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多态MFGE 8系统性红斑狼疮患者基因表达调控与易感性及临床表现的关系

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发表时间:2019-12-07 18:39作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

多态MFGE 8系统性红斑狼疮患者基因表达调控与易感性及临床表现的关系

摘要

系统性红斑狼疮(SLE)的特点是凋亡细胞清除受损。乳脂球表皮生长因子8(MFGE 8)是一种将吞噬巨噬细胞上的αvβ3整合素与凋亡细胞上的磷脂酰丝氨酸连接起来的蛋白。我们调查了MFGE 8基因和血清MFGE 8浓度与SLE有关。单核苷酸多态性(SNPs)进行基因分型和血清浓度分析。SLE患者rs2271715C等位基因和rs3743388G等位基因频率高于正常人(HSS)。在4个SNPs(rs 4945,rs 1878327,rs 2271715,rs 3743388)中发现3个单倍型:AACG,CGCG和CGTC。CGCG单倍型在SLE中明显高于HSS。rs 4945与血沉有关,rs 1878327与脱发、C反应蛋白、补体3、抗dsDNA抗体及高疾病活性有关。rs 2271715和rs 3743388与肾脏疾病、累积糖皮质激素剂量、环磷酰胺和霉酚酸酯用量有关。SLE患者血清MFGE 8浓度明显高于HSS患者。此外,SLE患者MFGE 8水平显著高于rs 2271715 CC基因型的HSS。最后,MFGE 8遗传多态性不仅与SLE易感性有关,而且通过基因表达调控与疾病活动有关。

导言

系统性红斑狼疮(SLE)是一种影响多种器官(皮肤、血液、肾脏和肌肉骨骼系统)的自身免疫性疾病,可受到慢性炎症反应的损害,其特点是由于缺乏免疫耐受而产生各种自身抗体。1...系统性红斑狼疮在育龄妇女中的患病率最高,亚洲人的患病率高于白种人。当系统性红斑狼疮发生时,炎症反应可能导致不可逆的损害,包括肾功能衰竭;然而,器官损害可以通过充分的诊断、评估和治疗加以预防。系统性红斑狼疮的发病机制复杂,与环境和遗传因素有关。2...10%的SLE患者有系统性红斑狼疮家族史或后发危险。系统性红斑狼疮在同卵双生子中的频率为24%,在双卵双胞胎中的频率为2%。3...这些发现提示,表达补体或主要组织相容性复合体的特定基因的多态性可能在SLE的发生发展中起着遗传因素的作用。4,5.

在过去的十年中,我们对系统性红斑狼疮的遗传基础的理解通过使用全基因组关联研究(GWAS)来提高,这些研究提供了与常见变异相关的有说服力的证据。研究人员继续寻找与系统性红斑狼疮风险相关的新基因座,在先前已知的基因座中,新的基因座占遗传性系统性红斑狼疮病例的24%。6,7...虽然基因的鉴定对了解疾病的发病机制有很大的帮助,但统计的一致性受到了限制。8...GWAS将重点放在常见的变体上,因此很难解释罕见变体和遗传力的相对影响。9...因此,GWAS具有局限性,需要一种新的候选基因识别方法。

细胞凋亡也被称为有计划的细胞死亡或细胞自杀,是通过去除异常的、受损的或老化的细胞来维持整体健康所必需的。大多数凋亡细胞通过非炎症途径被巨噬细胞清除.凋亡是由巨噬细胞通过接触磷脂酰丝氨酸(Ps)而识别的信号触发的。10...去除死亡细胞可避免暴露于自身抗原中,并能提供强大的抗炎和免疫抑制作用,这对于预防自身免疫诱导具有重要意义。鉴定和去除死亡细胞的过程涉及许多物质,包括Tyro-Axl-Mer(TAM)激酶、蛋白S和Gas6。最近的研究表明,TAM受体酪氨酸激酶通过促进凋亡细胞的吞噬作用而抑制炎症,并通过诱导吞噬和刺激自然杀伤细胞的发育来阻止自身免疫的发展。11,12.

乳脂球表皮生长因子8(MFGE 8)是一种存在于乳腺和乳脂腺中的糖蛋白。这种蛋白与死亡细胞中的巨噬细胞整合素和ps结合,在这两种物质之间起着桥梁的作用;因此,MFGE 8也与凋亡细胞的清除有关。13,14,15...适量的MFGE 8有助于凋亡细胞的清除,但过多的竞争抑制了这一功能。在小鼠模型中,MFGE 8缺乏会导致淋巴细胞在淋巴器官中的积聚和自身抗体的发育,从而导致类似于SLE的疾病。16...因此,本研究旨在分析MFGE 8基因多态性与韩国SLE患者易感性及临床表型的关系。此外,还评估了不同基因型MFGE 8蛋白表达的差异。

结果

受试者的临床特征

280例SLE患者的平均年龄为35.7±7.8岁,260例健康人的平均年龄为28.1±7.4岁(补充表)1)。SLE患者和HSS患者以女性居多(分别为259例、92.5%和241例、92.7%)。两组间年龄、性别差异无统计学意义。SLE患者的症状包括口腔溃疡(53例,18.9%)、皮疹(49例,17.5%)、脱发(40例,14.3%)、关节炎(74例,26.4%)和肾病(57例,20.4%)。平均白细胞计数为5.63±2.52×10~3/μL,平均血沉为23.7±21.4mm/h,C-反应蛋白为1.05±2.9mg/dL,补体C3为96.5±34.4mg/dL,补体C4为21.5±11.0mg/dL。抗dsDNA抗体阳性121例(43.2%),平均SLE疾病活动指数(SLEDAI)为4.5±4.5。共使用糖皮质激素241例(86.1%),累计剂量为6,739.9±9,622.6 mg强的松龙当量。

确定MFGE 8韩国人基因型

dna测序是为整个MFGE 820例韩国SLE患者和20例HSS患者的基因检测我们比较了国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中报告的DNA序列和单核苷酸多态性(SNPs),并选择了至少5%小等位基因的12个SNPs。NCBI数据库中没有报告两个SNP(5306C>T,11743 T>C)。1)。在35例SLE患者和10例HSS患者的基础上,对12个SNPs进行DNA测序。对55例系统性红斑狼疮(SLE)患者和30例HSS患者进行了独立样本的评价。t-测试。我们选择了5个目标SNPs(rs 4945 C/A,rs 1878326 C/A,rs 1878327 A/G,rs 2271715 T/C,rs 3743388C/G),P值<3%(P<0.03);2).

图1
figure1

MFGE 8基因图谱这个MFGE 8基因由10个外显子组成,由9个内含子分离,Chr 15=15号染色体,NCBI数据库中无SNP数据。

协会MFGE 8系统性红斑狼疮危险基因多态性

找出MFGE 8对225例SLE患者和230例HSS患者(共280例SLE患者和260例HSS患者)进行基因型、DNA测序。适合性验证试验表明,根据Hardy-Weinberg平衡,维持遗传平衡需要5个SNPs的基因型频率(表)。1)。回归分析显示,rs2271715C>A基因型和rs3743388G>C基因型在系统性红斑狼疮患者中均较高,差异有显着性(P=0.036和P=0.005)。对5个SNP的连锁不平衡分析表明,rs 1878326 SNP和rs 1878327 SNP有很强的相关性(r2=0.879)(附图。1)。用SHEsis软件对4个SNP中的3个单倍型进行了鉴定。17,CGCG单倍型与系统性红斑狼疮有统计学意义(P=0.001;表)2).

表1基因多态性的基因型和等位基因频率MFGE 8基因。
表2的单倍型分析MFGE 8基因。

协会MFGE 8系统性红斑狼疮患者基因多态性与临床特征的关系

我们研究了MFGE 8SLE基因多态性与临床特征(表)3)。在rs 4945中,CC基因型组的血沉低于CA和AA基因型组(22.6±19.6mm/h,28.1±29.3mm/h,P=0.004)。rs1878326中CC基因型组CRP水平(1.33±3.4mg/dL)高于其他基因型组(0.52±1.5mg/dL,P<0.001),抗dsDNA抗体水平(12.6±21.5IU/mL)高于其他基因型组(8±14.3IU/mL,P<0.001)。CC基因型患者活动性疾病(SLEDAI评分>6分)较多(34%比15.5%,P<0.001),累积糖皮质激素剂量(8,561±11,239 mg)高于5,651±8,391 mg强的松龙(P=0.007)。在rs 1878327中,GG基因型的脱发率(20.2%比11.0%,P=0.037)和活动性疾病(SLEDAI评分>6分)高于其他基因型(34.4%比16%,P<0.001)。GG基因型CRP水平较高(1.42±4mg/dL,0.51±1.5mg/dL,P<0.001),补体C3水平较低(92.7±42mg/dL,96±33.2mg/dL,P=0.014),抗dsDNA抗体水平(12.2±21.3IU/mL,8.4±14.9IU/mL,P=0.004)。

表3.按基因型分列的临床表现比较MFGE 8SLE患者的基因。

在rs 2271715中,CC基因型患者肾脏疾病的发生率(36.5%比15.7%,P=0.001)高于其他基因型(10,129±13,242 mg与5,767±8,107 mg泼尼松龙当量,P<0.001)。CC基因型以环磷酰胺(14.3%vs6.5%,P=0.028)和霉酚酸酯(19.0%vs6.9%,P=0.002)为主。

在rs 3743388中,GG基因型的抗dsDNA抗体水平较高(11.4±21.4IU/mL,9.2±16.1IU/mL,P=0.023)。GG基因型患者肾脏疾病发生率(35.3%比15.6%,P=0.001),累积糖皮质激素剂量(10,982±13,141 mg vs 5,393±7,793 mg,P<0.001)。GG基因型患者使用环磷酰胺和MMF的频率较高(分别为16.2%和5.7%,P=0.004和19.1%比6.6%,P=0.001)。

SLE患者MFGE 8蛋白表达的分析

48例SLE患者SLEDAI评分>6和40岁与性别匹配的HSS(补充表)检测MFGE 8蛋白的表达3)。SLE患者血清MFGE 8水平(2,030.6±2,308.3pg/mL)高于HSS患者(1,433±946.3)pg/mL(P=0.017)。2).

图2
figure2

系统性红斑狼疮(SLE)患者和正常人(HSS)血清MFGE 8浓度的测定SLE患者平均年龄为34.8±8岁,女性为87.5%,HSS为33±7岁和87.5%。SLE患者血清MFGE 8浓度为2,030.6±2,308.3pg/mL,HSS为1,433±946.3 pg/mL,P=0.017。

相互关系MFGE 8SNP基因与蛋白表达

rs 4945 CA或AA基因型SLE患者MFGE 8蛋白水平显著高于rs 4945 CC基因型患者(5,136.1±2,140.5pg/mL,1841.8±1,168.6pg/mL,P<0.001);4)。此外,rs2271715CC基因型的NCS的MFGE 8蛋白水平显著高于对照组(1,571.6±461.1 pg/mL,1407.7±1,022.9 pg/mL,P=0.037)。在按基因型比较MFGE 8蛋白水平时,rs 4945 CA或AA基因型的系统性红斑狼疮患者明显高于相同基因型的系统性红斑狼疮患者(2454.8±480.4 pg/mL,P=0.035)。此外,在rs2271715CC基因型中,SLE患者MFGE 8蛋白水平高于HSS患者(2460,2±1,158.3pg/mL,1,571.6±461.1 pg/mL,P=0.004)。

表4.按基因型分列的血清MFG-E8浓度MFGE 848例系统性红斑狼疮患者和40例健康人的基因检测

讨论

本研究通过搜索整个系统中的5个SNP来识别出5个SNP。MFGE 8韩国系统性红斑狼疮患者基因组。rs2271715的CC基因型和rs 3743388的GG基因型在SLE患者中较HSS多见。在单倍型分析中,CGCG单倍型的SLE风险增加了2.3倍.此外,这些SNPs与SLE的多个疾病活动标志物和肾脏疾病有关。此外,MFGE 8蛋白在SLE患者中的表达水平显著高于基因型相同的HSS患者。

人类基因组计划和国际人类HapMap项目提供了与复杂疾病相关的遗传变异的参考信息,而微阵列技术的进步现在使得大量的SNP标记可以同时被筛选出来。18,19,20...然而,基于一个共同的变体假说的gWAS引起了争议。21...虽然通过使用GWAS发现了新的遗传标记,但各种指标提供的解释很少。由于GWAS不能解释信号通路和基因之间的联系,所以这些发现不能用来识别和预防疾病的起因。22...因此,需要一个候选基因分析才能准确地识别一个关联。

MFGE 8是在凋亡细胞和吞噬细胞之间插入的一种桥接分子,在死亡细胞的清除过程中起着重要的作用。MFGE 8蛋白水平与SLE的发病机制密切相关。日本、台湾和美国对MFGE 8的研究已有报道。23,24,25,26,27然而,没有任何先前的研究与此相关。MFGE 8功能多态性因此,本研究评估了MFGE 8韩国SLE患者MFGE 8蛋白水平的多态性与SLE

首先,对整个系统进行dna测序。MFGE 8将向NCBI报告的SNPs与5个较小的SNP(rs 4945,rs 1878326,rs 1878327,rs 2271715,rs 3743388)进行比较。其中,rs 4945在台湾SLE患者中也进行了研究。单用基因型比较,SLE患者rs2271715C等位基因和rs3743388G等位基因频率高于HSS患者。根据向NCBI报告的数据,rs2271715T等位基因和rs3743388C等位基因在欧洲人、中国人、日本人和韩国人中更常见。提示SLE患者rs2271715C等位基因和rs3743388G等位基因频率较高。在CGCG单倍型的4个单倍型中,3个单倍型在系统性红斑狼疮患者和系统性红斑狼疮患者之间有显着性差异(P=0.001),患系统性红斑狼疮的风险增加了2.3倍。对SLE临床特征与MFGE 8 SNP的相关性分析表明,rs 4945与ESR相关,rs 1878326与CRP、抗dsDNA抗体、SLEDAI评分、糖皮质激素剂量相关,rs 1878327与脱发、CRP、补体C3、抗dsDNA、SLEDAI评分相关。rs 2271715和rs 3743388与肾脏疾病、糖皮质激素剂量、环磷酰胺和MMF的使用有关。此外,rs3743388 SNP与抗dsDNA抗体有关联。这些结果提示,这5个SNPs不仅与SLE的发生有关,而且与临床表现有关。

有报道称,2型糖尿病患者血液中MFGE 8的水平高于hss。24...降低糖尿病小鼠模型中MFGE 8的表达可减轻糖尿病的一个主要并发症--动脉粥样硬化。因此,MFGE 8的表达水平是影响其功能的重要因素,可能与SLE等自身免疫性疾病的发病机制有关。此外,日本SLE患者血清MFGE 8水平显著高于健康人。23,28...此外,SLE的药物治疗导致MFGE 8水平显著降低。在另一项研究中,系统性红斑狼疮患者mfge 8的过度分泌通过减少中性粒细胞的迁移和中性粒细胞外陷阱的形成来保护其免受狼疮相关的损害。29.

我们发现SLE患者血清MFGE 8水平高于HSS患者。这与以前的研究结果是一致的。此外,我们还检验了MFGE 8基因型和蛋白质水平。rs2271715CC基因型SLE患者MFGE 8蛋白水平显著高于相同基因型SLE患者。提示危险基因型rs 2271715的SLE患者MFGE 8水平升高参与了SLE的发病机制。此外,高水平的MFGE 8可能导致竞争性抑制凋亡细胞的吞噬功能。这可能导致凋亡细胞的不完全消除,进而导致自身抗原暴露于SLE的免疫细胞。揭示MFGE 8过表达驱动的系统性红斑狼疮的机制可能会增加对自身免疫性疾病的认识,但还需要进一步的研究。

结果表明,MFGE8rs2271715和rs3743388SNP不仅通过增加MFGE 8蛋白而增加SLE的发病风险,而且影响SLE疾病的活动。此外,rs 4945、rs 1878326和rs 1878327可作为SLE疾病活动的生物标志物。此外,SLE患者MFGE 8蛋白水平高于HSS患者。本研究的重点是纳入系统性红斑狼疮的临床表现和血清MFGE 8水平的测定。

关于狼疮性肾炎和mfge 8蛋白,mfg-e8基因多态性研究表明,mfge 8缺乏小鼠和SLE患者均有肾小球肾炎,但在有或不伴狼疮肾炎的SLE患者中,mfge 8基因型分布无显着性差异。26...在我们的研究中,rs 2271715和rs 3743388与肾脏疾病和使用环磷酰胺和MMF有关。

最后,MFGE 8遗传多态性不仅与系统性红斑狼疮易感性有关,还与疾病活动有关,因为它们对基因表达的影响。

方法

SLE患者与正常人

这项研究包括280例SLE患者和260例HSS患者。所有患者均符合修订后的美国风湿病学会(1997年)系统性红斑狼疮分类标准中的4项标准。30...这项研究得到了Ajou大学医院的机构审查委员会的批准(AJIRB-BMR-GE15-237),所有受试者都给予了知情同意。这项研究的所有程序都是按照核准的准则进行的。收集患者的临床特征、血清检测结果和药物状况,并在数据库中进行登记。采自系统性红斑狼疮和系统性红斑狼疮患者的血样,立即保存在−70°C。

基因组DNA提取

基因组DNA从SLE和HSS患者的全血中提取,根据制造商的指示,使用总DNA提取试剂盒(IntronBioTechnology,韩国首尔)。洗脱后的基因组DNA样品分别用分光光度计(NanoDrop Lite;Thermo,Waltham,MA,USA)定量。

单核苷酸多态性鉴定MFGE 8基因

SNP基因分型分3步进行。首先,SNPs被鉴定为DNA序列,与核苷酸序列相比,其最小等位基因频率至少为5%。使用dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP)。然后,我们设计了正反向引物(每条18条)。MFGE 8使用NCBI报告的核苷酸序列的基因(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)以确定MFGE 8基因(补充表)4)。用这些引物对20例SLE和HSS患者的基因组DNA进行了聚合酶链反应分析。然后我们选择了至少5%的小等位基因频率的12个SNPs。接下来,DNA测序MFGE 8基因检测采用36对引物(韩国首尔,CosmoGenetech)。用测序程序(基因编码公司、安阿伯、MI、美国)证实了分析结果,并将55例系统性红斑狼疮患者和30例HSS患者的核苷酸序列与独立样本进行了比较。t-测试。最后选择了5个靶SNPs(rs 4945 C/A,rs 1878326 C/A,rs 1878327 A/G,rs 2271715 T/C,rs 3743388C/G),P值<3%。

酶联免疫吸附试验

采用夹心ELISA法(人MFGE 8 Quantikine ELISA试剂盒;R&D系统,明尼阿波利斯,MN,美国)根据制造商的协议对MFGE 8的血清浓度进行分析。在微板吸收分光光度计(Bio-Rad实验室,大力士,CA,美国)上测量了450 nm的吸光度,并用微板管理器对数据进行了标准曲线分析。®软件(Bio-Rad实验室)。

统计分析

所分析的SNP模型与遗传形式一致,不计统计显着性,采用加性、显性和隐性三种模型。接下来,每个snp被转换成这三个模型和一个独立的样本。t-试验证实SLE与HSS的相关性。此外,采用SNP、临床特征、血清检测结果和用药史等多种优势模型进行多元线性回归分析、Mann-Whitney U检验和方差分析。用一份独立样本测定系统性红斑狼疮(SLE)患者和HSS患者间MFGE 8蛋白水平的差异。t-测试。在评价MFGE 8 SNP与MFGE 8蛋白表达水平的相关性后,采用Mann-Whitney U检验和多元线性回归分析,分析相同SNP的SLE和HSS患者的蛋白质水平差异。P值<0.05,有统计学意义。




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