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小鼠异种移植物生物反应器用于人免疫球蛋白的研究

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发表时间：2019-12-07 19:41作者：武汉新启迪Xinqidi来源：www.qidibio.com

小鼠异种移植物生物反应器用于人免疫球蛋白的研究

摘要

MHCⅠ类分子和II类分子对多肽的研究由于需要较多的细胞数量而受到限制，特别是在研究翻译后修饰或其他稀有肽种时更是如此。为了克服这一问题，我们提出了这样的假设：在免疫缺陷小鼠中，作为异种移植物生长的人类细胞应该产生与培养细胞相当的免疫球蛋白。比较生长的人细胞株离体或者作为鼠异种移植，我们证明免疫球蛋白被保存得很好。在这两种样本类型中都有许多共同的特征，包括多肽和蛋白质特征、长度分布和HLA结合模式。两组中表达良好的多肽均来自较丰富的蛋白质，或具有较强预测HLA结合亲和力的多肽。生长样品体内此外，还概述了一个类似的磷免疫肽体，共同的序列是那些在细胞表面的高拷贝数发现的序列。这些数据表明异种移植物确实是一种可行的方法来产生细胞来进行免疫肽酶的发现。

导言

MHCⅠ类或II类分子向免疫系统展示的肽的发现和定量是充分了解适应性免疫系统的基本要求。近年来，通过质谱(MS)对这些肽的研究--被称为免疫肽类、MHC配体组学或MHC肽组学--取得了很大进展，在MS分析、生物信息学和样品处理方面取得了改进，在一些实验中能够检测到超过10，000个肽序列。1，从近30年前该领域开始时的每项研究约10项增加到现在的水平。2,3.

MHC结合的多肽(PMHC)仅占细胞质量的一小部分，许多肽种存在于每个细胞不到一个分子的范围内，因此需要相对较大的细胞数量或组织体积作为初始样本输入是该领域面临的主要挑战。典型实验的目标往往是0.5-1×108细胞4，取决于给定实验室的特定设置。这一要求在研究MHC所呈现的特定的、更稀有的肽物种时，例如那些带有翻译后修饰(PTMS)的肽物种时，就变得更加有限。这些肽只占免疫球蛋白的一小部分，相应地更难可靠地检测。例如，免疫肽类实验研究了从细胞中最常见的PTM中提取的浓缩磷酸化肽。5-典型收获范围为0.5-1×109电池等价物以获得足够的检测材料6.

这一要求以多种方式影响免疫肽类实验。对于临床样本来说，这意味着只有足够大小的样本才能被处理。这限制了可行样本的数量和类型，并减少了可供进一步或并行实验使用的材料数量。用于细胞株和细胞器，持久离体培养需要产生足够的细胞进行分析。这可能是缓慢的，昂贵的，不切实际的(需要大量的操作员时间和孵化器空间)，并且有可能带来实验上的偏见和混乱。

我们试图通过验证以下假设来解决这个问题：在免疫缺陷小鼠中作为异种移植物生长的细胞系应呈现与传统培养中生长的细胞相当的肽库，从而提供一种产生足够细胞数量的替代方法。

在干细胞植入和病人特异性癌症治疗领域的广泛研究推动了小鼠异种移植技术的进步。免疫缺陷小鼠生长的细胞(‘鼠类)已经被证明可以重复那些培养的人的基因表达谱。离体7，特别是当只有在小鼠中传递的最小值时。8...更重要的是，蛋白质表达甚至磷酸化模式都是保守的。9...使用日益精制的免疫缺陷小鼠品系，例如长寿的诺德-SCIDIL2RGamma零(NSG)小鼠，完全缺乏适应性免疫10，在没有免疫选择的情况下，提供了生长多种细胞系或群体的机会。对于免疫球蛋白来说，最关键的是小鼠源性的pan-Ⅰ类HLA特异性抗体w6/32。11最常用的pmhc免疫亲和纯化方法是可以预测的，不会与小鼠mhcⅠ类分子发生交叉反应。12.

我们选择了淋巴母细胞B细胞株JY来验证我们的假设。Jy一直是许多免疫球蛋白研究的对象，其原因有如下几个：它易于培养，具有高表面表达的I类HLA，并且在人类群体中常见的三种等位基因(HLA-A*02：01，HLA-B*07：02和HLA-C*07：02)的每个I类位点上都是纯合子(HLA-A*02：01，HLA-B*07：02和HLA-C*07：02)。HLA-B*07：02的存在特别有利于检测异种移植物是否有能力呈现磷酸肽，因为b7等位基因在呈现这类序列时特别有效。13,14,15.

在这项研究中，我们同时培养了JY细胞。离体并作为小鼠异种移植物，比较了免疫肽类和磷-免疫肽类，表明肽和磷肽在两种样品类型之间都有广泛的共享，此外还具有各种广泛的性质。这表明异种移植确实可以代替细胞培养进行免疫球蛋白，从而扩大了可以进行的实验的范围和类型。

结果

肽序列在不同的生长类型之间是共享的。

为了验证我们的假设，我们将描述良好的JY细胞系在小鼠中培养或作为异种移植物，用质谱法(MS)检测两种样本HLA中的多肽。1A)。从培养的JY细胞的三个技术重复序列和JY异种移植物的不同的生物重复序列中回收了大致相等的肽数(见图)。1B，随附图所示样本的重量而定。1A)。虽然我们预计不同生物样品和技术样品的肽产量之间会有较大的差异，但异种移植物的肽产量与大多数肿瘤重量无关(补充图1)。1B)。这些肽具有相似的长度分布曲线，只是其所呈现的8-聚肽所占比例不同(图1)。1C).

为了量化两个样品之间肽的重叠，我们计算了Jaccard指数，这是一种两组之间共享的规范化度量(见方法)。计算Jaccard指数，对整个样本免疫球蛋白进行配对比较(图1)。1D，左上角三角形)，显示虽然每种类型的样品与其组内的重复序列有更多的重叠，但在各组之间仍有大量的肽共享。请注意，一项研究也比较了JY免疫球蛋白的技术复制。16报告的重叠与Jaccard指数的范围在0.3至0.38之间，即使在异种移植物和培养样品之间，也与这里观察到的值相一致。为了克服由于不同样本中肽数不同而产生的偏差，我们反复从每个文件中对相同数量的肽进行亚采样，重复Jaccard计算，并对结果进行平均(图1)。1D，右下角三角形)。这样做向我们展示了异种移植样品与培养样品的相似之处，以及它们之间的相似之处。

异种移植JY肽体显示相似的HLA结合基序

利用mhc结合预测软件mhcflu，通过预测mhc与jy中存在的HLA等位基因的肽亲合度，研究了mhc结合特性。17...根据它们出现在哪种样品中的多少，我们注意到，单独出现在单个小鼠或培养样本中的多肽，其结合亲和力(NM值)比同一类型的多个样本之间的亲和力要弱(NM值更高)，而在单个小鼠样本中发现的肽的亲和力明显低于在单个培养复制中发现的肽(图1)。2A)。在这两种生长协议的所有样本中发现的多肽都具有最高的亲缘关系，这表明，至少在一定程度上，肽与HLA的结合程度有关。

肽被分配到最有可能呈现它们的等位基因上，根据这个等位基因给出了最强的预测亲和力，大于1000 NM的值被归类为“无预测结合剂”(图1)。2B)。HLA-B*07：02和HLA-C*07：02-这两种等位基因分别代表最大和最小比例的多肽，它们在异种移植和培养样品中的贡献是相等的。然而，异种移植样品预测的HLA-A*02：01结合物明显减少，而与任何相关等位基因结合的多肽也相应显著增加。这不是用来预测HLA结合的软件的伪像，因为在使用netMHC-4.0(另一种预测器)时，可以观察到相同的模式。18(补充图。2A)。在异种移植物样品中，这些预测的非结合物似乎也不可能是小鼠肽污染物；预测的非结合肽序列只在异种移植样本中发现，实际上在小鼠蛋白质组中出现的频率低于在两种样本类型中或仅在培养样本中发现的非结合物(补充图)。2B)。也没有迹象表明它们是由小鼠I类MHC(虽然W6/32不应该能够结合这些分子)呈现的肽：预测这些肽的亲和力，就像由NSG小鼠的H2d MHC单倍型显示非常差的预测亲合力(附图)。2C)。仅在培养样本中发现的预测的非HLA结合物实际上显示出略低的预测亲和力分布，但由于与小鼠蛋白质组的重叠，这很可能是偶然造成的。这些肽也是从一些相同的蛋白质和几乎所有相同的生物途径中提取出来的，就像培养的细胞中不可预测的结合剂一样，这意味着这两组肽是以类似的方式产生的(补充图)。2D-F)。对这几组不可预测的结合肽的电物理性质的研究表明，它们在疏水性上没有差别，而在培养的细胞中发现的则有明显的低电荷和极性测量(附图)。3).

Gibbs集群(第2版)19用于处理每个样品的肽，显示培养和异种移植物样品之间极其保守的肽结合单元，最好用两个簇来描述(见图)。2C-D，以及附图。4)。这些发现反映了已发表的JY结果，其原因是强烈的A2/B7结合签名(C7的小贡献被类似的B7主题所包含)。20...这解释了第一列(典型的A2 9-MERS)第2(P2)位的亮氨酸和戊氨酸在P9处的强烈守恒，第二列(典型的B7)在P2处的脯氨酸的强守恒。

异种接枝JY肽体来源于相似的蛋白质和途径

除了测试肽的性质是否在异种接枝和离体我们评估了不同的生长类型是否可以选择来自不同蛋白质或途径的多肽。将多肽与其来源蛋白进行映射，并与已发表的数据进行比较，发现在所有样本中发现的多肽都倾向于从更丰富的转录本中提取(图1)。3A)和蛋白质。3B)而只在一只小鼠或培养的复制物中发现。通过二值化蛋白质的存在/缺失，我们绘制了与已发表的转录和蛋白质组丰度相关图。几乎所有的样品对两者都有很强的相关性，而对生长的样品则有较强的相关性离体(补充图)2和6)。请注意，已发表的RNAseq和蛋白质组学数据来自传统培养的JY。

所有培养的和所有异种移植标本的免疫球蛋白中所代表的蛋白质的比较显示了大量的重叠(图1)。3C)。在每一组蛋白质中，相对于整个蛋白质组，过度表达的GO项的计算显示了更大的重叠(图1)。三维空间)，每个分析中的富集GO项的P值都是高度相关的(图1)。3E)。在过度表象分析中，各种生物学参数的分布在培养的和小鼠生长的JY样本之间也高度保守(附图)。7).

因此，异种移植物生长的JY不仅重述了广泛的免疫球蛋白体特性(以及大多数相同的实际肽序列)，而且通过利用相同的蛋白质和途径来实现这一目的。

异种移植物衍生肽与已发表的JY免疫肽一致。

到目前为止，我们提出的实验有点混乱，因为我们正在比较异种移植生物复制与培养的技术复制(由培养足够的细胞进行评估的负担)。为了避免这个问题，我们对JY进行了两两分析。离体和鼠类从其他实验室(全部通过标准细胞培养产生)，以及从SysteMHC资源中提取的其他非JY细胞株和组织，培养出抗JY免疫球蛋白的细胞。21(无花果)4).

在完整的肽列表中，我们观察到异种移植或培养产生的JY免疫肽与先前发表的JY免疫肽圈的重叠程度相同(如图1所示)。4A，左上角三角形，以及4B)。事实上，它们与已发表的JY免疫球蛋白相似，因为这四个样本--每个样本来自不同的组--使用各自的方法--彼此相似。当观察等数量肽的大小匹配子样本之间的平均重叠时，我们培养的JY与已发表的数据有更多的重叠(图一)。4A，右下角三角形，附图。8)。所有JY样本与对照免疫球蛋白组相比，肽含量明显减少(重叠较少/Jaccard指数较低)，且重叠程度较小(基于HLA等位基因的共享和来源于不同的细胞类型)。因此，我们的异种移植物生长的JY免疫球蛋白与其他组培养的细胞一样，能很好地再现已发表的JY免疫球蛋白。

Jy异种移植物磷脂-免疫球蛋白与培养的JY一致。

在概述了广泛的免疫球蛋白后，我们想要评估异种移植物是否能复制保持磷酸化残基的免疫球蛋白。这个子集包含了许多共同的癌症新抗原，这些抗原可能具有很大的免疫治疗作用。14,22，但由于其表面丰度较低，因此在技术上更难研究。磷酸肽通过固定化金属亲和层析(IMac)从洗脱的JY免疫肽的子集中提取，并由MS测定。在该协议的这一部分中添加的磷标准使我们能够估计相对丰度(见方法)，与非磷免疫肽相比，增加了一层额外的信息。

在培养的和异种移植的JY细胞上检测到大约相似数量的磷酸肽(如图所示)。5A)。累积培养样品的磷酸肽含量高于小鼠(图1)。5B)，虽然与一些样本相比只是微乎其微。虽然培养的样品含有较多的8-MERS和较少的9-11-MERS，但其长度分布也大致相当(图1)。5C)。我们再次看到在培养的和异种移植的样品之间有相当多的磷酸肽序列重叠，尽管老鼠的样本比培养的样本更相似(图)。5D和补充图。9)。此外，任何两个样品之间的磷肽丰度高度相关(补充图)。10)。请注意，低R值的部分原因可能是由于小鼠样本中存在对肿瘤重量有贡献的小鼠组织，而不是JY肽类物质，从而使复制/细胞值计算混乱。通过翻转分析显示了多个样品中磷酸肽的交集。23...这表明，最大的一组独特的磷酸肽含有所有样品中共有的一组，其次是两组最大的独特样本(培养样本和M07，补充图)。11).

MHC预测算法目前无法解释结合亲和力的差异，这可能是翻译后修饰的结果，如磷酸化。因此，在本研究中，我们预测了相应的未修改序列的亲和力，承认这不能预测这种磷酸化事件对亲和力的影响。22,24...预测的HLA等位基因结合贡献和MHC结合的磷酸肽基序几乎无法区分离体和鼠类生长样本(图1.5E-G，以及附图。12)。在高度共享的磷酸肽序列之间似乎没有高亲和力结合的富集(图一)。5H)就像整个免疫球蛋白一样(图中所示)。2A)。然而，仅限于单个小鼠样本的磷酸肽也同样显示出相对于单个培养样本的高亲和力倾斜。重要的是，我们观察到，所有样品中的磷酸肽在细胞表面的丰度明显较高(如图所示)。5I).

异种移植标本与其他细胞培养的免疫球蛋白相匹配

为了评价该技术的更广泛适用性，我们从另外两个肿瘤细胞系：MDA-MB-436(乳腺)和Colo 205(结直肠癌)中提取了免疫球蛋白。MDA-MB-436培养和异种移植物条件下，细胞均新鲜生长，而异种移植物生长的Col205多肽与前几年培养的细胞的肽进行了比较，在pMHC提取和低温保存之前。这就产生了等量的肽样本，再次显示了mhc结合肽长度分布的典型模式(补充图13)。甲-乙).

两种细胞系的标准免疫球蛋白和富磷免疫球蛋白均有很强的重叠，另一种生长模式中的大部分肽和磷酸肽都在另一种生长模式中存在(图一)。6A-D)。(请注意，相对于其他系而言，MDA-MB-436磷酸肽的缺乏很可能是由于缺乏一个容易呈现它们的等位基因，例如HLA-B*07：02等位基因JY和Colo 205表达)。此外，在每个细胞株上发现的肽基序在生长类型之间是非常一致的(见图)。6E-H)，两种细胞系均表现出较强的HLA-A*01基序和HLA-B*08或HLA-A*02基序。当使用MHCFFURY指定相关的结合等位基因时，这些观察进一步得到支持，因为大多数多肽都是由这些等位基因在各自的细胞系中呈现的，在培养的细胞和异种移植物生长的细胞之间达到了大致相似的程度(附图)。13C)。我们还注意到，在这些细胞系中，没有预测到会与任何相关的HLA等位基因结合的多肽比例与JY没有明显的差异。

这些数据表明，异种移植物生长的细胞产生的免疫球蛋白和磷免疫球蛋白与培养中生长的细胞非常相似，很可能优先代表那些通常以较高频率或较高亲和力出现的抗原。

讨论

免疫肽酶领域的研究人员对显示的肽抗原提供了无与伦比的洞察力，这些抗原最终是适应性免疫反应的基础。这不仅有助于我们对基本免疫学和细胞生物学的理解，而且也为我们选择用于疫苗接种和其他免疫治疗干预的新抗原提供了机会。4,25,26...尽管有创新的努力简化样品加工以最大限度地提高产量1，免疫球蛋白仍然是有限的，因为需要足够的材料来进行质谱检测。与所有未知内容的复杂生物混合物一样，获得更多研究材料的唯一途径是获取更多感兴趣的细胞或组织。这对容易处理的样本的数量和性质造成了技术上的偏见，例如有利于培养中生长迅速的细胞系，或具有较大可切除肿块的肿瘤。这一特性在研究免疫球蛋白的特定部分时更为真实，例如那些带有翻译后修饰的部分；因为它们只占免疫球蛋白体总数的一小部分，所以它们需要相应的更大数量的细胞来检测。

摘要鼠异种移植作为研究人类细胞生物学诸多方面的一种手段，已被广泛应用于许多领域。体内...它们允许多种细胞株快速生长，即使是从低初始输入细胞数，如循环肿瘤细胞。27...此外，在研究癌症方面，异种移植可以比简单的2D或3D培养更好地再现肿瘤细胞生长的复杂生物学。28...因此，我们假设，这一过程可用来帮助克服免疫球蛋白的挑战，即争取获得足够物质的斗争，同时保持效用和生物相关性。为了验证我们的假设，我们通过传统的方法培养了JY细胞系。离体细胞培养，或通过异种移植在免疫缺陷的NSG小鼠中生长。请注意，虽然我们知道至少还有一组人使用免疫缺陷小鼠来培养免疫球蛋白的癌细胞株。29，我们相信我们是第一个与传统进行面对面比较的人。离体增长。

我们发现，异种移植物生长的JY细胞能很好地再现培养细胞的肽库，产生重叠的肽列表，并具有许多重要的免疫功能。在两种生长方法之间共享的肽似乎被富集，以获得与mhc的高亲和力结合物，或者是从相对丰富的转录本和蛋白质中提取出来的。我们的培养和异种移植物生长的JY免疫球蛋白也与其他组先前发表的例子相似，就像那些已发表的免疫肽类似物一样。仅这一点就表明，该方法至少与复制JY免疫球蛋白和常规培养一样有效。用两个完全不同组织来源的细胞系重复这个方案，会产生免疫球蛋白，在培养物和小鼠之间有相似的重叠，这表明该方案可能对多种癌症类型都有很强的影响。

有少量的属性是不一样的离体和‘鼠类生长的JY细胞。也许最显著的差异是在异种移植物生长的JY细胞上发现了更多的多肽，而这些多肽并没有被预测会与细胞株上的任何HLA等位基因结合。尽管对照分析未能将其归因于常见的或容易解释的噪音来源，但这些差异可能被认为是小鼠着床未能完全重建培养的JY的确切组成。可能是异种移植过程本身的一些人造物使这条线上的免疫球蛋白倾斜。然而，存在一种可能性，即人工制品或偏见实际上已经部分地通过依赖从离体培养的样本，然后过滤到现有的模型和硅中预测算法例如，细胞间相互作用、细胞外环境组成、稳态营养与周期性营养(即改变培养基)之间的差异可能会导致某些肽在培养中丢失，而这些肽可以用小鼠生物反应器来挽救。虽然有一种有趣的可能性--考虑到这些肽群之间不同的电荷和极性分布，这也许更有道理--但这项研究并不是为了评估是否是这样的。在实用层面上，生长类型之间的肽分布差异很小，在许多应用中都不起作用，而且在其他两种细胞中也没有观察到这种现象。

我们还注意到，从每个异种移植物中回收的多肽数量存在一定的差异，这似乎与异种移植物组织的输入重量无关；如果有的话，最大的样本给出的肽最少。虽然在本研究中它没有受到控制，但似乎有可能是小鼠组织(如血管、基质等)的不同贡献。对于每个肿瘤的质量来说，可能是这种脱节的关键决定因素。因此，异种移植物的使用可能会受益于更严格的标准化策略，也许使用一些蛋白质组学或基于PCR的分析来量化小鼠和人类对样本的贡献。

对特定的翻译后修饰肽的研究可能是从旨在提高材料产量的技术中获益最多的，因为这些肽占据了所有分子的一小部分。我们观察了培养细胞和异种移植物细胞之间磷酸肽的保守性，再次揭示了大量的序列和整个免疫球蛋白水平的重叠。

有趣的是，尽管在我们的数据中缺乏证据证明我们的异种移植物细胞的大量免疫肽中含有小鼠肽，但在丰富的磷酸肽中发现了一个明显的异常。RQPsIELPSM(小写表示磷酸丝氨酸)在所有异种接枝样品中都有一定的频率--或者至少是一种质量和保留时间相同的离子--而不是在培养的离子中。虽然这个序列并不存在于人类蛋白质组中，但它存在于小鼠和淋巴细胞特异性蛋白1(LSP 1)中。此外，根据PhosphoSitePlus资源30众所周知，这种丝氨酸在小鼠体内被磷酸化。然而，它在这个数据集中的来源仍然存在一些谜团。关于它的细胞来源的假设很简单：虽然这些NSG小鼠确实缺乏一些免疫细胞，LSP 1。+单核细胞和中性粒细胞仍然存在，LSP 1的潜力也存在。+内皮细胞31，提供潜在的异种移植-近端来源。它的分子来源不太清楚。从理论上讲，它可能是从小鼠MHC中分离出来的，尽管它不能与任何一种小鼠H-2 MHC等位基因结合(使用这里使用的任何一种预测因子，NetMHC 4和MHCfl状)。有趣的是，这种磷肽可以在最近的小鼠免疫球蛋白项目的大多数肿瘤和正常组织样本的光谱中检测到。32...然而，在我们的数据中，这并不涉及这种肽的来源。在这项研究中，只有当使用抗H-2D药物时，才能检测到该肽。b抗MHC的B22-249.R1抗体(而不是抗H-2K抗体)b本研究中所用的NSG小鼠表达的是H-2D。d它不受这种抗体的约束33...非磷酸化的等效肽被弱预测将与HLA-B*07：02结合，但这也不能解释为什么它在许多异种移植样本中的存在，因为并非所有被测试的品系(例如MDA-MB-436)都表达这个等位基因。也许这种磷肽是由一些小鼠细胞制造的，其数量如此之多，以至于它能够进入细胞外空间，被动地加载到移植肾的HLA分子上--这可能是由于磷酸化而引起的亲和力增强--现代预测器所没有的。不管这种污染物的来源如何，它似乎是直接归因于小鼠序列的肽的唯一例子；考虑到发现的多肽数量，我们仍然认为这是一种可靠和有用的方法。

本研究以JY为研究对象，是迄今为止研究最多的免疫球蛋白系的有力竞争者，以此为例来验证我们的假说。它具有共同的、纯合的HLA等位基因，表达水平较高，在培养中易于生长。在这种情况下，肯定不需要像鼠异种移植这样的解决方案，因为细胞可以在类似的时间框架内培养。然而，在培养过程中，许多品系的生长速度远远低于JY，HLA等位基因的表达较低，结合亲和力分布较弱。在这种情况下，通过培养生产足够的材料即使不是不可能，也可能变得极其不切实际，因为操作人员的时间和组织培养设备的可用性可能变得有限。这些生产线可能是从异种移植物样品生产中获益最大的生产线，特别是在实验中，大量的生产线将同时生长。

应当指出，使用小鼠进行免疫接种除了需要典型的细胞培养能力要求外，还需要额外的专门设施、训练有素的工作人员以及监管和道德程序。然而，鉴于免疫学和癌症研究领域广泛采用了小鼠研究，我们期望许多群体能够利用这些设施，无论是在当地还是通过合作。这种方法也可能被纳入现有的研究中，例如那些探索PDX肿瘤生长但目前还没有耗尽所有组织的研究。鉴于这种方法在Colo 205细胞系上的重复性--本实验中培养的样本在异种移植物样本产生前大约八年就已经被加工并冷冻过肽，但仍然显示了显著的免疫球蛋白保护--有可能进行比我们的小组个人想象的范围更广的实验。事实上，我们预计这一方法将有助于免疫系统领域，因为它寻求扩展到更高的吞吐量和更多样化的应用。

方法

细胞培养

在含10%胎牛血清(FBS，吉布co#26140-079)或新生牛血清(NBS，Gemini Bio-Products#100-504)、2mm/1%GlutaMAX(热费舍尔科学#35050061)和1%青霉素链霉素的RPMI 1640中培养JY细胞。在DMEM/F12中培养MDA-MB-436，以胰蛋白酶法传代。细胞在标准条件下(37℃，腐殖化，5%CO)培养。2)，每周分裂三次，将细胞数保持在0.5-1×10之间。6/毫升。

培养细胞直接分离pMHC时，在连续传代培养过程中，通过收获细胞获得细胞。细胞在pbs中洗两次，计数，然后用预称重的锥形离心管球团。球团被冷冻在液氮中，在−80°C储存之前，重新称重以获得球团重量。

Tron细胞系门户34本研究用HLA等位基因获取细胞株的HLA等位基因信息。

动物

根据马萨诸塞州总医院批准的协议，所有动物程序都是按照联邦和机构动物护理和使用委员会的要求进行的。诺德-SCIDIL2RGamma零(NSG)小鼠(杰克逊实验室)按照制造商的指示在Matrigel(Corning)皮下植入细胞。5×106每只小鼠注射细胞。每天监测肿瘤负荷。一旦肿瘤大小达到200毫米3，用CO对小鼠进行安乐死。2，在−80°C保存前，将肿瘤快速采集并冷冻在液氮中。

pMHC分离

Mhc结合肽如前面所述被分离出来。6,14，在这里简单描述。首先，泛人类一级抗体W6/32(#93134，BioLegend)与NHS-sepharose珠(GE，17-0906-01)结合.每1×10制备抗体3mg9细胞或1克组织，以较大者为准。每1mg输入抗体使用100μ1的珠子。在PBS中清洗两次珠子，然后用抗体在一夜之间旋转孵育。第二天，用0.1MTris-HCl颗粒包裹，封闭1h，然后在0.1M醋酸盐/0.5M NaCl和0.1M Tris-HCl交替溶液中洗涤两次。微球再悬浮在20 mm Tris/150 mm NaCl中，残留抗体高达1mg/ml，保存于4°C，直至使用。

第二天，细胞在溶解缓冲液中溶解(对于JY肿瘤，用5 mm edta，pH 8，或用20 mm Tris-HCl，150 mm NaCl，1%chaps，p H 9，每1×10用5毫升)。9细胞或1克组织。裂解缓冲液中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒，全部来源于Sigma Aldrich：JY肿瘤标本分别用磷酸酶抑制剂鸡尾酒Ⅱ和Ⅲ(#P 5726和#P 0044)、抑肽酶(#A 4529)、亮肽素(#L 2884)和肽抑素A(#77170)溶解，其余样品分别用磷酸磷酸酶抑制剂和完整的微型蛋白酶抑制剂(分别为#4906845001和#11836153001)进行裂解。细胞冷冻后，在4°C缓冲液中旋转1~2h，裂解前用Miltenyi生物技术(Miltenyi Biotech)分离JY肿瘤标本，用氮冷组织粉碎机(Cellcrer)粉碎MDA-MB-436乳腺癌肿瘤标本。裂解细胞在36，800 rpm离心1小时，4℃下，上清液与早期制备的抗体珠结合物混合，在4°C下旋转一夜，使MHC结合。

第二天，球粒用10毫升的溶解缓冲液洗涤，再悬浮在~500μl 20 mm的Tris-HCL中，然后转移到微离心管或聚支柱柱上。在4°C下，用2×20 mm Tris-HCL，150 mm NaCl，2×20 mm Tris-HCl，1 M NaCl，3×1ml 20 mm Tris-HCl洗涤。洗涤后的珠，然后通过一个预湿的阿米孔超离心过滤柱(>=3 kDa，微孔)，所有的液体被离心除去。此时，列被并行处理，并存储在−80°C以供以后处理。

停退脱盐(舞台)小贴士

干珠结合HLA：肽复合物包含在Am图标过滤器被发送到阶段尖端清除方法。舞台技巧的制作如前所述。35对4E8~6E8C.eq进行脱盐处理。样本。采用以下洗涤步骤：甲醇1 0 0μl 3 5 0×g 2次1 min洗涤1 min，80%乙腈0.0 1%乙酸5 0μl 1 min洗涤1 0 0×g，2次1 min洗涤1 0 0μl 1%乙酸3 5 0×g，解冻后微球由滤池转移到单独的低蛋白结合管中，以保证完全转移。3 0 0×g离心1 min，将培养上清装在1 5 0μ1×g的台尖上，3500×g装1 min，用3%乙腈/5%乙酸的10 0μl洗涤，1%乙酸的5 0μl洗涤，3 5 0×g的培养上清液分别装于台尖1 min。

将10%醋酸的1 5 0μ1加入到管中，在室温下摇动5 min，洗脱结合在微球上的多肽。以300×g离心1 min，上清液转入低结合管。这一过程被重复，以确保从HLA分子和上清液加入低结合管的多肽完全洗脱。在10%醋酸洗脱上清液中加入两个内磷酸肽标准，每次250 fmol。然后，洗脱上清液在加载到舞台尖端之前，先进行3秒的超声处理。洗脱上清液以3500×g的浓度，以150个μl的浓度加载到舞台尖端，直至整个体积通过。用1%醋酸100μ1的三轮冲洗台尖。以乙腈浓度为20μ/0.1%乙酸，20μl为40%乙腈/0.1%乙酸，20μ1为60%乙腈/0.1%乙酸为洗脱剂。洗脱后的肽组分用Centrivap干燥完成，在0.1%甲酸中重组成1E7细胞等量的μ1，并保存在−80°C中，直至进一步使用。

非富集免疫肽MS

5 E7 C.Eq.将每个样品加载到熔融石英微毛细管分析柱(360μm.d.)。×75μm I.D.)配有皮砂砾，10μm电喷雾尖端，用20厘米的1.9μm C18 Reprosil树脂包装，并与高效液相色谱法连接。用0~30%溶剂B(80%乙腈，0.1%甲酸)在90 min内洗脱，流速为200 nL/min，电喷雾直接离子化进入轨道融合流明质谱。在轨道RAP质量分析仪上获得了全扫描高分辨质谱(MS1)，用HCD和ETD裂解法在仪器的线性离子阱中获得了MS/MS谱。采用高速扫描的方法，首先获得一次高分辨率MS1扫描(400 m/z时分辨率为60，000)，然后在第二时间(按丰度顺序)选择尽可能多的母体离子进行HCD和ETD的碎裂。数据相关参数包括重复计数3次，重复时间10秒，排除列表持续时间10次。此外，排除了电荷状态为+1的离子。附加参数包括预校准的ETD反应时间、FTMS自动增益控制(AGC)目标2e5电荷、ITMS AGC目标1e4电荷和ETD试剂目标1e4电荷。

mDA-MB-436样品中非富集免疫肽的分析在某些部分存在差异.2E7C.eq载于熔融石英微毛细管预柱(360 mg.d.)。(×75-mI.D.)配备2毫米卡西尔1624型冰箱，10厘米C18反相填料(直径5-20m，孔径120个)。分析柱(360μm o.d)。×50μm I.D.)用普通C18(直径5μm)填料包装，并配备激光牵引，电喷雾发射器尖端(2μm直径)。肽用溶剂B洗脱，乙腈用量为66%，乙酸用量为0.1%，洗脱时间为60~100 nL/min，在热科学™轨道饶舌聚变质谱仪上进行洗脱。MS1扫描采用相同的高速方法和数据相关参数，然后选择尽可能多的母离子，CAD对+2进行裂解，ETD选择+2和+3电荷态。对+3和+2离子的高分辨ETD和CAD分别累积到最大注入时间为120 ms的AGC目标值2E5，并以15K的分辨率在轨道分析仪上检测到。+2离子的补充低分辨率ETD的附加参数与JY相同.

磷肽富集与MS

如上文所述，样品通过固定金属亲和层析进行了费舍尔酯化和磷酸肽富集。36.

采用熔融石英微毛细管柱(360μm.d.)×75μm I.D.)配备2毫米Kasil 1624型冰箱，装有5.5cm的PorosMC 20亚氨基二乙酸酯树脂。iMac柱以20μl/min的流速进行压力清洗，步骤如下：20 min水冲洗，10 min 50 mm EDTA漂洗，10 min水冲洗。用10 0mm FeCl 3进行3轮活化5 min，流速为2 0μl/min，培养3 min，以0.5μ1/min的流速，以0.5μ1/min的流速，以0.5μ1/min的流速，与0.0 1%醋酸的25μl平衡。用1：1：1(甲醇：乙腈：0.01%醋酸，体积/体积)的50μl(甲醇：乙腈：0.01%醋酸，体积/体积)的方法，在活化的iMac柱上，以0.5μ1/min的流速，对干燥的酯化肽样品进行重组。样品加载后，将1：1：1的25μ1加入进样管，以0.5μl/min的流速加载到iMac柱上。在流速为0.5μl/min的条件下，用0.0 1%醋酸进行15μ1的最后冲洗。

熔融石英微毛细管预柱(360μm.d.×75μm I.D.)采用2 mm Kasil 1624冰箱，用8 cm 3μm C18填充树脂，通过Teflon套筒将树脂对接到iMac柱上，用新制备的250 mm L抗坏血酸在水中(PH 2)以0.5μl/min的流速洗脱到预柱上，流速为0.5μl/min，洗脱时间为60~90 min。在分离前柱与iMac柱分离之前，在相同流速下完成0.01%醋酸的最后冲洗。预柱连接到熔融石英微毛细管分析柱(360μm.d.)。×75μm I.D.)配有皮砂砾，10μm电喷雾尖端，用20厘米的1.9μm C18 Reprosil树脂包装，并与高效液相色谱法连接。

Jy磷酸肽用0~60%溶剂B(80%乙腈，0.1%甲酸)在60 min内洗脱，流速为200 nL/min，电喷雾直接离子化，直接进入轨道熔合流明质谱。在轨道RAP质量分析仪上获得全扫描高分辨质谱(MS1)，在线性离子阱中用CAD和ETD裂解法获得MS/MS谱。采用高速中性损耗触发方法，首先获得一次高分辨率MS1扫描(400 m/z时分辨率为60，000)，然后在3秒钟内选择尽可能多的母离子(按丰度顺序)进行CAD破碎。如果前8种产物离子中存在磷酸(Δ98 Da)损失的中性损耗特性，则对该前驱体进行电子衍射扫描。数据相关参数包括重复计数3次，重复时间10秒，排除列表持续时间10次。此外，排除了电荷状态为+1的离子。附加参数包括预校准的ETD反应时间、FTMS自动增益控制(AGC)目标2e5电荷、ITMS AGC目标1e4电荷和ETD试剂目标1e4电荷。MDA-MB-436磷酸肽的处理方法相似，但溶剂B由66%乙腈在0.1%乙酸中洗脱，在60~100 nL/min洗脱，在轨道饶舌融合中处理。

MS数据分析

数据分析用X杯软件(热电子公司)进行。对于标准免疫肽，使用Byonic(蛋白质计量学)搜索原始数据文件。37针对Swissprot人蛋白数据库，采用以下参数：无酶特异性、氧化修饰(蛋氨酸、色氨酸、半胱氨酸)、半胱氨酸(半胱氨酸)、磷酸化(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、±10 ppm前体耐受(MDA-MB-436±6 ppm)、±0.40 Da产物离子耐受和1%FDR。这还输出了每个肽的源蛋白。对MDA-MB-436样品的非富集免疫肽，在Byonic搜索中考虑了±6 ppm前体质量耐受和±20 ppm产物离子质量耐受。磷酸肽搜索还使用了甲基酯(天冬氨酸、谷氨酸、C-末端)参数的固定修饰。这两个搜索的点击率被用来指导分析，磷肽序列是通过精确的质量测量和对ms2光谱的手工解释来确定的。德雷沃测序。原始数据文件也被搜索到一个内部的磷酸肽数据库，其中包含了使用相同参数从以前的样本中识别出的所有磷酸肽。所有磷酸肽序列均经人工验证。

通过与已知数量的内部标准相比较，估算了已识别的磷酸肽的相对丰度，并对其进行了调整，以便在整个过程的各个步骤中恢复内部磷标准。计算每个细胞等效拷贝的假设是：1克组织相当于1e9细胞，1.6股细胞代表每细胞1份拷贝。

下游数据分析

大多数分析都是用Python(2.7.12或2.7.15)进行的，主要软件包如下：cip(1.1.0)；numpy(1.15.3)；matplotlib(2.2.3)；熊猫(0.23.4)；海运(0.9.0)；matplotlib_venn；upsetplan(0.1)；acora(2.2)；modlight(4.1.1)。

在此分析中，只考虑了8~15个氨基酸的多肽。在下游加工分析之前，所有的修饰都被剥离和重复序列组合起来。对于标准的(非富磷的)免疫球蛋白丰度值，由于不同尺度的不相容和所有数据集缺乏丰度值而被忽略。

肽-MHC结合预测软件(1.2.2)17用于分配可能的HLA等位基因结合等位基因和预测亲缘关系，在Python中被调用，而不是单独运行，预测亲和力值在1000 nm以下被指定为一个低阈值的潜在结合剂。肽被分配给具有最佳预测亲和力的等位基因，即最低的NM值。使用NetMHC-4.018为了确认MHCflzy的发现，作为一个独立的工具运行相关HLA等位基因的默认参数，等级分数在2以下被指定为潜在的粘合剂。

韦格式塔38在Web界面上运行时，使用了以下条件：‘Hapiens’，过度表达富集分析，遗传学，生物过程，以错误发现率(FDR)<0.05收集结果。将含有多肽的蛋白质的基因符号与SwissProt中列出的所有人类蛋白质的基因符号进行比较(2018年11月访问)。

利用Python中的acora软件包，利用aho-corasick字符串匹配算法，快速搜索含有大量潜在子字符串的序列，实现了人类肽与小鼠蛋白质组的重叠。39.

用modlAMP Python软件包计算肽的电物理性质。40...计算了pH值为7.4时的电荷值，包括C端酰胺。

Jaccard索引是两组元素之间规范化重叠的度量，范围从零(意思是没有重叠)到一个(用于比较具有相同列表的集合)。它被定义为相交(共享元素的数目)除以联合(两个集合中唯一元素的总数)。两个肽A和B列表的Jaccard是用下面的方程计算的(其中‘∩’表示两组之间共享的肽，和‘∪‘表示这两组组合中存在的多肽)。请注意，这个方程将每个唯一的肽序列视为独立于其他肽序列，而不管任何两个肽序列是否相似。由于肽因小的变化而不同(例如，单个残基差异，或同一序列的短/长版本)可以相当好地表示，这一指标可以被认为是免疫球蛋白相似性的保守度量。

$J(A，B)=\frac{A\capB}{A\杯B}$$

公共数据源

Jy RNAseq数据是通过SRA登录SRR 364065从NCBI下载的41...转录本用Kallisto进行假读量化。42(0.43.1版)针对GRCH 38参考文献，补充了EBV‘Akata’菌株的转录本43(以防止病毒序列的错位)。Jy蛋白质组数据来自Bassani-Sternberg先前的一项免疫球蛋白组研究。等人.20.

先前发表的JY免疫球蛋白来自Hassan的研究等人.16波德斯基等人.44，Bassani-Sternberg等人.20，和Caron等人.45...其他非JY控制免疫球蛋白来自SysteMHC Atlas项目。21...使用的样本是：MM 16，一种人类黑色素瘤样本。46(SYSMHC 00023)；THP 1，一种常用的单核细胞样白血病系，未发表(SYSMHC 002)；c 1866，T淋巴细胞系47(SYSMHC 00011)MDA-MB-436和Colo 205也作为JY的替代细胞，产生免疫球蛋白.SysteMHC/Tron中报道的这些品系的HLA等位基因如下：