用生物光谱成像系统(AmericshaImager 600)对蛋白质进行检测和量化。