CRISPR/Cas9介导的CH12F3-2细胞Iα启动子缺失 小鼠细胞株CH12来源于CH12.LX淋巴瘤细胞系。这个细胞系被转录地提交给Iα启动子，即使在没有刺激的情况下它也具有基础活性，并且激活的CH12细胞完全转到iIgA上。 20 , 21 ...在整个研究过程中，我们使用了亚克隆ch12f3-2。 22 (以下称为CH 12线或细胞)。
为了研究删除已提交的Iα启动子对上游I启动子和CSR激活的影响，我们设计了两个针对Iα启动子/外显子的CRISPR/Cas9导向RNA。 1A )。因为在CH 12中，非生产性等位基因已经经历了S/Sα重组。 22 , 23 (补充图。 S1a )，它删除了除E/I增强子/启动子之外的所有I启动子(如图所示)。 1A )，gRNAs只针对生产等位基因。PCR筛选和测序确定了8个克隆与期望的缺失(补充图)。 S1a-D ).
图1 缺失Iα启动子/外显子可抑制CSR对IgA的影响。( A ) IgH CH12F3-2基因座。未表达的等位基因是一个部分重排的dj。 H 等位基因进行S/Sα重组，从而删除所有上游诱导I启动子。诱导不同I启动子的有丝分裂原和细胞因子在顶部显示。靶区Iα启动子/外显子的侧翼用箭头指示。E/I增强子/启动子位于可变区和常区之间，3‘RR超增强子位于位点下游。( B )α缺失克隆的流式细胞仪分析。应用FACS技术对CRIPR/Cas9获得的8个克隆进行IgA表面表达分析。以亲本CH12细胞为对照，在LPS+IL4+转化生长因子β(LPS+IL4+TGF-)刺激前后进行对照。以点燃激活的脾B细胞作为对照组(n=3)。( C )以CH 12细胞和Iα缺失克隆(n°1)为代表的FACS图。
流式细胞术分析显示，在LIT(LPS+IL4+TGFβ)的作用下，CH12细胞对IgA有较强的抑制作用，其水平高于活化的脾B细胞(图1)。 1B )。如预期的那样，没有一个Iα缺失的克隆切换到IgA(如图所示)。 1B、C )。我们检查了三个随机突变的无性系 反式 -在生产等位基因的vdj外显子与非生产性等位基因的Cα区之间发生剪接(补充图)。 S1E ).
活化的CH 12细胞及其缺失克隆中的开关转录和CSR 为了确定CsR是否发生在不存在Iα启动子的情况下，我们首先在已知的诱导原代B细胞转换的刺激条件下进行了切换试验，LPS刺激诱导CSR向IgG 3和IgG2b，LPS+IL4对IgG 1和IgE，LPS+IFNγ到IgG2a，并点燃IgG2b和IgA。
流式细胞术分析显示，与活化的脾B细胞相比，在CH12和Iα缺失的克隆中，LPS、LPS+IFNγ和LPS+IL4分别不能诱导CSR向IgG 3、IgG2a和IgG 1转化。这些刺激都没有像预期的那样将CSR诱导成IgA(如图所示)。 2A-C 、补充图。 S2 和 S3 )。这些结果在三个随机克隆中得到了证实，rt-qPCR定量检测了开关后转录本。 24 (补充图。 S4 ).
图2 Iα-缺失的克隆在特定的刺激下不能进行CSR。( A – C )LPS能激活CH12细胞、3个Iα缺失克隆和脾B细胞。 a) 、脂多糖+干扰素γ( B )或LPS+IL4( C )分别检测IgG 3、IgG2a和IgG 1。对未刺激(UNS)和活化的CH 12细胞、Iα缺失克隆(克隆5)和原代B细胞进行了代表性的分析。 (D) – f) rt-qPCR定量检测未受刺激和第2天激活的脾B细胞、CH 12细胞或克隆5、6和8对脂多糖(Sγ3)的切换前转录本(Sx转录本) D )，致脂多糖+干扰素γ(Sγ2a)( E )，或致LPS+IL4(Sγ1和Sε)( F )(n=3)。
对未受刺激(Uns)细胞中的开关前转录本进行量化，显示了该转录本。 s 除Sγ2a外，缺失克隆的水平高于CH 12。 2D-F ，补充图。 S5 )。此外，除Sε转录本外，其水平在激活的Iα缺失克隆中升高(如图所示)。 2F )，刺激后未进一步诱导开关转录(图1)。 2D-F ).
我们的结论是，删除提交的Iα启动子-调节大多数未提交的i启动子.
Iγ2b启动子在CH 12中是受点燃而非脂多糖刺激而诱导的。 在原代B细胞中，CSR对IgG2b有一定的诱导作用。我们询问CH12细胞中的CSR对IgG2b的诱导是否由刺激或仅对所承诺的同工型的诱导剂( i . e ...点燃)。
流式细胞仪分析显示，与原代B细胞不同，LPS刺激在CH12或Iα缺失克隆中均未诱导CSR向IgG2b转化(图1)。 3A )。在对LIT的反应中，CH 12细胞也未能切换到IgG2b，而Iα缺失的细胞则发生了向IgG2b的显著转换(图1)。 3B )。虽然不同克隆间的CSR和IgG2b水平不同，但突变克隆的CSR和IgG2b水平一直低于CH 12细胞中的CSR和IgA水平(无花果)。 1B、C 和 3B )。因此，I-Cγ2b转录本水平仅在点燃刺激后升高(补充图1)。 S6 )。此外，与LPS刺激的克隆相比，在点燃刺激的克隆中检测到更高水平的Sγ2b预开关转录本(如图1所示)。 3C-E )。令人惊讶的是，与原代B细胞不同的是，LPS能诱导Sγ2b转录，而LPS则抑制CH 12细胞系和所有Iα缺失克隆中Sγ2b的转录(如图1所示)。 3C ).
图3 β对IgG2b的CSR部分恢复，但不受LPS刺激的影响。( A , B )LPS能激活CH12细胞、3个Iα缺失克隆(2、3和5)和脾脏B细胞( A )或点燃( B )4天，IgG2b染色。对未刺激(UNS)细胞、活化的CH 12细胞、Iα缺失克隆(克隆5)和原代B细胞进行了代表性的分析。( C , D RT-qPCR定量检测未受刺激克隆5、6和8的Sγ2b前开关转录本水平及对LPS( C )或点燃( D )(第2天)。( E (3)LPS和LIT刺激后，Iα缺失克隆5、6和8 Sα2b前开关转录本水平的比较(n=3)。
这一数据表明，Sγ2b转录和随后的CSR到IgG2b是在Iα缺失的克隆中诱导的，但仅仅是对所承诺的同工型(LIT)的诱导剂的反应。
转化生长因子-β存在下开关转录和CSR的差异诱导 IgG2b仅对点燃刺激反应的意外发现表明，Iγ2b启动子在CH12细胞与原代B细胞中的反应不同。考虑到用抗CD 40+IL4+转化生长因子(Cit)激活CH 12细胞时，可以获得较高的转IgA水平。 21 , 22 我们想知道这种刺激措施是否和如何影响到IgG2b的CSR。
在CH12中，CIT作用下细胞在较高水平上转换为IgA，低于LIT(图5所示)。 1B 和 4 在CIT存在的情况下，转入IgG2b的细胞比例较低。 3B 和 4 )。同样，在Iα缺失的克隆中，用CIT切换到IgG2b比用LIT要高得多(图1)。 4 )。考虑到CIT对IgG2b细胞CSR的影响，我们分析了CIT处理细胞中CSR与其他亚型的关系。我们发现，切换到IgG 3发生在不同的效率，但转换水平是更高的响应CIT比发光(图一)。 4 )。转为IgG 1只发生与CIT，而CSR到IgG2a是无法检测到，无论是什么刺激(图)。 4 ).
图4 LIT和CIT对CSR的差异诱导作用。用LIT或CIT对CH12细胞和3个Iα缺失克隆(3、5和8)进行4天的激活，并对所显示的亚型进行染色。对活化的CH 12细胞和Iα缺失的克隆(克隆5)(n≥3)进行了有代表性的研究.
然后我们询问，与LIT相比，CIT的转换增加是否伴随着转换转录的增加。CIT刺激CH12细胞后，Sγ2b预开关转录本水平升高，而缺失克隆中LIT和CIT转录水平无差异，脾B细胞Sγ2b转录本水平高于LIT(图1)。 5A )。令人惊讶的是，当流式细胞术检测到CIT对IgA的CSR较高时，CH12细胞的Sα转录本水平高于CIT组，而活化的脾B细胞则无明显差异(图1)。 5B )。Iα-删除克隆，如预期，没有产生Sα转录本.
图5 LIT和CIT对开关转录的差异诱导。( A – F RT-qPCR定量检测Sγ2b( A )，Sα( B ，Sγ2a( C ，Sγ3( D ，Sγ1( E )，以及Sε( F )在LIT或CIT刺激后，CH12细胞和Iα缺失克隆3、5和8中的开关前转录水平。用LIT和CIT激活脾B细胞Sγ2b的转录水平( A )及Sα( B )，用LPS+IL4(Li)，LIT和CIT对Sγ1和Sε( E , F )被装箱(n≥3)。
虽然CIT可使CSR升高至IgG 3，但无论刺激与否，Sγ2a(克隆5除外)和Sγ3转录本的水平在点燃和CIT激活的缺失克隆之间是相当的(图一)。 5C，D ).
在CH12细胞和缺失克隆中，LIT抑制Sε，而Sγ1不抑制Sγ1的转录，但Sγ1转录增加的克隆8除外。CIT诱导Sγ1和Sε转录。 5 E、F 和补充图。 S7 )。在脾B细胞中，CIT诱导Sγ1和Sε转录的效率与LPS+IL4(LI)相当，且水平高于LIT。 5 E、F ).
因此，在没有已提交的Iα启动子的情况下，不发生CSR到IgG2a，虽然切换到IgG 1发生仅与CIT，转换到IgG2b和IgG 3发生的同时响应于CIT和LIT。然而，对CIT的响应，开关量一直较高。令人惊讶的是，转换效率并不总是与开关转录水平相关。
缺乏相关性 艾达 转录水平与企业社会责任效率 由于启动CSR绝对需要酶AID，我们想知道在某些情况下，开关转录与CSR之间缺乏相关性是否是由于csr的低表达所致。 艾达 基因编码AID。
我们发现 艾达 在未刺激和刺激的条件下，CH12细胞和来源克隆的转录本水平均高于原代B细胞(图1)。 6 )。Li(LPS+IL4)未诱导 艾达 CH12和Iα缺失克隆中的转录，但仅在原代B细胞中转录(图1)。 6 )。与Li相比，LIT和CIT有效地诱导了 艾达 所有细胞中的基因。 6 ).
图6 刺激依赖性诱导 艾达 基因转录用LPS+IL4(LI)、LIT或CIT激活CH12细胞、3个Iα缺失克隆(3、5、8)和脾B细胞。总RNA来自未受刺激和活化的细胞， 艾达 用RT-qPCR对转录本进行定量。 肌动蛋白 用转录本进行正常化(n≥3)。
因此，在CH12中没有切换到Sε和LI刺激后缺失的克隆与缺乏诱导相关。 艾达 在LIT和CIT存在的情况下，IgG2b和IgA的CSR与IgG2b和IgA的差异不一样。
hs1-2增强子对点燃而非CIT反应的转录增强 增强子RNA(ERNAs)是在脾B细胞活化后3‘RR处产生的，是3’RR活性的标志。 25 , 26 , 27 ...然后，我们想知道在类似的激活情况下，开关转录和csr之间是否不相关。 艾达 ，可通过3‘RR的转录活性差异来解释。为了检验这一点，我们量化了hs3a，hs1-2和hs3b的转录水平。
未受刺激的CH 12细胞与缺失克隆之间的eRNAs水平相当，且高于脾脏B细胞(图1)。 7 )。对于CH12细胞和缺失克隆，hs3a和hs3b的表达水平随LIT和CIT水平的变化不明显(尽管有一些克隆变异)。 7 有一个一致的趋势，HS1-2转录增加与点燃(图一)。 7 ).
图7 3‘RR转录水平对点燃和CIT刺激。rt-qPCR定量检测hs3a、HS1-2和hs3b增强子的eRNAs水平。在刺激后第2天，从未受刺激的CH 12细胞和Iα缺失克隆(3、5和8)中提取总RNA。 肌动蛋白 转录本用于正常化，(-RT)对照包括在整个(n≥3)。
在LIT作用下HS1-2转录增强与Sγ1和Sε转录本的低水平相关，而在LIT存在下则检测到高水平的Sγ2b和Sα转录。因此，HS1-2增强子的转录增加不能单独解释开关转录与CSR之间的分离。
