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转录提交启动子缺失时初始激活信号在同型选择中的重要作用

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发表时间:2019-12-07 17:40作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

转录提交启动子缺失时初始激活信号在同型选择中的重要作用

摘要

类开关重组(CSR),专门针对免疫球蛋白重链的恒定区域(IgH)位点,通过产生不同的抗体效应器功能,在体液免疫中起着重要的作用。这个IgH恒定位点含有由细胞外信号诱导的多个同型启动子控制的基因,这些启动子激活特定的I启动子,从而导致B细胞的承诺。然而,目前尚不清楚在最初承诺给一个启动子后,无反应的I启动子是否不可逆转地沉默,或者在暴露于其特定的诱导剂后是否可以激活。在这里,我们研究了小鼠细胞株CH 12,致力于产生IgA对转化生长因子-β的反应。我们发现,虽然Iα以外的其他启动子在转录上是不活跃的,但它们并不是不可逆转的沉默。CRISPR/Cas9缺失提交的Iα启动子后,其他I启动子呈现复杂的转录模式,很大程度上依赖于初始的提交信号。

导言

体液免疫依赖于B细胞发育过程中通过不同过程产生的大量B细胞抗原受体。1,2...免疫球蛋白重链(IgH)位点,可变区在B细胞发育过程中经历V(D)J重组,导致可变基因片段(V(D)J)的组装。3,4,5...这个恒定区经历了类开关重组(CSR),使表达IgM的B细胞能够转换成其他类型(IgG、IgE、IgA)。6,7,8.

这个IgH常数区域包含多个常数(CH)基因,其转录启动子在同类型特异性启动子上启动,称为I启动子。6...I启动子主要由超增强子3‘rr(3’调控区)控制,由4个增强子(hs3a、hs1-2、hs3b和hs4)组成,位于hs3a、hs3b和hs4的下游。IgH轨迹9.

I启动子的转录是在其他免疫细胞类型的抗原相遇和信号传递时诱导的。6...I衍生转录在高度重复的序列(称为开关(S)序列)之间拉长,并生成二级结构,以促进酶AID(e.g.10,11,12)。在普遍供体S区和激活的下游S区,AID启动DNA断裂。这两个S区的连接使下游恒定区接近重排的VDJ基因片段,最终导致一个新的同工型的表达。6,7.

精巢研究表明,由特定信号激活的B细胞在重组到该特定的同工型之前,是转录上向激活的同工型提交的。13,14,15...这种转变前的“转录承诺”模型已被针对I启动子的各种突变研究所证实(e.g.16,17,18,19)。然而,目前尚不清楚最初未激活的I启动子是否不可逆转地沉默,或者当承诺的B细胞随后暴露于促进其激活的诱导剂中时,它们是否能被激活。

通过使用IgA承诺的B细胞株CH 12,我们证明了不承诺的I启动子并不是不可逆转的沉默。在所提交的Iα启动子被删除后,I启动子对初始激活的细胞因子的响应被激活。

结果

CRISPR/Cas9介导的CH12F3-2细胞Iα启动子缺失

小鼠细胞株CH12来源于CH12.LX淋巴瘤细胞系。这个细胞系被转录地提交给Iα启动子,即使在没有刺激的情况下它也具有基础活性,并且激活的CH12细胞完全转到iIgA上。20,21...在整个研究过程中,我们使用了亚克隆ch12f3-2。22(以下称为CH 12线或细胞)。

为了研究删除已提交的Iα启动子对上游I启动子和CSR激活的影响,我们设计了两个针对Iα启动子/外显子的CRISPR/Cas9导向RNA。1A)。因为在CH 12中,非生产性等位基因已经经历了S/Sα重组。22,23(补充图。S1a),它删除了除E/I增强子/启动子之外的所有I启动子(如图所示)。1A),gRNAs只针对生产等位基因。PCR筛选和测序确定了8个克隆与期望的缺失(补充图)。S1a-D).

图1
figure1

缺失Iα启动子/外显子可抑制CSR对IgA的影响。(A)IgHCH12F3-2基因座。未表达的等位基因是一个部分重排的dj。H等位基因进行S/Sα重组,从而删除所有上游诱导I启动子。诱导不同I启动子的有丝分裂原和细胞因子在顶部显示。靶区Iα启动子/外显子的侧翼用箭头指示。E/I增强子/启动子位于可变区和常区之间,3‘RR超增强子位于位点下游。(B)α缺失克隆的流式细胞仪分析。应用FACS技术对CRIPR/Cas9获得的8个克隆进行IgA表面表达分析。以亲本CH12细胞为对照,在LPS+IL4+转化生长因子β(LPS+IL4+TGF-)刺激前后进行对照。以点燃激活的脾B细胞作为对照组(n=3)。(C)以CH 12细胞和Iα缺失克隆(n°1)为代表的FACS图。

流式细胞术分析显示,在LIT(LPS+IL4+TGFβ)的作用下,CH12细胞对IgA有较强的抑制作用,其水平高于活化的脾B细胞(图1)。1B)。如预期的那样,没有一个Iα缺失的克隆切换到IgA(如图所示)。1B、C)。我们检查了三个随机突变的无性系反式-在生产等位基因的vdj外显子与非生产性等位基因的Cα区之间发生剪接(补充图)。S1E).

活化的CH 12细胞及其缺失克隆中的开关转录和CSR

为了确定CsR是否发生在不存在Iα启动子的情况下,我们首先在已知的诱导原代B细胞转换的刺激条件下进行了切换试验,LPS刺激诱导CSR向IgG 3和IgG2b,LPS+IL4对IgG 1和IgE,LPS+IFNγ到IgG2a,并点燃IgG2b和IgA。

流式细胞术分析显示,与活化的脾B细胞相比,在CH12和Iα缺失的克隆中,LPS、LPS+IFNγ和LPS+IL4分别不能诱导CSR向IgG 3、IgG2a和IgG 1转化。这些刺激都没有像预期的那样将CSR诱导成IgA(如图所示)。2A-C、补充图。S2S3)。这些结果在三个随机克隆中得到了证实,rt-qPCR定量检测了开关后转录本。24(补充图。S4).

图2
figure2

Iα-缺失的克隆在特定的刺激下不能进行CSR。(AC)LPS能激活CH12细胞、3个Iα缺失克隆和脾B细胞。a)、脂多糖+干扰素γ(B)或LPS+IL4(C)分别检测IgG 3、IgG2a和IgG 1。对未刺激(UNS)和活化的CH 12细胞、Iα缺失克隆(克隆5)和原代B细胞进行了代表性的分析。(D)f)rt-qPCR定量检测未受刺激和第2天激活的脾B细胞、CH 12细胞或克隆5、6和8对脂多糖(Sγ3)的切换前转录本(Sx转录本)D),致脂多糖+干扰素γ(Sγ2a)(E),或致LPS+IL4(Sγ1和Sε)(F)(n=3)。

对未受刺激(Uns)细胞中的开关前转录本进行量化,显示了该转录本。s除Sγ2a外,缺失克隆的水平高于CH 12。2D-F,补充图。S5)。此外,除Sε转录本外,其水平在激活的Iα缺失克隆中升高(如图所示)。2F),刺激后未进一步诱导开关转录(图1)。2D-F).

我们的结论是,删除提交的Iα启动子-调节大多数未提交的i启动子.

Iγ2b启动子在CH 12中是受点燃而非脂多糖刺激而诱导的。

在原代B细胞中,CSR对IgG2b有一定的诱导作用。我们询问CH12细胞中的CSR对IgG2b的诱导是否由刺激或仅对所承诺的同工型的诱导剂(i.e...点燃)。

流式细胞仪分析显示,与原代B细胞不同,LPS刺激在CH12或Iα缺失克隆中均未诱导CSR向IgG2b转化(图1)。3A)。在对LIT的反应中,CH 12细胞也未能切换到IgG2b,而Iα缺失的细胞则发生了向IgG2b的显著转换(图1)。3B)。虽然不同克隆间的CSR和IgG2b水平不同,但突变克隆的CSR和IgG2b水平一直低于CH 12细胞中的CSR和IgA水平(无花果)。1B、C3B)。因此,I-Cγ2b转录本水平仅在点燃刺激后升高(补充图1)。S6)。此外,与LPS刺激的克隆相比,在点燃刺激的克隆中检测到更高水平的Sγ2b预开关转录本(如图1所示)。3C-E)。令人惊讶的是,与原代B细胞不同的是,LPS能诱导Sγ2b转录,而LPS则抑制CH 12细胞系和所有Iα缺失克隆中Sγ2b的转录(如图1所示)。3C).

图3
figure3

β对IgG2b的CSR部分恢复,但不受LPS刺激的影响。(A,B)LPS能激活CH12细胞、3个Iα缺失克隆(2、3和5)和脾脏B细胞(A)或点燃(B)4天,IgG2b染色。对未刺激(UNS)细胞、活化的CH 12细胞、Iα缺失克隆(克隆5)和原代B细胞进行了代表性的分析。(C,DRT-qPCR定量检测未受刺激克隆5、6和8的Sγ2b前开关转录本水平及对LPS(C)或点燃(D)(第2天)。(E(3)LPS和LIT刺激后,Iα缺失克隆5、6和8 Sα2b前开关转录本水平的比较(n=3)。

这一数据表明,Sγ2b转录和随后的CSR到IgG2b是在Iα缺失的克隆中诱导的,但仅仅是对所承诺的同工型(LIT)的诱导剂的反应。

转化生长因子-β存在下开关转录和CSR的差异诱导

IgG2b仅对点燃刺激反应的意外发现表明,Iγ2b启动子在CH12细胞与原代B细胞中的反应不同。考虑到用抗CD 40+IL4+转化生长因子(Cit)激活CH 12细胞时,可以获得较高的转IgA水平。21,22我们想知道这种刺激措施是否和如何影响到IgG2b的CSR。

在CH12中,CIT作用下细胞在较高水平上转换为IgA,低于LIT(图5所示)。1B4在CIT存在的情况下,转入IgG2b的细胞比例较低。3B4)。同样,在Iα缺失的克隆中,用CIT切换到IgG2b比用LIT要高得多(图1)。4)。考虑到CIT对IgG2b细胞CSR的影响,我们分析了CIT处理细胞中CSR与其他亚型的关系。我们发现,切换到IgG 3发生在不同的效率,但转换水平是更高的响应CIT比发光(图一)。4)。转为IgG 1只发生与CIT,而CSR到IgG2a是无法检测到,无论是什么刺激(图)。4).

图4
figure4

LIT和CIT对CSR的差异诱导作用。用LIT或CIT对CH12细胞和3个Iα缺失克隆(3、5和8)进行4天的激活,并对所显示的亚型进行染色。对活化的CH 12细胞和Iα缺失的克隆(克隆5)(n≥3)进行了有代表性的研究.

然后我们询问,与LIT相比,CIT的转换增加是否伴随着转换转录的增加。CIT刺激CH12细胞后,Sγ2b预开关转录本水平升高,而缺失克隆中LIT和CIT转录水平无差异,脾B细胞Sγ2b转录本水平高于LIT(图1)。5A)。令人惊讶的是,当流式细胞术检测到CIT对IgA的CSR较高时,CH12细胞的Sα转录本水平高于CIT组,而活化的脾B细胞则无明显差异(图1)。5B)。Iα-删除克隆,如预期,没有产生Sα转录本.

图5
figure5

LIT和CIT对开关转录的差异诱导。(AFRT-qPCR定量检测Sγ2b(A),Sα(B,Sγ2a(C,Sγ3(D,Sγ1(E),以及Sε(F)在LIT或CIT刺激后,CH12细胞和Iα缺失克隆3、5和8中的开关前转录水平。用LIT和CIT激活脾B细胞Sγ2b的转录水平(A)及Sα(B),用LPS+IL4(Li),LIT和CIT对Sγ1和Sε(E,F)被装箱(n≥3)。

虽然CIT可使CSR升高至IgG 3,但无论刺激与否,Sγ2a(克隆5除外)和Sγ3转录本的水平在点燃和CIT激活的缺失克隆之间是相当的(图一)。5C,D).

在CH12细胞和缺失克隆中,LIT抑制Sε,而Sγ1不抑制Sγ1的转录,但Sγ1转录增加的克隆8除外。CIT诱导Sγ1和Sε转录。5 E、F和补充图。S7)。在脾B细胞中,CIT诱导Sγ1和Sε转录的效率与LPS+IL4(LI)相当,且水平高于LIT。5 E、F).

因此,在没有已提交的Iα启动子的情况下,不发生CSR到IgG2a,虽然切换到IgG 1发生仅与CIT,转换到IgG2b和IgG 3发生的同时响应于CIT和LIT。然而,对CIT的响应,开关量一直较高。令人惊讶的是,转换效率并不总是与开关转录水平相关。

缺乏相关性艾达转录水平与企业社会责任效率

由于启动CSR绝对需要酶AID,我们想知道在某些情况下,开关转录与CSR之间缺乏相关性是否是由于csr的低表达所致。艾达基因编码AID。

我们发现艾达在未刺激和刺激的条件下,CH12细胞和来源克隆的转录本水平均高于原代B细胞(图1)。6)。Li(LPS+IL4)未诱导艾达CH12和Iα缺失克隆中的转录,但仅在原代B细胞中转录(图1)。6)。与Li相比,LIT和CIT有效地诱导了艾达所有细胞中的基因。6).

图6
figure6

刺激依赖性诱导艾达基因转录用LPS+IL4(LI)、LIT或CIT激活CH12细胞、3个Iα缺失克隆(3、5、8)和脾B细胞。总RNA来自未受刺激和活化的细胞,艾达用RT-qPCR对转录本进行定量。肌动蛋白用转录本进行正常化(n≥3)。

因此,在CH12中没有切换到Sε和LI刺激后缺失的克隆与缺乏诱导相关。艾达在LIT和CIT存在的情况下,IgG2b和IgA的CSR与IgG2b和IgA的差异不一样。

hs1-2增强子对点燃而非CIT反应的转录增强

增强子RNA(ERNAs)是在脾B细胞活化后3‘RR处产生的,是3’RR活性的标志。25,26,27...然后,我们想知道在类似的激活情况下,开关转录和csr之间是否不相关。艾达,可通过3‘RR的转录活性差异来解释。为了检验这一点,我们量化了hs3a,hs1-2和hs3b的转录水平。

未受刺激的CH 12细胞与缺失克隆之间的eRNAs水平相当,且高于脾脏B细胞(图1)。7)。对于CH12细胞和缺失克隆,hs3a和hs3b的表达水平随LIT和CIT水平的变化不明显(尽管有一些克隆变异)。7有一个一致的趋势,HS1-2转录增加与点燃(图一)。7).

图7
figure7

3‘RR转录水平对点燃和CIT刺激。rt-qPCR定量检测hs3a、HS1-2和hs3b增强子的eRNAs水平。在刺激后第2天,从未受刺激的CH 12细胞和Iα缺失克隆(3、5和8)中提取总RNA。肌动蛋白转录本用于正常化,(-RT)对照包括在整个(n≥3)。

在LIT作用下HS1-2转录增强与Sγ1和Sε转录本的低水平相关,而在LIT存在下则检测到高水平的Sγ2b和Sα转录。因此,HS1-2增强子的转录增加不能单独解释开关转录与CSR之间的分离。

讨论

CH12细胞系被广泛用于研究CSR的各个方面。e.g.11,12,22,23,28)。然而,ITS I启动子的转录活性尚未被研究。我们研究了未提交的I启动子和CSR水平在最初提交的Iα启动子是否存在时的转录状态,以及对原代B细胞和/或CH 12所用的各种刺激后的转录状态。

用LPS、LI或LPS+IFNγ处理CH12细胞不激活任何I启动子。然而,这种阻断并不是不可逆转的,因为在未受刺激的细胞中,当所提交的Iα启动子被删除后,所有亚型(除Sγ2a可能除外)的开关转录子水平都会增加。这表明简单地删除已提交的启动子可以使其他I启动子获得相对开放的染色质状态。

在刺激Iα缺失克隆时,I启动子表现出不同的反应。例如,Iγ1仅由CIT诱导,Iε由Li诱导,更强烈地由CIT诱导,但受到LIT的抑制。因为LIT和CIT都含有转化生长因子-β,所以只有在CIT存在的情况下才能强烈诱导Iε和Iγ1。研究表明,在脾B细胞中,转化生长因子β诱导Id2抑制因子,拮抗碱性螺旋-环螺旋E2A和PAX 5转录因子的结合,阻止iε启动子(E2A)在Iγ1中的激活。29...我们发现,与CIT相比,LIT激活的脾B细胞Sγ1和Sε转录本水平降低。这些结果表明,转化生长因子β在脂多糖存在时对Sγ1和Sε的转录有影响,但对抗CD 40没有影响。这表明,通过CD 40的信号传递以某种方式绕过了TGF-β诱导的Id2介导的抑制转录因子的活性。与脂多糖结合的Toll样受体4(TLR 4)和CD 40分别优先触发NF-κB信号传导通路。30,31...尽管如此,LPS仍然可以通过与TLR 4和表面IgM结合来激活这两种途径。32,33...考虑到所有的i启动子(我除外)和3‘RR都有NF-κB结合位点6,9,34这表明,一方面转化生长因子β与脂多糖途径、另一方面转化生长因子β和CD 40配体途径之间的交叉对话,其转录结果比以前所认为的要复杂得多。

CIT诱导的CSR水平高于LIT,但CIT增加的CSR与开关转录之间并不一定存在相关性,如在LIT作用下CH12细胞Sα转录增加,以及两种刺激下缺失克隆Sγ2b转录水平相似。这表明可能涉及其他机制。我们调查了艾达不同刺激下的基因。我们证明了LIT和CIT,而不是Li,有效地诱导了艾达在CH12细胞和缺失克隆中。尽管如此,转换效率与艾达归纳法。一方面,对Li的响应切换到Sε的失败可能是由于没有诱导艾达,也可以是低水平的Sε转录本,或两者的结合。另一方面,CIT诱导CH12细胞中的IgA和IgG2b在缺失克隆中的CSR水平高于LIT,但这与CIT引起CH12细胞中IgA和IgG2b水平的显著增加无关。艾达基因诱导因此,AID水平本身无法解释CIT在切换效率上的巨大差异。对决点燃了。我们认为作用于AID下游的因素可能是CIT比LIT更强的诱导作用。

3‘RR的转录活性也可以解释I启动子的复杂转录模式。由于未受刺激的CH 12细胞和缺失克隆表达的eRNAs水平相似,缺失的启动子不影响3‘RR的活性。此外,CH 12细胞的eRNAs水平高于原代B细胞,对CIT不敏感。这表明,eRNAs已达到足以激活特定I启动子的水平。在这方面,应该注意的是,CH12基因已经打开了非表达的等位基因,i.e.这两种等位基因都经历了诱发3‘RR的激活(如图所示)。8).

图8
figure8

CH12线自然史模型。原始B细胞克隆的初始激活可能发生在涉及TGF-β和CD 40的T依赖性反应中。这导致了对Iα启动子的承诺,并在这两种等位基因上诱导了3‘RR转录,并随后对未表达的等位基因进行了转换。CSR机器以某种方式保留了初始激活信号(CIT)的记忆。Iα启动子和3‘RR在承诺的CH 12中保持活性。当所提交的Iα启动子缺失后,通常由γ或TGF-β诱导的Iγ2b只有在TGF-β的作用下才能诱导,而对IgG2b的最高开关水平则优先于初始信号(CIT)。

值得注意的是,LIT可进一步诱导HS1-2转录,这与Sγ1和Sε转录本的低水平有关。这种模式与Iγ1和Iε启动子与高转录的3‘RR增强子竞争转录因子的模型是一致的。27...然而,Iγ2b(类似于LIT和CIT)和Iα(由LIT诱导,而不是由CIT诱导)的激活模式暗示着不同的或附加的机制。可能涉及各种相互排斥的机制,包括特定于I启动子的局部因素(转录因子的组合效应,顺式-作用要素…),个体3‘RR促进剂与I启动子的优先相互作用35,36,物理上接近3‘RR。提示HS1-2增强子对IgG2b和IgA的抑制作用可能与Sγ2b和Sα竞争。超促进剂招募助理开发人员的情况已得到证实。37,38有证据表明AID可以瞄准3‘RR25.

这项研究的一个显著发现是,在对CIT的反应明显高于LIT的缺失克隆中,IgG2b与IgG2b的转换水平显著高于LIT。这是始料未及的,正如前面提到的,不可能是由于较高的开关转录水平或3‘RR eRNAs或AID水平,但可能意味着初始B细胞克隆的激活(产生CH 12细胞系)是在T依赖性反应的背景下进行的,而T依赖反应激活了CD 40通路。此外,CH12基因已经被排除在等位基因上,因此可能代表了一种先进的承诺状态。重要的是,在没有所承诺的启动子的情况下,特别是在CIT存在的情况下,Sγ2b的转录比在原代B细胞中的诱导更强,而且在所有的亚型中,最高水平的转换发生在特定的IgG2b上。因此,在转录和转换方面,γ2b亚型似乎是CIT的优先目标,i.e...可能的初始提交信号。我们最近发现,在转化生长因子β激活的脾B细胞中,Iγ2b和iα启动子竞争3‘RR。39...虽然我们无法确定在Iγ2b和Iα共同激活后还是在Iγ2b和Iα单独激活后对Iα启动子的承诺,但删除克隆中的CSR模式提出了这样一种可能性:对Iα启动子的承诺已经重新连接了CSR机制,因此,即使在删除了Iα之后,它的目标也是Iγ2b,并且对初始信号有最佳的切换(图)。8)。这是否与cit诱导形成转录工厂等专门的核室相一致?40这将有助于I,γ,2b-3‘RR互动和招募助理开发仍然有待探索。

总之,我们发现在CH12细胞中对Iα启动子的最初承诺阻断了其他启动子的转录激活。然而,封锁并不是不可逆转的。对一个特定的同工型的承诺似乎是针对CSR机制的,在这条通路中,刺激的细胞因子起着关键的作用,因此在没有所承诺的启动子的情况下,I启动子的激活对初始信号的响应是有利的。这将是一个有趣的探索,如果同样是对原代B细胞。

材料和方法

细胞培养

在含10%热灭活血清、10 mM HEPES、1mm丙酮酸钠、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、50μMβ-巯基乙醇、1倍非必需氨基酸的RPMI培养基中培养CH12和原代脾B细胞。

CH12细胞在密度为10的条件下刺激2~4天。5在50 g/ml LPS(LPS刺激)、50 g/ml LPS和20 ng/ml IFN-γ(IFN-γ刺激)、50μg/ml LPS和25 ng/ml IL4(EBioscience)(IL 4刺激)、50μg/ml LPS、10 ng/ml IL4和2ng/ml TGF-β(点燃刺激)、1g/ml抗CD 40(EBioscience)、10 ng/ml IL4和2ng/mlβ(CIT刺激)的作用下,细胞/ml。对原代脾B细胞的纯化和刺激进行了描述(参考文献)。40).

分子克隆

用T4多核苷酸激酶(Thermo Science)磷酸化gRNAs寡核苷酸,并进行退火。之后,他们与B连接。I或B贝斯我消化了PX 333质粒(Addgene)。以已证实的克隆产物为模板,用引物grna-M对gRNA盒进行PCR扩增。IFW和gRNA-MIREV,并将PCR片段克隆到M中。我消化了CMV-Cas9-GFP质粒(Sigma).经限制性酶切和测序鉴定正确克隆。所有引物都列于表中沙一.

CH12细胞转染

2×106将CMV-Cas9-GFP-gRNA转染细胞2g,用Amaxa Nucleofector II(Lonza)程序O-006和Amaxa细胞系Nucleofector Kit 5电穿孔转染细胞,转染细胞在37℃培养24h,GFP阳性细胞分为96孔板,培养7天,然后用适当的引物和GoTaq聚合酶(Promega)进行PCR检测。测序检测缺失克隆。

RT-qPCR

总RNA是从未经刺激或刺激的细胞收集在第2天或第4天后,使用商业试剂盒(Zymo Research)。总RNA反转录(Invitrogen),qPCR使用SSO快速Eva Green(BioRad),按照制造商的指示。肌动蛋白用转录本水平进行正常化,结果显示为肌动蛋白的百分比。(-RT)对照者对所有样本进行检测。

流式细胞术

在刺激后第4天,用抗-B 220 APC(BioLegend)和抗IgG3-FITC(BD-制药)、抗-IgG 1-FITC(BioLegend)、抗IgG2b-PE(BioLegend)、抗IgG2a-PE(BioLegend)或抗IgA-FITC(BD-制药)对细胞进行清洗和染色。数据在3×10上得到4使用库尔特XL装置(贝克曼库尔特)活细胞。

统计分析

结果以平均±sd(Graphpad Prism)表示,wt和突变小鼠的总体差异用双尾法评价。t测试一下。在以下情况下,两者之间的差异是显著的。p < 0.05 (*), very significant if p < 0.01 (**), and extremely significant if p < 0.001




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