NP的结构灵活性 145 与HLA-A结合的肽*68：01 流感衍生的12 AA肽NP 145 (DATYQRTRALVR)，由流感风险HLA-I异种型HLA-A*68：01提交 18 ，是相对较少的免疫原(来源于病原体)的人CD8之一。 + T细胞肽在11 AA以上报道至今 19 ...了解此扩展NP的表示是否 145 肽(下称NP) 145 )在HLA-A*68：01中，任何结构约束都可能影响TCR对A68/NP的识别。 145 表位，我们解决了HLA-A*68：01-np的结构。 145 复数分辨率为1.90 Au(补充表) 1 )。结构表明，在P2处的锚定残基ALA与HLA-A*68：01肽结合槽内结合，尽管其大小小于HLA-A*68：01(Val或THR)的P2锚定残基(图1)。 1A )。NP的C端部分 145 肽在P12上具有典型的HLA-A*68：01锚定残基Arg，与HLA-A*68：01分子中的Asp77、Asp74和Asp114形成了盐桥网络(图1)。 1B )。相反，NP的中心部分(残基P4-P9)。 145 尽管NP的N端和C端有明确的电子密度，但肽的电子密度弱/无电子密度，与肽的高度迁移有关。 145 肽 1C，d )。NP的灵活性 145 肽可能会对TCR的参与带来挑战，从而限制A68/NP的招募。 145 -特异性CD8 + 流感病毒感染时T细胞。
图1 HLA-A*68：01-NP的结构 145 复杂。与NP绑定的HLA-A*68：01(白色卡通)的结构 145 肽(橘子棒) a 放大了P2-Ala锚定残基与HLA-A*68：01分子的相互作用，蓝色虚线代表疏水作用。 b P12-Arg盐桥网络(红色虚线)与HLA-A*68：01氨基酸。 c , d 改进后的电子密度图( c 2 fo-fc图颜色为紫色，轮廓为1σ)，或在构建多肽之前 d (fo-fc或省略绿色的地图，并在3σ处绘制等高线)。橙色虚线 c , d 表示np中缺失的氨基酸。 145 晶体结构中的肽(P4-P8)。
NP守恒 145 跨IAV肽 因为病毒肽中的变异会影响肽-HLA-Ⅰ类的结合和呈现。 15 ,35 ,36 ,37 ,38 ,39 ，以及TCR识别 9 ,15 ,40 ,41 ，我们接下来评估了np的守恒程度。 145 流感病毒中的肽。我们检测了来自人类甲型H1N1流感(1918-1957)的24，408个核蛋白(NP)序列。 n =77，1977-2008年 n =1132，2009-2018年 n =9291)，A/H2N2(1987-1968年) n =119)和A/H3N2(1986-2018年) n =13，497)病毒和A/H5N1禽流感病毒(1997-2014年) n 和A/H7N9(2013-2017年) n 98)病毒(人类分离物)(NCBI)； http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/基因组/流感 数据库，2018年7月31日访问)。根据我们的序列比对，我们发现在病毒np中的145，147-156位置的氨基酸。 145 肽高度保守(补充表) 2 )在多肽的第146位(P2)，流感病毒表达丙氨酸(A)(21，740/24，408种病毒，89.1%)或苏氨酸(T)(2661/24，408种病毒，10.9%)，在较小程度上表达缬草碱(V)(7/24，408种病毒；<0.01%(补充表))。 2 ；图1. 2A )。对146位残基的时间序列分析表明，这些变异不是随机分布的，而是随时间而固定的。1918年已知的最早的流感病毒株在146位有丙氨酸，但在1935年被A146T替换。NP的146 t变体 145–146 肽通过两个重组事件传递到A/H2N2和随后的A/H3N2病毒上。 1 ...NP的146 t变体 145 肽继续流通，直到2001年T146A取代被迅速固定，并继续流通到现在。1957年甲型~H一~N一流感病毒(146吨)于1977年重新引入人类，并一直流传到2009年，当时它被一种多重重组的甲型H1N1病毒所取代，该病毒含有1918年(146 A)的原始NP基因片段。 1 (无花果) 2A )。除A/山东/1/2009株外，所有人类分离的A/H5N1和A/H7N9病毒均在146位表达丙氨酸(图1)。 2A ，补充表 2 ).
图2 NP的高守恒性 145-156 跨季节IAV病毒的肽。 a NP第146位氨基酸变异频率 145–156 肽。饼形图表示位于146位置的丙氨酸(A；白色)、苏氨酸(T；灰色)和阀值(B，黑色)的频率。分析序列的总数在饼图中显示：a/h1n1(1918-1957)。 n =77，1977-2008年 n =1132，2009-2018年 n =9291)，A/H2N2(1987-1968年) n 和A/H3N2(1986-2018年) n =13 497)，禽A/H5N1(1997-2014年) n 和A/H7N9(2013-2017年) n =98)。 b A68/NP代表FACS小组 145 -特异性CD8 + T细胞在第0天受到146 a肽刺激后再刺激第10天，再用同源或变异NP刺激T细胞。 145 肽。第10天以PMA/Ionomycin为阳性对照，DMSO为阴性对照。 c 最大干扰素γ百分比 + CD3 + CD4 − 继发性刺激后的T细胞。最大干扰素γ被定义为干扰素γ。 + CD3 + CD4 − 用肽池、DATYQRTRALVR(146 A)、DTTYQRTRALVR(146 T)和DVTYQRTRALVR(146 V)肽刺激T细胞。池包括146 a、146 t和146 V变异体。标杆表示三个捐助者的平均反应( n =3)。
尽管病毒抗原变异，流感特异性CD8 + T细胞可以提供广泛的交叉反应，并能识别一系列肽变异体。 6 ,8 ,10 ,15 ,41 ,42 ,43 ,44 ...因此，我们分析了a68/np的交叉反应电位。 145 + CD8 + 向两个主要NP方向的T细胞 145 变异体，DATYQRTRALVR和DTTYQRTRALVR，以及不太流行的DVTYQRTRALVR变体。考虑到NP的146 a和146 t变体 145- 在过去的二十年里，肽主要是流通的，两者都是NP。 145 肽变异体能够扩增A68/NP 145 + CD8 + T细胞(图1. 2 b，c，附图 1A )。FACS图是146 a肽刺激和扩展的a68/np的代表。 145 -特异性CD8 + 第10天用DMSO作为第二次刺激的阴性对照，用干扰素-γ法对这些扩增的细胞进行再刺激实验，结果表明，第一次刺激后，四聚体阳性细胞数量较多(如图1所示)。 2B )。然而，在DMSO对照组中检测到的干扰素-γ的产量微乎其微(如图所示)。 2B )。再刺激扩大的a68/np 145 + CD8 + 具有三种NP变体的T细胞 145 肽(146 a，146 t和146 V)显示对所有三种肽都有相当程度的交叉反应(图1)。 2C , n =3名捐助者)。146 a、146 t和146 v肽变异体之间的高度交叉反应表明，将这些突变固定在146位并不会导致病毒从先前存在的a68/np逃逸。 145 + CD8 + T细胞反应，因此不会成为HLA的决定因素 − A*68：01-当一个新的变异体被引入时，相关的发病率。
因为NP 145 -NP的146 a变体 145 在过去的二十年中，我们选择了这种免疫原DATYQRTRALVR肽，进一步剖析了a68/np的定量、定性和克隆特性。 145 -特异性CD8 + HLA-A*68：01表达个体的T细胞反应。
A68/NP 145 -+ CD8 + T细胞反应因供体不同而异。 探讨已建立的A68/NP的大小 145 + CD8 + T细胞群，我们评估了A68/NP。 145 -特异性CD8 + 四聚体相关磁富集法(TAME)直接体外培养T细胞的实验研究 43 ,45 3A，b ，补充图。 1B 表 1 )。A68/NP频率 145 + CD8 + T细胞，相对于总CD8计算 + 未富集分数的T细胞数 45 ,46 ，并与流感病毒特异性CD8的频率进行比较。 + T细胞对其他著名的普遍人类白细胞抗原的反应(表) 1 (黑体) 9 ,10 使用单一或双四聚体浓缩。四聚体富集A68/NP的频率 145 + CD8 + T细胞显示三种类型的A68/NP 145 -特异性CD8 + T细胞应答者(图1. 3B )。在17人中，11人被归类为低反应者，<12 A68/NP145 + CD8 + T细胞/10 6 CD8 + T细胞在这些捐助中，7个捐助方总共有<10统计的A68/NP 145 + CD8 + T细胞在整个富集分数，这是足够的频率分析，但不表型(补充图)。 2 )。其余6个捐助者(35%)展示了大量A68/NP 145 + CD8 + T细胞，4名供者为中等应答者(>12 A68/NP) 145 + CD8 + T细胞/10 6 CD8 + T细胞)和两个供体是高应答者(>100 A68/NP) 145 + CD8 + T细胞/10 6 CD8 + T细胞)(图1. 3B ).
图3 A68/NP 145 -特异性CD8 + T细胞反应因供体不同而有很大差异。 a 具有代表性的A68/NP型FACS简介 145 -CD8四聚体染色 + T细胞 b A68/NP频率 145 + CD8 + T细胞(红圈)与流感病毒特异性CD8 + T细胞(彩色方块)。<12四聚体特异性CD8 + T细胞/10 6 CD8 + T细胞被认为是低应答( n =11)，>12四聚体特异性CD8 + T细胞/10 6 CD8 + T细胞培养基反应( n =4)和>100四聚体特异性CD8 + T细胞/10 6 CD8 + T细胞高反应( n =2)。四聚体 + CD8 + 在四聚体阳性门内计数的<10细胞检测到的T细胞以开放符号表示(补充图)。 2 )。A68/NP的频率比较 145 -与通用流感病毒-特异性CD8 + 低应答者中的T细胞( c )和中/高响应者( d ). e A68/NP的频率比较 145 + CD8 + T细胞介于低、中/高应答者之间。 f 通用表位特异性CD8的频率比较 + T细胞介于低、中/高应答者之间。 c –f BAR表示捐赠者的平均反应。精确性 p 值显示在上面的图表中。低响应捐助者(圆圈)，高响应捐助者(平方)，<10个细胞计数(开放符号)。用Mann-Withney检验进行统计学分析。精确性 p 值显示在上面的图表中。
引人注目的是，在低应答者中，a68/np 145 + CD8 + T细胞池是亚显性的，与其他流行的流感特异性CD8的频率相比，T细胞池是亚显性的。 + 同一个体内的T细胞群(p =0.00056；图1。 3B，c )。相反，A68/NP的频率 145 + CD8 + 中、高应答者的T细胞与CD8的频率相当。 + 针对通用流感表位的T细胞( p =0.153；图1。 2B，d )，表明A68/NP的免疫优势潜力。 145 + CD8 + 至少有部分供体的T细胞。这些结果清楚地表明，建立了大量的A68/NP 145 + CD8 + T细胞的数量在捐献者之间并不是一致的( p =0.001，图1。 3E )。虽然整体CD8有下降的趋势 + T细胞频率直接指向低应答者的通用流感表位，与中、高应答者相比，差异无显着性( p =0.058，图1。 3F )。此外，A68/np的频率之间也没有相关性。 145 + CD8 + T细胞与CD8的频率 + 针对通用表位的T细胞( n =13， R s =0.3518， p =0.1397，补充图。 3 )。包括更多的捐献者可能会进一步加强整体流感病毒特异性CD8的趋势。 + 然而，由于HLA-A*68：01供者的低频率，HLA-A*68：01阳性个体的T细胞反应不能被证实。
DIST A68/NP 145 CD8 + T细胞表型跨应答者 了解A68/NP的低检测 145 + CD8 + 在65%的供者中发现T细胞群是由于在A68/NP内建立了不同的天真/记忆子集。 145 + CD8 + T细胞，我们直接在体内比较A68/NP的表型。 145 + CD8 + T细胞(I)跨HLA-A*68：01-供者和(Ii)CD8表型 + 针对通用流感抗原表位的T细胞。 4 )。我们使用三种表面标记，CD 27、CD45RA和CD 95来描绘出天真的(T)。 天真 、CD 27 + CD45RA + CD 95 − )、效应器/效应器存储器(T) EFF 、CD 27 − CD45RA − )，终末分化效应器(T) 埃姆拉 、CD 27 − CD45RA + )，中央存储器(T) 厘米 、CD 27 + CD45RA − )和干细胞记忆(T) 供应链管理 、CD 27 + CD45RA + CD 95 + )CD8 + T细胞亚群在低，中，高应答供体(图)。 4A，b ，补充图。 1B ).
图4 A68/NP表型 145 -特异性和普遍性流感-特异性CD8 + T细胞 a A68/NP表型 145 -和通用流感病毒-特异性CD8 + 低T细胞(<12 A68/NP) 145 -特异性CD8 + T细胞/10 6 CD8 + T细胞)( n =4)、中等(>12)( n =4)和高(>100)响应者( n =2)。 b 具有代表性的FACS面板显示了用来描述A68/NP特性的门控策略 145 -特异性CD8 + T细胞反应。A68/NP代表 145 -四聚体染色(第一组)，CD 27，CD45RA染色，以鉴别T。 EFF (CD 27) − CD45RA − )，T 埃姆拉 (CD 27) − CD45RA + )，以及T 厘米 (CD 27) + CD45RA − )细胞(第二个面板)，然后用CD 95，CD8染色来识别T。 天真 -类似(CD 27) + CD45RA + CD 95 − )和T 供应链管理 (CD 27) + CD45RA + CD 95 + )单元(第三面板)。灰点是总CD8 + 未富集样品中的T细胞，红点为A68/np。 145 + CD8 + 富集样品中的T细胞。 c 频率比较 T 天真 和T 总内存 (T) 厘米 +T 埃姆 +T 埃姆拉 +T 供应链管理 )A68/NP 145 + CD8 + T细胞在低和中/高反应。我们包括捐助方1、2和3的两个测量值：2015年采集的样本使用开放符号，2018年采集的样本使用封闭符号(另见表)。 1 ). d T的频率比较 天真 -类和T 总内存 普遍特异性CD8 + T细胞在低和中/高反应。 c –d BAR表示捐赠者的平均反应。用Mann-Withney检验进行统计学分析。精确性 p 值显示在上面的图表中。
在四分之三的低反应捐助者中，a68/np的比例显著提高。 145 + CD8 + T细胞呈幼稚样表型(平均33.77%±23.83)； n =4个捐助者)，与A68/NP相比 145 + CD8 + 中、高反应组T细胞(平均1.52%±2.17)； n =6个捐助者； p =0.002)(图1。 4C )。相比之下，总内存A68/NP的比例 145 + CD8 + T细胞(T细胞) 厘米 、T 埃姆拉 、T EFF 、T 供应链管理 )(T 总内存 )中、高反应者(平均98.59%±1.7； n 6供者)明显高于低反应者(66.23%±23.84)， n =4个捐助者； p =0.002)(图1。 4C )，在A68/np中演示了从天真到记忆表型的转换。 145 + CD8 + 中高应答供体T细胞。
通用型流感特异性CD8的表型分析 + T细胞群显示，在天真的类( p =0.062)或内存( p 0.062)低、中、高应答者的表型比较(图1)。 4D )，与它们相似的反应强度一致。检测所有通用CD8中的记忆表型 + T单元集还验证我们的a68 + 捐献者曾接触过流感，因此他们的A68/NP 145 + CD8 + 在以前流感病毒感染期间，T细胞暴露于抗原刺激下，所有低、中、高应答供者。
A68/NP中不同的TCRαβ库 145 + CD8 + T单元池 了解差异A68/NP 145 + CD8 + T细胞对HLA-A*68：01供体的反应，我们解剖了A68/NP中克隆的多样性和组成。145 + CD8 + T细胞见于低、中、高应答者。我们采用单细胞指数排序和多重RT-PCR相结合的方法。 43 ,47 在单个细胞内扩增tcrα和tcrβ链，从而能够对配对的A68/NP进行分析 145 + CD8 + TCRαβ在三个低响应者和五个中高响应者中的表现(图一)。 5 表 2 ，补充表 3 ).
图5 A68/NP的高克隆多样性145 -特定的TCR汇辑。 a 基因片段的使用和配对景观显示为低( n =3)和中/高( n =5)响应者。每个克隆型都被指定为相同的垂直长度，而不管其类型大小如何。每个垂直叠加反映V和J基因片段的使用和配对是用弯曲的连接线。基因受分布频率的影响。基因使用的丰富或枯竭分别由向上或向下箭头表示，其中一个箭头与双倍增加或减少相关。 b 单个供者Trav和TRBV基因使用情况的饼图。分析的基因序列的总数显示在饼图中。c Circos图显示了TRA-TRB配对克隆型在供者之间的分布.每个片段定义一个单独的阵挛类型，该段的宽度与该克隆类型的频率相关。私人克隆型是灰色的。不同供体之间常见的克隆型以红色(TRBV 20-1)和橙色(TRAV 4)显示。d 低、中、高应答供体中CDR 3α和CDRβ氨基酸长度的分布星号表明在体外扩增的T细胞上建立了TCR克隆型。
表2 A68/NP中配对TRBV-TRBJ/TraV-traj扩增克隆型的频率 145 人PBMC中的TCRs。 相对于以往报道的大多数长肽/HLA复合物的狭窄/扭曲的TCR序列 26 ,27 ,28 ,29 ,30 ,31 ，A68/NP 145 + CD8 + TCRαβ序列利用广泛的TRBV(T受体β变量)和TRAV(T受体α变量)基因片段在低应答者和中/高应答者中表达(如图所示)。 5A 表 2 ，补充表 3 )。最常见的基因片段是TRBV 20-1和TRAV 4。 c. )。有趣的是，供体7(中等应答者)和13(高应答者)表达了高度限制的私人Trav和TRBV组合，分别是TRBV6-6/TRAV 4和TRBV 9/TRAV 19(图1)。 c. ).
对CDR 3αβ克隆型特征的进一步剖析表明，单个供者缺乏共同的结构(表)。2 ，补充表 3 )和在HLA-A*68：01-表达的供者之间缺乏共享的CDR 3αβ签名(公共克隆型)。低和中/高响应者的CDR 3α环的长度分别从4到15 aa和3到12 aa之间变化很大(如图所示)。 5D )。同样，CDR 3β环的长度也是可变的，低应答者为7~12 AA，中高应答者为7至14 AA(如图所示)。 5D ).
总体而言，A68/NP 145 + CD8 + TCR的αβ曲目有着惊人的多样性，捐助者之间没有共同的特征。因此，A68/NP145 + CD8 + T细胞的反应似乎不受特定tcrαβs的限制，它可以识别长而灵活的12 aa np。 145 HLA-A*68：01背景下的肽。
扩大的A68/NP 145 + 中、高应答者TCRαβ克隆 尽管A68/NP 145 + CD8 + TCRαβ曲目的多样性在所有低、中/高响应者中变得明显的是A68/NP。145 + CD8 + 中高响应者中的tcrαβ库包含很高的比例( n 5，平均71%，范围为50-95%)与低反应者相比，扩大的tcrαβ克隆型( n =3，平均2.5%，幅度0-10%)( p =0.016)(图1。 6 表 2 )。如此高比例的扩增的tcrαβ克隆型在中/高应答者中提供了明确的证据，证明在中、高A68/np中观察到的大克隆扩展与免疫优势之间存在相关性。 145 + CD8 + T细胞应答者。这进一步表明，最低限度的克隆扩展导致了先前存在的记忆能力差的a68/np。 145 + CD8 + 低响应和无响应的T单元池。因此，A68/NP的后续提升 145 + CD8 + 低应答者中的T细胞可能是确保HLA-A*68：01-表达的人有大量的记忆A68/NP的方法之一。145 + CD8 + T细胞，因此至少在某种程度上对未预料到的新出现的流感病毒有一定程度的保护.
图6 扩张的TRBV-TRBJ/Trav-traj克隆型的水平。在每个供体的全序列TCRαβ库中观察到的扩展TRBV-TRBJ/TRAV-TRAJ克隆型的频率( n =8)。图例中的字母与表中的克隆ID对应 2 ...图中显示了每个施主内部的序列总数。星号表明在体外扩增的T细胞上建立了TCR克隆型。
与高频TCRαβ相关的记忆表型 当我们的实验使用单细胞索引排序时，我们能够直接连接到单个的a68/np。145 + CD8 + TCRαβ克隆型对每一分析αβ的表型进行分析。我们有兴趣连接A68/NP 145 + CD8 + TCRαβ序列及其各自的HLA-A*68：01-NP 145 四聚体亲和力，正如以前的研究表明，HLA-A*68：01-特异性TCRs需要与肽-HLA复合物(Phla)高亲和力结合。 48 克服HLA-A*68：01中245(A245V)位多态性导致CD8结合位点亲和力降低的问题 49 ...在单细胞指数排序技术出现之前，a68/np的高亲和力种群和低亲和力种群。 145 + CD8 + 供体16中的T细胞直接分为两个板块，显示了高亲和力和低亲和力群体之间的两个不同的TCR序列(补充图)。4 )。通过使用索引排序，我们能够进一步区分高亲和力和低亲和力的a68/np。 145 + CD8 + T细胞根据他们的实际四聚体平均荧光强度(MFI)(图一)。 7 ).
图7 基于A68/NP的TCRαβ克隆型分布 145 -四聚体贪婪。FACS面板(左)显示高和低亲和力A68/np的门控 145 + CD8 + T细胞低(供体2b)和培养基(供体7和6)应答者。表格显示了基于A68/NP排列的克隆类型 145 -四聚体亲和力(右)。表中最后一列显示单个阵挛型的MFI，MFI梯度颜色从高MFI(暗红色)到低MFI(白色)。TRBV 20-1(黄色)和TRAV 4(橙色)是供体之间常见的克隆型，而TRBV 6-6(蓝色)和TRBV 30(绿色)是高频率观察到的供体特异性阵挛型。
所有索引排序的捐献者( n =5；1b，2b，3b，6和7)，A68/NP 145 + CD8 + 供体2b、6和7的T细胞反应( n =3)足以区分高亲和力和低亲和力的种群，因此能够在tcrαβ库与它们各自的mfi之间建立任何直接联系(图1)。 7 )。当我们集中分析八分之一的捐献者(TRBV 20-1和TRAV 4)中观察到的两个主要基因片段时(表) 2 ，补充表 3 我们发现TRBV 20-1在低亲和力人群中更为普遍(占TRBV 20-1克隆型的59%)，而TRAV 4在高亲和力人群中更为常见(TRAV 4克隆型占所有4种供体的54%)。 7 ，补充图。 4 )。克隆型TRBV 30仅见于供体6，在高亲和力人群(占TRBV 30克隆型的88%)中更为普遍。 7 )。有趣的是，在捐献者7中，tcrαβ大部分由一个扩大的tcrαβ克隆型TRBV 6-6-CASSSPVYNEQ和TRAV 4组成。 − CLVGDLINSGGYNKLIF和一些较小的克隆型(图1)。 7 )。主要克隆型分布在高、低MFI之间。这表明四聚体结合的MFI可能不仅受TCRαβ链的影响，还可能受TCR水平、TCR动态、TCR空间排列和/或其他内在因素的影响。
随后，我们解剖了A68/np。 145 + CD8 + 所有按索引排序的捐赠者的tcrαβ库( n =5；1b，2b，3b，6和7)，根据它们匹配的表型(图1)。 8 )。在此，我们重点研究了常见的阵挛型TRBV 20-1和TRAV 4(供体1b、2b、3b、5、6、7和16)以及供体特异性克隆型TRBV 30(供体6)和TRBV 6-6(供体7)，在这些供体中检测到的频率相对较高。我们发现，在普通基因片段(trv 20-1和trv 4)和高频个体阵挛型(trv 30和tbv 6-6)中，扩增的tcrαβs在记忆CD8中非常普遍。+ T细胞群(图1. 8 )。这些结果证实，在中、高HLA-A*68：01-应答供体中观察到的大TCRαβ克隆扩增主要为记忆表型(图一)。 6 和 8 ).
图8 TCRαβ克隆型根据个体表型分布。FACS面板(中心)表示用于定义T的选通策略EFF (CD 27) − CD45RA − )，T 埃姆拉 (CD 27) − CD45RA + )，以及T 厘米 (CD 27) + CD45RA − )细胞(顶部FACS图)和T 天真 -类似(CD 27) + CD45RA + CD 95 − )和T 供应链管理 (CD 27) + CD45RA + CD 95 + )细胞(底部FACS图)。灰点是总CD8 + 未富集样品中的T细胞，红点为A68/np。 145 + CD8 + T细胞A68/NP的克隆型 145 + CD8 + T细胞是根据表型( n =5个捐助者)。TRBV 20-1(黄色)和TRAV 4(橙色)是常见于供体之间的克隆型，而TRBV 6-6(蓝色)和TRBV 30(绿色)是高频率观察到的供体特异性阵挛型。
总的来说，我们的结果表明即使A68/NP 145 + CD8 + tcrαβ序列是高度多样的，某些个体(包括trv 20-1、trv 4、trv 30和trv 6-6)的tcrαβ基因使用率较高，表现出更大的a68/np的大量扩展的克隆型构成了较高的记忆表型。145 + CD8 + T细胞反应在中、高反应区。
