改变水通道蛋白5(AQP 5)免疫细胞的表达影响炎症的主要机制，并与脓毒症的存活有关。因为表观遗传调控通过dna甲基化可能有助于差异AQP 5在脓毒症中的表达，我们检验了DNA甲基化的假设AQP 5促进者(1)影响AQP 5(2)与脓毒症患者30天的生存有关，(3)改变核转录因子NF-κB的结合。AQP 5应用实时定量PCR技术对135例脓毒症患者全血标本中mRNA表达进行定量分析.硅中计算机分析AQP 5启动子(NT-567~NT-975)检测到7个炎症转录因子结合位点，并对其甲基化进行了分析。用电泳迁移率变化法检测核NF-κB与核因子NF-B的结合。AQP 5启动子区NT-937。经多次检测调整后，在tt-937的胞嘧啶位点甲基化率较高。AQP 5非生还者与幸存者NF-κB结合的启动子连接(p=0.002，p[医]=0.014)。这与更大的AQP 5非幸存者组织中mRNA的表达(p=0.037)。NT-937基因启动子甲基化程度较高(≥16%)也与30天内独立增加的死亡风险有关(HR：3.31；95%CI：1.54~6.23；p=0.002)。我们发现了一个重要的功能AQP 5启动子胞嘧啶位点(NT-937)与炎症作用的核转录因子NF-κB结合，非脓毒症患者甲基化增加。因此，NT-937 APQ 5启动子甲基化(可能与NF-κB结合有关)在脓毒症中具有预测意义，表明表观遗传改变对脓毒症的结局有影响。

脓毒症是一种严重的疾病，其死亡率仍然很高。1...因此，对诊断和治疗目标的识别是当前研究的基石。由于脓毒症结果的广泛变异性不能仅由患者的共患性和触发感染的严重程度来解释，其中一些变异可能受基因变异的影响，而遗传变异又可能提供对相关脓毒症机制的了解。

水通道蛋白似乎是一个很有前途的诊断和治疗目标。2，特别是水通道蛋白5基因(AQP 5)3. AQP 5介导炎症的主要机制，包括免疫细胞迁移和增殖。4,5，肾素-血管紧张素-醛固酮系统的活性6，以及水在细胞膜上的传输7...因此，AQP 5与脓毒症常见的许多病理生理特性有关，其改变的表达似乎是一个重要的调节机制。2...在此背景下，先前的研究表明，炎症介质可以诱导下调AQP 5蛋白和mRNA表达8,9...尤其是，越来越多的证据表明，促炎症NF-κB通路的激活减弱了。AQP 5表达10,11,12...值得注意的是AQP 5可归因于AQP 51364 A/C单核苷酸启动子多态性(SNP；rs 3759129)显著提高急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者的生存率13脓毒症14...此外，AQP 5-1364 A/C与更大AQP 5表达显示急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者肺部炎症增加，急性肾损伤风险增加。13,15...因此，这些结果表明了较小的保护作用。AQP 5在炎症性疾病中的表达及与改变相关的机制AQP 5表达是非常有趣的。

5‘-磷酸胞嘧啶-鸟嘌呤-3’(CpG)序列中胞嘧啶残基甲基化是调控基因表达的一种频繁的表观遗传修饰。16启动子甲基化的程度也会影响AQP 5表达17,18...的整体甲基化程度更高AQP 5启动子减少了报告基因的转录，而5-氮胞苷的去甲基化作用更大。AQP 5表达18.

在脓毒症的背景下，越来越多的证据表明表观遗传修饰会影响蛋白质的表达。19,20,21因此，AQP 5启动子甲基化可能是影响AQP 5表情。然而，目前尚不清楚AQP 5脓毒症条件下的表达可能是由一个改变的启动子甲基化调控表观基因。因此，我们检验了假设dna甲基化在特定的AQP 5启动子结合位点与改变有关(1)AQP 5(2)脓毒症患者30天生存率及(3)NF-κB结合改变.

表1135例患者(男性78例[58%]，女性57例[42%]，平均年龄57.5岁)。重症监护病房(ICU)的脓毒症患者(±16 SD)。30天生存率为65%(88/135)，ICU住院时间中位数为25天[IQR：12-36天]。所有患者均为白人德国人。如预期，脓毒症幸存者与非幸存者的基线特征有一定差异，如沙发评分(p=0.003)、血小板计数(p=0.025)和胆红素浓度(p=0.011；表)。1)。此外，非幸存者在基线时机械通气的频率(79.5%，35/47)高于幸存者(44.3%，39/88；p=0.001)。而年龄(p=0.757)、性别(p=0.855)、体重指数(p=0.128)、连续性血液滤过/透析(p=0.129)和简化急性生理学评分Ⅱ(p=0.119)与30天生存率无明显关联。此外，感染类型(p=0.581)和伴发性(p=0.969)均不存在死亡依赖型。

AQP 5脓毒症非幸存者全血中mRNA的表达明显高于非存活者(p=0.037，图1)。1). 硅中CpG转录因子结合位点的分析AQP 5启动子区(NT-701~954)：NT-701、NT-860、NT-893、NT-901、NT-922、NT-937和NT-950。2)。核因子NF-κB可能与NT-937、NT-922、NT-901和NT-893位点结合.特异性蛋白1/2/3/4可与NT-950、NT-860和NT-701位点结合，糖皮质激素受体可能与NT-901和NT-893位点结合。2).

相对AQP 5脓毒症幸存者和非脓毒症幸存者的mRNA表达。AQP 5表达为β-肌动蛋白。从全血细胞DNA中获得的数据，并以方格图的形式显示，包括第一、第二(中位)、第三四分位数和第五+九十五百分位数。离群点被描绘成一个点。p值用Mann-WhitneyU检验估计.

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硅中分析AQP 5启动子区域(NT-701至NT-954)揭示了转录的结合位点。绑定位置显示为下划线字母。每个结合位点下都有相关的转录因子。红色标记的Cs代表一个特定的启动子位置，对甲基化进行了分析。

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因此，对所有7个胞嘧啶位置进行了甲基化分析，并对数据进行了校正，并使用Benjamin amini-Hochberg方法对数据进行了多次检测，以将错误发现率保持在5%以下。即使经过多次检测调整后，NT-937位置也有统计学差异(p=0.002，p[医]在比较幸存者(15%，IQR：11-17)和非幸存者(17%IQR：16-21)时，甲基化率为0.014。3)。相反，其他六个位置(图)。4)和整个系统的整体甲基化分析。AQP 5NT-547~NT-1081启动子区在脓毒症患者(17.2%，IQR：14.7~18.8)和非幸存者(17.9%，IQR：15.5~20.2，p=0.158)之间差异无统计学意义。

AQP 5NT-937位脓毒症幸存者和非幸存者的启动子甲基化。从血细胞dna中获得的数据，并以方框图的形式显示，包括第一、第二(中位数)、第三四分位数和第五部分。TH+95TH百分位数。离群点被描绘成一个点。未调整的p值由Mann-Whitney U检验估计，调整后的p值由本雅明-霍奇贝格修正法估计，用于多重检验。

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AQP 5脓毒症幸存者与非幸存者在NT-701、NT-860、NT-893、NT-901、NT-922和NT-950位置的启动子甲基化.从血细胞DNA中获得的数据，以方格图的形式显示，包括第一、第二(中位数)、第三四分位数和第五+九十五百分位数。离群点被描绘成一个点。未调整的p值由Mann-Whitney U检验估计；调整后的p-值由Bejamini-Hochberg校正来估计，用于多次测试。

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验证NF-κB与AQP 5启动子区nt-937的EMSA分析AQP 5启动子区域从NT-922到NT-940。用LPS处理的U 937、HeLa和THP-1细胞的核提取物可形成特异性移位，而NF-κB抗体的加入可能由于NF-κB(P65)抗体的作用而使其特异性结合减弱(如图6 5所示)。5).

对代表启动子区NT-922至NT-940的寡核苷酸进行电泳迁移转移试验(EMSA)，包括在NT-937处的CpG位点。代表性印迹在标记的寡核苷酸中加入核提取物后，形成了两条带(RAN 2)。过量的非标记寡核苷酸的加入超过了特定的条带(第3车道)。随着NF-κB抗体(RAN 4)的加入，其上特异性条带逐渐减少.

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其次，nt-937甲基化和AQP 5用受体操作特征曲线分析评估mRNA表达情况，预测30d死亡率。分析显示曲线下面积为0.717(95%CI：0.629~0.804)。6)NT-937甲基化，但只有0.586(95%CI：0.445-0.707；图1.6)AQP 5mRNA表达，提示NT-937甲基化有较高的预后准确性。根据Youden的J统计，确定了16%NT-937甲基化细胞作为30天存活的最佳切割率。相关切断率为16%，对30天生还者和非幸存者的鉴别敏感性为76.6%，特异性为58.0%。用这种方法可以计算出NT-937患者的30天生存率为82.3%。AQP 5NT-937甲基化率为≥16%的启动子甲基化率<16%，但仅为50.7%(p<0.001)。7).

接收机工作特性AQP 5NT-937位启动子甲基化AQP 5mRNA表达与30天死亡率的关系。将患者分为NT-937甲基化<16%和≥16%。脓毒症患者第1天的测量。

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脓毒症患者30天生存率。采用Kaplan-Meier估计方法，根据水通道蛋白5启动子甲基化率计算NT-937位点的30天存活率。NT-937甲基化率<16%的患者30天生存率高于≥16%。

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综合考虑年龄、性别、沙发评分和机械通气的NT-937甲基化的多变量Cox回归分析显示，血细胞甲基化率在NT-937时为16%或16%以上的患者死亡率为3.31(95%CI 1.54-6.23，p=0.001；2)。因此，APQ 5启动子位点nt-937对30天生存预测有显著和独立的影响，独立于其他重要的预后因素，如沙发评分(表)。2).

这项研究表明，CpG甲基化在AQP 5启动子位置“NT-937”在脓毒症患者与更大的30天死亡率(估计的HR 3.3)有关，因此，是一个重要和独立的预后因素。这项研究还提供了新的证据，表明NF-κB与AQP 5启动子AQP 5基因表达在这方面，NF-κB的结合似乎因cpG甲基化而减弱。AQP 5启动子位置NT-937。

这个AQP 5免疫细胞的表达似乎影响炎症和免疫细胞迁移的关键机制。2,22...值得注意的是，具有潜在过度炎症反应的疾病，如脓毒症或急性呼吸窘迫综合征(Ards)，都与衰减有关。AQP 5在人类和啮齿动物模型中的不同脓毒症环境中的表达9,23,24,25,26...事实上，对AQP 5表达可能是免疫系统的一种适应性反应，它可能会抑制炎症引起的伤害，特别是当感染有压倒性炎症或相当“失调”的免疫反应时。2.

然而，对.的管制AQP 5脓毒症患者不同程度的表达不同，且表达增加(或“抑制程度较低”)。AQP 5表达伴随着30天死亡率的增加。13,14...与这些结果相一致，我们的研究也证明了一个较高的初始阶段。AQP 5脓毒症死亡患者与存活者血细胞中mRNA表达的比较。然而，解释表达水平改变的调控机制AQP 5炎症性疾病仍然难以捉摸。

我们认为DNA甲基化在AQP 5启动子作为差异化的一种可能机制AQP 5表情。以前曾显示，AQP 5基因受cpG甲基化的调控AQP 5启动子区18...野村等人...证明高度甲基化的小鼠细胞率与被抑制的AQP 5表达18，而处于低甲基化状态的细胞表达大量的AQP 518...此外，他们还可以证明，在培养的小鼠细胞中转录因子sp1的结合在低甲基化状态下增加，并参与了基础的形成。AQP 5表达18,27.

在本研究中，我们在AQP 5启动子位置NT-937。后者显示非存活的脓毒症患者甲基化增加，并与更大的甲基化有关。AQP 5与脓毒症幸存者相比。因此，我们推测“抑制性”转录因子与NT-937周围特定启动子区域的结合可能降低启动子的活性和随后的基因表达。值得注意的是，我们已经可以证明，这个cpg站点周围的启动子区域可能描述了一个重要的启动子区域，因此，可能隐藏着消音器的动机。6...值得注意的是，我们还可以确认NF-κB与这一特定的结合。AQP 5启动子区被NF-κB(P65)抗体减弱，从而支持NF-κB信号传导抑制aqp 5表达的证据。10,11,28,29...有趣的是，有几项研究提到了AQP 5在急性呼吸窘迫综合征和脓毒症中的表达不能在存活者和非幸存者之间找到差异NF-κB或细胞因子表达。5,13,14...在此背景下，我们的发现也可能提供了一个不同的理由。AQP 5脓毒症中NF-κB结合能力的改变可能与CpG甲基化有关，而非NF-κB蛋白的表达。因此，建议CpG甲基化在AQP 5启动子位nt-937减弱NF-κB对AQP 5表达及可能解释炎症与减少的关系AQP 5表情。因此，我们的发现可以调和迄今为止相互矛盾的结果，并为脓毒症中AQP 5表达的改变提供一个合理的解释，甚至对患者的结果产生影响。然而，关于AQP 5-1364 A/C单核苷酸多态性基因型需要充分阐明和了解表观遗传改变对脓毒症AQP 5表达和预后的潜在影响。14,15.

在后续研究中需要解决的重要问题之一是不同亚基的过度表达以及NF-κB二聚体组成的变化如何影响含有甲基化或非甲基化CpGNT-937的AQP 5启动子活性。此外，还需要评估NF-κB二聚体形成的动力学和影响，以及它们对AQP 5表达的影响。最后，谨慎地分析NT-937在中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞等不同免疫细胞中的甲基化，以发现潜在的细胞类型特异性差异。然而，我们不能证明与AQP 5启动子甲基化有关的不同血细胞计数在CpG位点NT-937(补充图)。1)。同时检测AQP 5启动子甲基化和在不同免疫细胞中的表达，并在连续的时间点，可以提供更多的了解分子机制。除了机械的洞察力外，我们的目的是找出一种潜在的脓毒症的预后指标，它可以很容易地在从全血中获得的DNA样本中测量，因为DNA是一种稳定而丰富的物质，因此是床边试验的理想选择。此外，改变AQP 5启动子中CpG-位点NT-937的甲基化可能是一个潜在的治疗靶点，但这一假设的稳健性有待于进一步的研究。

局限性

还应提及一些限制。尽管所有脓毒症患者都接受了相当标准化的多式方案治疗，但我们不能排除未知和潜在的混淆因素存在的可能性。虽然在脓毒症的进一步过程中重复测量可能扩大了我们的洞察力，但在本研究中，启动子甲基化与预后之间的关联仅限于ICU入院时的第1天预测。此外，由于伦理和有条不紊的考虑，本研究的一些实验仅在细胞株上进行，而不是在脓毒症患者器官的细胞中进行。因此，我们的细胞培养实验的结果可能不允许翻译到人体病理学。此外，在幸存者和非幸存者的细胞中，nt-937启动子甲基化的差异和甲基化率一般看起来很小，因为其他研究已经显示出很高的甲基化率。AQP 580%以上的启动子甲基化30...然而，这些数值只在白血病或其他癌细胞中出现，而且白血病患者多个基因的启动子是甲基化的。31,32,33...此外，所有后一种细胞都进行了培养，即也与更大程度的AQP 5启动子甲基化18...尽管如此，其他研究表明，甲基化率在10%以下的差异可能对基因表达的大小起决定性作用。34,35...此外，即使在表观遗传调控层面，即微RNA、基因甲基化和乙酰化以及组蛋白重排，除了与其他调控机制的相互作用外，AQP 5脓毒症中的蛋白表达很可能非常复杂，而且肯定不能用单一的研究来阐明。

我们发现了一个重要的功能AQP 5启动子CpG位点(NT-937)与炎症作用的核转录因子NF-κB结合，非脓毒症患者甲基化增加。因此，NT-937 APQ 5启动子甲基化(可能与NF-κB结合有关)在脓毒症中具有预测意义，并表明表观遗传改变有助于脓毒症的发生。

病人

这项研究得到了杜伊斯堡-埃森大学医学院道德委员会的审查和批准(德国埃森；第06-3078号议定书)。根据“赫尔辛基宣言”、良好临床做法准则和地方监管要求，从所有135名参与的患者或其监护人获得书面知情同意，以便在2009年至2014年期间纳入研究内容。如果患者符合骨定义的严重脓毒症标准，他们就被认为是合格的。等人.36在达到严重脓毒症标准后的前24小时内采集血样。此外，所有患者均符合现行“脓毒症-3”定义的标准。37...病人的样本是从一个生物数据库中收集的，其中一些数据已被用于先前的研究。5,38,39.

所有患者均在确诊脓毒症的基础上随访30d。临床和人口学数据，包括简化急性生理学评分Ⅱ(SAPSⅡ)和顺序器官衰竭评估(SOFA)评分，收集后的前24小时上述标准已达到上述标准。如上文所述，病人使用的是多模式概念，包括镇痛和镇静、液体供应、保护性机械通气和血流动力学、抗生素和诊断管理。14,39.

血液样本的收集、制备和储存

在30 min内采集和处理血样。dna和rna分别用QIAamp直接从全血中提取。®根据制造商的指示，DNA血迷你试剂盒(Chiagen，Hilden，德国)或RNeaseMini Kit(Chiagen，Hilden，德国)。将样品冻存于−80°C，待分析。为了避免多次冻融过程，对目前的假设进行了分析，分别存储和解冻了样品。

实时聚合酶链反应(PCR)在表达分析中的应用

根据纳米滴测量，从全血采集的RNA样本在浓度大于50纳克/升时被认为有资格进行分析(ND-1000，PEQLAB生物技术有限公司，德国Erlangen)。98例脓毒症患者的RNA样本质量良好。用QuantiTect反转录试剂盒从0.5g总RNA中合成了第一链cDNA(Chiagen，Hilden，德国)。如上文所述，qPCR反应使用GoTaq qPCR主混合(Promega，Mannheim，德国)进行。5...cDNA稀释序列AQP 5证实PCR效率>95%，与肌动蛋白的效率相当(数据未显示)。相对AQP 5用两步qPCR法检测mRNA的表达，并以2的形式表达。-∆CT.

全DNA甲基化的焦测序分析

亚硫铁矿转化是用EZDNA甲基化-黄金™试剂盒(ZymoResearch，欧文，CA，美国)，根据制造商的指示进行甲基化分析。简单地说，用亚硫酸亚铁处理了500 ng的DNA。随后，将dna稀释至10 ng/l，并用Zymotaq™预混物(Zymo Research，Irvine，CA，USA)对引物进行焦顺序DNA甲基化分析。AQP 5F1+F2和AQP(反向引物)R1+R2(补充表)1)。用测序引物进行焦顺序反应。AQP 5 沙一 + S2(补充表)1)用PSQ HS 96金试剂试剂盒(齐根，希尔登，德国)跨越启动子区域从核苷酸(NT)-1081到NT-547。

潜在重要AQP 5启动子区DNA甲基化分析

首先，硅中利用Genomatix(www.genomatix.de/solutions/genomatix-software-suite.html)和修补程序(www.gene-regulation.com)进行检测，以检测推测的转录因子结合CpG位点。AQP 5启动子(如图所示)2)。第二，AQP 5通过上述序列分析，确定了具有转录因子结合活性的胞嘧啶位点(NT-701、NT-860、NT-893、NT-901、nt-922、NT-937和NT-950)的启动子甲基化。

电泳迁移率测定法(EMSA)

用核提取液提取U 937和THP-1细胞，以LPS(1g/l)刺激2h(ABCAM，剑桥，英国)。采用DY-682荧光标记和非标记寡核苷酸进行竞争分析(MWG Eurofines，Ebersberg，德国)。

将所有寡核苷酸从100°C缓慢冷却后进行杂交。EMSA用奥德赛EMSA缓冲试剂盒(Lisor Bioscience，Lincoln，内布拉斯加州，美国)进行。将探针与5μg核提取物在室温下孵育20 min。加入100倍以上的非标记双链寡核苷酸进行竞争分析。将活化B细胞(NF-κB)p65抗体的核因子Kappa-轻链增强剂2μg(美国得克萨斯州达拉斯圣克鲁斯生物技术)与4°C核提取物孵育90 min，进行超移分析。这些乐队用奥德赛成像系统(Li-Cor生物科学，林肯，内布拉斯加州，美国)可视化。所有实验一式三份。

统计分析

患者的特征报告为分类变量、均值和标准差(±SD)的数字和百分比，或连续变量的中间值(25；75%)。分类变量和连续变量分别通过卡方或费舍尔精确检验，学生t-或Wilcoxon-Mann-Whitney检验进行比较。采用Kolmogorov-Smirnov检验，对所有被评估的变量进行正态分布检验。中的七个不同的CpG位点的分析AQP 5根据本雅明-霍奇贝格程序对启动子区域进行多次检测，使错误发现率保持在5%以下。否则，先验α误差p<0.05被认为具有统计学意义。

预测效度AQP 5mRNA表达和DNA甲基化(即AQP 5对30天死亡率的启动子区域NT-937进行了接收机操作特性(ROC)的评估，并对AUC进行了相应的结果分析。第二步，利用尤登指数(Youden‘sindex)对30天死亡率进行分析，确定最佳截止值，以区分幸存者和非幸存者。随后，用Kaplan-Meier图显示患者30天的生存情况，患者被划分为DNA甲基化截断值以上和以上的队列。此外，还对趋势进行了对数秩检验，以描述队列之间的差异。

单变量和多变量Cox回归分析调整了几个潜在的混杂因素，以确定是否分类的dna甲基化AQP 5启动子区NT-937与30天生存率独立相关。用Cox回归分析计算危险比(HR)和95%置信区间(CI)，描述协变量对危险度的影响。