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对流感特异性CD8免疫优势的T细胞反应受危险相关HLA-A*68:01等位基因的限制

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发表时间:2019-12-07 15:35作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

对流感特异性CD8免疫优势的T细胞反应受危险相关HLA-A*68:01等位基因的限制

摘要

虽然流感病毒在高危人群中会导致严重疾病,但与严重疾病相关的宿主遗传因素基本上是未知的。由于HLA-A*68:01等位基因可能与2009-H1N1大流行疾病有关,我们研究HLA-A*68:01-限制性CD8的潜在损害。+T细胞产生强烈的反应。我们阐明HLA-A*68:01+CD8+T细胞对流感衍生核蛋白(Np)肽的反应,表明只有35%的个体具有免疫显性的a68/np。145+CD8+T细胞反应。解剖A68/NP145+CD8+低应答者和中/高应答者的T细胞显示,高应答的供者有A68/NP。145+CD8+具有克隆扩展的tcrαβs的记忆T细胞,而低响应者显示a68/np。145+CD8+单细胞指数排序和tcrαβ分析a68/np的链扩展。145+CD8+T细胞的记忆潜力。我们的研究证实了流感特异性CD8的免疫优势潜力。+T细胞由HLA-A*68:01分子构成,主张启动CD8+HLA-A*68:01中的T细胞区-表达个体,用于建立预先存在的保护性记忆T细胞池。

导言

尽管2018年是西班牙流感大流行100周年,造成5千万人死亡。1流感病毒仍然是全球健康的持续威胁。事实上,全球流感大流行被列为世卫组织2019年全球十大健康威胁之一2...下一次流感大流行的爆发是不可避免的,导致不同疾病结果的机制尚不清楚。因此,重要的是要了解为什么有些人在大流行和季节性流行病期间死于严重和致命的流感疾病。1,3.

虽然目前针对可变血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面糖蛋白的抗体疫苗是对付季节性感染的最有效方法,但在流感大流行期间,由于出现抗原不同的流感病毒亚型而失败。4,5...在缺乏保护性抗体的情况下,一种新的甲型流感病毒(Iav)可以激活和回忆记忆交叉株保护性细胞毒性CD8。+T细胞,专为保守的病毒肽6,7,8,9,10,11,从而快速清除病毒,降低疾病的严重程度。12,13...这就产生了交叉反应的CD8。+T细胞是一种新的通用流感疫苗策略的有吸引力的靶点。5...继2013年H7N9在中国爆发后,我们说明了强健的预先存在的细胞毒性CD8的重要性。+T细胞记忆对新型IAV引起的严重流感(和死亡)的保护作用13,14...我们最近的研究引入了一种新的范式,即人类的CD8。+T细胞对所有甲型、乙型和丙型流感病毒产生前所未有的交叉反应,对不需要年度重组的通用疫苗的设计具有关键意义。11...诱导交叉反应性CD8的疫苗+T细胞可降低甲型和乙型流感病毒的年发病率/死亡率,保护儿童免受丙型流感病毒感染,并增加CD8。+曾接触过流感的人的T细胞5,11.

CD8+T细胞通过T细胞受体(Tcrs)识别人类白细胞抗原(HLA)Ⅰ类分子中的病毒衍生肽,从而特异性地清除受病毒感染的细胞。15...HLA-A*01:01,HLA-A*02:01,HLA-A*03:01,HLA-B*08:01,HLA-B*18:01,HLA-B*27:05,HLA-B*37:01,和HLA-B*57:019,10,11与普遍保护的CD8有关+T细胞介导的免疫,因为他们呈现流感肽是高度保守在上个世纪。相反,两项独立的研究将HLA-A*68:01等位基因表达在5.2-25%的等位基因频率与2009年流感大流行期间的严重流感疾病相关。16,17...了解CD8+在高风险HLA-A*68:01分子背景下,我们最近从病毒核蛋白(Np)中发现了一种新的12氨基酸衍生肽。145–156具有与HLA-A*68:01绑定能力的DATYQRTRALVR(DATYQRTRALVR)18.

HlaⅠ类分子主要结合短病毒肽(8-10个氨基酸;aa)19,虽然扩展的肽(>10 aa)可呈现为CD8。+HLA I类背景下的T细胞19,20,21...长肽(≥11 AA)与标准长度肽(8-10 AA)相似,在第二位(P2)和最后位置(PΩ)有相似的锚定残基。结果,这些扩展肽的中心区域被迫从HLAⅠ类抗原结合的裂谷中凸出。19,20,虽然在N-或C-端有11种以上的AA肽。22,23...扩展的HLAⅠ类限制性肽的胀形构象可能对TCR的识别具有特别的挑战性。24,25...根据对长肽特异性tcr序列的有限研究,长肽-HLAⅠ类复合物似乎驱动了tcr基因的偏颇使用,提示胀形肽HLAⅠ类复合物只能被少数tcrs识别,这可能会影响cd8基因的使用。+T细胞招募26,27,28,29,30,31...相反,肽的凸起部分也具有很高的流动性,提供了多个tcr结合位点,从而选择了不同的tcr库。32,33...事实上,两种长肽(HLA-B*07:02/NY-ESO-1(13 Aa)和HLA-B*57:03-KF11(11 Aa))都有不同的TCR序列。20,30,34.

在本研究中,我们阐明了CD8的贡献。+针对这种新的扩展HLA-A*68:01-NP的T细胞反应145-156(下称A68/NP)145)流感特异性免疫的抗原表位。了解CD8的作用+在HLA-A*68:01等高危分子背景下呈现流感病毒多肽的T细胞是合理设计通用T细胞靶向流感病毒疫苗的关键。在这里,我们对流感病毒特异性CD8进行了深入的分析。+针对扩展的12 AA NP的T细胞145受HLA-A*68:01分子限制的肽。我们的数据显示流感特异性CD8的免疫优势潜力。+35%供者中HLA-A*68:01分子的T细胞及CD8启动的倡导者+HLA-A*68:01中的T细胞区-表达个体建立预先存在的保护性记忆CD8+T细胞池对抗未来未预测的流感毒株。

结果

NP的结构灵活性145与HLA-A结合的肽*68:01

流感衍生的12 AA肽NP145(DATYQRTRALVR),由流感风险HLA-I异种型HLA-A*68:01提交18,是相对较少的免疫原(来源于病原体)的人CD8之一。+T细胞肽在11 AA以上报道至今19...了解此扩展NP的表示是否145肽(下称NP)145)在HLA-A*68:01中,任何结构约束都可能影响TCR对A68/NP的识别。145表位,我们解决了HLA-A*68:01-np的结构。145复数分辨率为1.90 Au(补充表)1)。结构表明,在P2处的锚定残基ALA与HLA-A*68:01肽结合槽内结合,尽管其大小小于HLA-A*68:01(Val或THR)的P2锚定残基(图1)。1A)。NP的C端部分145肽在P12上具有典型的HLA-A*68:01锚定残基Arg,与HLA-A*68:01分子中的Asp77、Asp74和Asp114形成了盐桥网络(图1)。1B)。相反,NP的中心部分(残基P4-P9)。145尽管NP的N端和C端有明确的电子密度,但肽的电子密度弱/无电子密度,与肽的高度迁移有关。1451C,d)。NP的灵活性145肽可能会对TCR的参与带来挑战,从而限制A68/NP的招募。145-特异性CD8+流感病毒感染时T细胞。

图1
figure1

HLA-A*68:01-NP的结构145复杂。与NP绑定的HLA-A*68:01(白色卡通)的结构145肽(橘子棒)a放大了P2-Ala锚定残基与HLA-A*68:01分子的相互作用,蓝色虚线代表疏水作用。bP12-Arg盐桥网络(红色虚线)与HLA-A*68:01氨基酸。c, d改进后的电子密度图(c2 fo-fc图颜色为紫色,轮廓为1σ),或在构建多肽之前d(fo-fc或省略绿色的地图,并在3σ处绘制等高线)。橙色虚线c, d表示np中缺失的氨基酸。145晶体结构中的肽(P4-P8)。

NP守恒145跨IAV肽

因为病毒肽中的变异会影响肽-HLA-Ⅰ类的结合和呈现。15,35,36,37,38,39,以及TCR识别9,15,40,41,我们接下来评估了np的守恒程度。145流感病毒中的肽。我们检测了来自人类甲型H1N1流感(1918-1957)的24,408个核蛋白(NP)序列。n=77,1977-2008年n=1132,2009-2018年n=9291),A/H2N2(1987-1968年)n=119)和A/H3N2(1986-2018年)n=13,497)病毒和A/H5N1禽流感病毒(1997-2014年)n和A/H7N9(2013-2017年)n98)病毒(人类分离物)(NCBI);http://www.ncbi.nlm.nih.gov/基因组/流感数据库,2018年7月31日访问)。根据我们的序列比对,我们发现在病毒np中的145,147-156位置的氨基酸。145肽高度保守(补充表)2)在多肽的第146位(P2),流感病毒表达丙氨酸(A)(21,740/24,408种病毒,89.1%)或苏氨酸(T)(2661/24,408种病毒,10.9%),在较小程度上表达缬草碱(V)(7/24,408种病毒;<0.01%(补充表))。2;图1.2A)。对146位残基的时间序列分析表明,这些变异不是随机分布的,而是随时间而固定的。1918年已知的最早的流感病毒株在146位有丙氨酸,但在1935年被A146T替换。NP的146 t变体145–146肽通过两个重组事件传递到A/H2N2和随后的A/H3N2病毒上。1...NP的146 t变体145肽继续流通,直到2001年T146A取代被迅速固定,并继续流通到现在。1957年甲型~H一~N一流感病毒(146吨)于1977年重新引入人类,并一直流传到2009年,当时它被一种多重重组的甲型H1N1病毒所取代,该病毒含有1918年(146 A)的原始NP基因片段。1(无花果)2A)。除A/山东/1/2009株外,所有人类分离的A/H5N1和A/H7N9病毒均在146位表达丙氨酸(图1)。2A,补充表2).

图2
figure2

NP的高守恒性145-156跨季节IAV病毒的肽。aNP第146位氨基酸变异频率145–156肽。饼形图表示位于146位置的丙氨酸(A;白色)、苏氨酸(T;灰色)和阀值(B,黑色)的频率。分析序列的总数在饼图中显示:a/h1n1(1918-1957)。n=77,1977-2008年n=1132,2009-2018年n=9291),A/H2N2(1987-1968年)n和A/H3N2(1986-2018年)n=13 497),禽A/H5N1(1997-2014年)n和A/H7N9(2013-2017年)n=98)。bA68/NP代表FACS小组145-特异性CD8+T细胞在第0天受到146 a肽刺激后再刺激第10天,再用同源或变异NP刺激T细胞。145肽。第10天以PMA/Ionomycin为阳性对照,DMSO为阴性对照。c最大干扰素γ百分比+CD3+CD4继发性刺激后的T细胞。最大干扰素γ被定义为干扰素γ。+CD3+CD4用肽池、DATYQRTRALVR(146 A)、DTTYQRTRALVR(146 T)和DVTYQRTRALVR(146 V)肽刺激T细胞。池包括146 a、146 t和146 V变异体。标杆表示三个捐助者的平均反应(n=3)。

尽管病毒抗原变异,流感特异性CD8+T细胞可以提供广泛的交叉反应,并能识别一系列肽变异体。6,8,10,15,41,42,43,44...因此,我们分析了a68/np的交叉反应电位。145+CD8+向两个主要NP方向的T细胞145变异体,DATYQRTRALVR和DTTYQRTRALVR,以及不太流行的DVTYQRTRALVR变体。考虑到NP的146 a和146 t变体145-在过去的二十年里,肽主要是流通的,两者都是NP。145肽变异体能够扩增A68/NP145+CD8+T细胞(图1.2b,c,附图1A)。FACS图是146 a肽刺激和扩展的a68/np的代表。145-特异性CD8+第10天用DMSO作为第二次刺激的阴性对照,用干扰素-γ法对这些扩增的细胞进行再刺激实验,结果表明,第一次刺激后,四聚体阳性细胞数量较多(如图1所示)。2B)。然而,在DMSO对照组中检测到的干扰素-γ的产量微乎其微(如图所示)。2B)。再刺激扩大的a68/np145+CD8+具有三种NP变体的T细胞145肽(146 a,146 t和146 V)显示对所有三种肽都有相当程度的交叉反应(图1)。2C, n=3名捐助者)。146 a、146 t和146 v肽变异体之间的高度交叉反应表明,将这些突变固定在146位并不会导致病毒从先前存在的a68/np逃逸。145+CD8+T细胞反应,因此不会成为HLA的决定因素A*68:01-当一个新的变异体被引入时,相关的发病率。

因为NP145-NP的146 a变体145在过去的二十年中,我们选择了这种免疫原DATYQRTRALVR肽,进一步剖析了a68/np的定量、定性和克隆特性。145-特异性CD8+HLA-A*68:01表达个体的T细胞反应。

A68/NP145-+CD8+T细胞反应因供体不同而异。

探讨已建立的A68/NP的大小145+CD8+T细胞群,我们评估了A68/NP。145-特异性CD8+四聚体相关磁富集法(TAME)直接体外培养T细胞的实验研究43,45在17名健康的HLA-A*68:01-表达个体中(如图所示)。3A,b,补充图。1B1)。A68/NP频率145+CD8+T细胞,相对于总CD8计算+未富集分数的T细胞数45,46,并与流感病毒特异性CD8的频率进行比较。+T细胞对其他著名的普遍人类白细胞抗原的反应(表)1(黑体)9,10使用单一或双四聚体浓缩。四聚体富集A68/NP的频率145+CD8+T细胞显示三种类型的A68/NP145-特异性CD8+T细胞应答者(图1.3B)。在17人中,11人被归类为低反应者,<12 A68/NP145+CD8+T细胞/106CD8+T细胞在这些捐助中,7个捐助方总共有<10统计的A68/NP145+CD8+T细胞在整个富集分数,这是足够的频率分析,但不表型(补充图)。2)。其余6个捐助者(35%)展示了大量A68/NP145+CD8+T细胞,4名供者为中等应答者(>12 A68/NP)145+CD8+T细胞/106CD8+T细胞)和两个供体是高应答者(>100 A68/NP)145+CD8+T细胞/106CD8+T细胞)(图1.3B).

图3
figure3

A68/NP145-特异性CD8+T细胞反应因供体不同而有很大差异。a具有代表性的A68/NP型FACS简介145-CD8四聚体染色+T细胞bA68/NP频率145+CD8+T细胞(红圈)与流感病毒特异性CD8+T细胞(彩色方块)。<12四聚体特异性CD8+T细胞/106CD8+T细胞被认为是低应答(n=11),>12四聚体特异性CD8+T细胞/106CD8+T细胞培养基反应(n=4)和>100四聚体特异性CD8+T细胞/106CD8+T细胞高反应(n=2)。四聚体+CD8+在四聚体阳性门内计数的<10细胞检测到的T细胞以开放符号表示(补充图)。2)。A68/NP的频率比较145-与通用流感病毒-特异性CD8+低应答者中的T细胞(c)和中/高响应者(d). eA68/NP的频率比较145+CD8+T细胞介于低、中/高应答者之间。f通用表位特异性CD8的频率比较+T细胞介于低、中/高应答者之间。cfBAR表示捐赠者的平均反应。精确性p值显示在上面的图表中。低响应捐助者(圆圈),高响应捐助者(平方),<10个细胞计数(开放符号)。用Mann-Withney检验进行统计学分析。精确性p值显示在上面的图表中。

表1.本研究所用供者的人口统计学和HLA分型。

引人注目的是,在低应答者中,a68/np145+CD8+T细胞池是亚显性的,与其他流行的流感特异性CD8的频率相比,T细胞池是亚显性的。+同一个体内的T细胞群(p=0.00056;图1。3B,c)。相反,A68/NP的频率145+CD8+中、高应答者的T细胞与CD8的频率相当。+针对通用流感表位的T细胞(p=0.153;图1。2B,d),表明A68/NP的免疫优势潜力。145+CD8+至少有部分供体的T细胞。这些结果清楚地表明,建立了大量的A68/NP145+CD8+T细胞的数量在捐献者之间并不是一致的(p=0.001,图1。3E)。虽然整体CD8有下降的趋势+T细胞频率直接指向低应答者的通用流感表位,与中、高应答者相比,差异无显着性(p=0.058,图1。3F)。此外,A68/np的频率之间也没有相关性。145+CD8+T细胞与CD8的频率+针对通用表位的T细胞(n=13,Rs=0.3518,p=0.1397,补充图。3)。包括更多的捐献者可能会进一步加强整体流感病毒特异性CD8的趋势。+然而,由于HLA-A*68:01供者的低频率,HLA-A*68:01阳性个体的T细胞反应不能被证实。

DIST A68/NP145CD8+T细胞表型跨应答者

了解A68/NP的低检测145+CD8+在65%的供者中发现T细胞群是由于在A68/NP内建立了不同的天真/记忆子集。145+CD8+T细胞,我们直接在体内比较A68/NP的表型。145+CD8+T细胞(I)跨HLA-A*68:01-供者和(Ii)CD8表型+针对通用流感抗原表位的T细胞。4)。我们使用三种表面标记,CD 27、CD45RA和CD 95来描绘出天真的(T)。天真、CD 27+CD45RA+CD 95)、效应器/效应器存储器(T)EFF、CD 27CD45RA),终末分化效应器(T)埃姆拉、CD 27CD45RA+),中央存储器(T)厘米、CD 27+CD45RA)和干细胞记忆(T)供应链管理、CD 27+CD45RA+CD 95+)CD8+T细胞亚群在低,中,高应答供体(图)。4A,b,补充图。1B).

图4
figure4

A68/NP表型145-特异性和普遍性流感-特异性CD8+T细胞aA68/NP表型145-和通用流感病毒-特异性CD8+低T细胞(<12 A68/NP)145-特异性CD8+T细胞/106CD8+T细胞)(n=4)、中等(>12)(n=4)和高(>100)响应者(n=2)。b具有代表性的FACS面板显示了用来描述A68/NP特性的门控策略145-特异性CD8+T细胞反应。A68/NP代表145-四聚体染色(第一组),CD 27,CD45RA染色,以鉴别T。EFF(CD 27)CD45RA),T埃姆拉(CD 27)CD45RA+),以及T厘米(CD 27)+CD45RA)细胞(第二个面板),然后用CD 95,CD8染色来识别T。天真-类似(CD 27)+CD45RA+CD 95)和T供应链管理(CD 27)+CD45RA+CD 95+)单元(第三面板)。灰点是总CD8+未富集样品中的T细胞,红点为A68/np。145+CD8+富集样品中的T细胞。c频率比较T天真和T总内存(T)厘米+T埃姆+T埃姆拉+T供应链管理)A68/NP145+CD8+T细胞在低和中/高反应。我们包括捐助方1、2和3的两个测量值:2015年采集的样本使用开放符号,2018年采集的样本使用封闭符号(另见表)。1). dT的频率比较天真-类和T总内存普遍特异性CD8+T细胞在低和中/高反应。cdBAR表示捐赠者的平均反应。用Mann-Withney检验进行统计学分析。精确性p值显示在上面的图表中。

在四分之三的低反应捐助者中,a68/np的比例显著提高。145+CD8+T细胞呈幼稚样表型(平均33.77%±23.83);n=4个捐助者),与A68/NP相比145+CD8+中、高反应组T细胞(平均1.52%±2.17);n=6个捐助者;p=0.002)(图1。4C)。相比之下,总内存A68/NP的比例145+CD8+T细胞(T细胞)厘米、T埃姆拉、TEFF、T供应链管理)(T总内存)中、高反应者(平均98.59%±1.7;n6供者)明显高于低反应者(66.23%±23.84),n=4个捐助者;p=0.002)(图1。4C),在A68/np中演示了从天真到记忆表型的转换。145+CD8+中高应答供体T细胞。

通用型流感特异性CD8的表型分析+T细胞群显示,在天真的类(p=0.062)或内存(p0.062)低、中、高应答者的表型比较(图1)。4D),与它们相似的反应强度一致。检测所有通用CD8中的记忆表型+T单元集还验证我们的a68+捐献者曾接触过流感,因此他们的A68/NP145+CD8+在以前流感病毒感染期间,T细胞暴露于抗原刺激下,所有低、中、高应答供者。

A68/NP中不同的TCRαβ库145 +CD8+T单元池

了解差异A68/NP145+CD8+T细胞对HLA-A*68:01供体的反应,我们解剖了A68/NP中克隆的多样性和组成。145+CD8+T细胞见于低、中、高应答者。我们采用单细胞指数排序和多重RT-PCR相结合的方法。43,47在单个细胞内扩增tcrα和tcrβ链,从而能够对配对的A68/NP进行分析145+CD8+TCRαβ在三个低响应者和五个中高响应者中的表现(图一)。52,补充表3).

图5
figure5

A68/NP的高克隆多样性145-特定的TCR汇辑。a基因片段的使用和配对景观显示为低(n=3)和中/高(n=5)响应者。每个克隆型都被指定为相同的垂直长度,而不管其类型大小如何。每个垂直叠加反映V和J基因片段的使用和配对是用弯曲的连接线。基因受分布频率的影响。基因使用的丰富或枯竭分别由向上或向下箭头表示,其中一个箭头与双倍增加或减少相关。b单个供者Trav和TRBV基因使用情况的饼图。分析的基因序列的总数显示在饼图中。cCircos图显示了TRA-TRB配对克隆型在供者之间的分布.每个片段定义一个单独的阵挛类型,该段的宽度与该克隆类型的频率相关。私人克隆型是灰色的。不同供体之间常见的克隆型以红色(TRBV 20-1)和橙色(TRAV 4)显示。d低、中、高应答供体中CDR 3α和CDRβ氨基酸长度的分布星号表明在体外扩增的T细胞上建立了TCR克隆型。

表2 A68/NP中配对TRBV-TRBJ/TraV-traj扩增克隆型的频率145人PBMC中的TCRs。

相对于以往报道的大多数长肽/HLA复合物的狭窄/扭曲的TCR序列26,27,28,29,30,31,A68/NP145+CD8+TCRαβ序列利用广泛的TRBV(T受体β变量)和TRAV(T受体α变量)基因片段在低应答者和中/高应答者中表达(如图所示)。5A2,补充表3)。最常见的基因片段是TRBV 20-1和TRAV 4。c.)。有趣的是,供体7(中等应答者)和13(高应答者)表达了高度限制的私人Trav和TRBV组合,分别是TRBV6-6/TRAV 4和TRBV 9/TRAV 19(图1)。c.).

对CDR 3αβ克隆型特征的进一步剖析表明,单个供者缺乏共同的结构(表)。2,补充表3)和在HLA-A*68:01-表达的供者之间缺乏共享的CDR 3αβ签名(公共克隆型)。低和中/高响应者的CDR 3α环的长度分别从4到15 aa和3到12 aa之间变化很大(如图所示)。5D)。同样,CDR 3β环的长度也是可变的,低应答者为7~12 AA,中高应答者为7至14 AA(如图所示)。5D).

总体而言,A68/NP145+CD8+TCR的αβ曲目有着惊人的多样性,捐助者之间没有共同的特征。因此,A68/NP145+CD8+T细胞的反应似乎不受特定tcrαβs的限制,它可以识别长而灵活的12 aa np。145HLA-A*68:01背景下的肽。

扩大的A68/NP145 +中、高应答者TCRαβ克隆

尽管A68/NP145+CD8+TCRαβ曲目的多样性在所有低、中/高响应者中变得明显的是A68/NP。145+CD8+中高响应者中的tcrαβ库包含很高的比例(n5,平均71%,范围为50-95%)与低反应者相比,扩大的tcrαβ克隆型(n=3,平均2.5%,幅度0-10%)(p=0.016)(图1。62)。如此高比例的扩增的tcrαβ克隆型在中/高应答者中提供了明确的证据,证明在中、高A68/np中观察到的大克隆扩展与免疫优势之间存在相关性。145+CD8+T细胞应答者。这进一步表明,最低限度的克隆扩展导致了先前存在的记忆能力差的a68/np。145+CD8+低响应和无响应的T单元池。因此,A68/NP的后续提升145+CD8+低应答者中的T细胞可能是确保HLA-A*68:01-表达的人有大量的记忆A68/NP的方法之一。145+CD8+T细胞,因此至少在某种程度上对未预料到的新出现的流感病毒有一定程度的保护.

图6
figure6

扩张的TRBV-TRBJ/Trav-traj克隆型的水平。在每个供体的全序列TCRαβ库中观察到的扩展TRBV-TRBJ/TRAV-TRAJ克隆型的频率(n=8)。图例中的字母与表中的克隆ID对应2...图中显示了每个施主内部的序列总数。星号表明在体外扩增的T细胞上建立了TCR克隆型。

与高频TCRαβ相关的记忆表型

当我们的实验使用单细胞索引排序时,我们能够直接连接到单个的a68/np。145+CD8+TCRαβ克隆型对每一分析αβ的表型进行分析。我们有兴趣连接A68/NP145+CD8+TCRαβ序列及其各自的HLA-A*68:01-NP145四聚体亲和力,正如以前的研究表明,HLA-A*68:01-特异性TCRs需要与肽-HLA复合物(Phla)高亲和力结合。48克服HLA-A*68:01中245(A245V)位多态性导致CD8结合位点亲和力降低的问题49...在单细胞指数排序技术出现之前,a68/np的高亲和力种群和低亲和力种群。145+CD8+供体16中的T细胞直接分为两个板块,显示了高亲和力和低亲和力群体之间的两个不同的TCR序列(补充图)。4)。通过使用索引排序,我们能够进一步区分高亲和力和低亲和力的a68/np。145+CD8+T细胞根据他们的实际四聚体平均荧光强度(MFI)(图一)。7).

图7
figure7

基于A68/NP的TCRαβ克隆型分布145-四聚体贪婪。FACS面板(左)显示高和低亲和力A68/np的门控145+CD8+T细胞低(供体2b)和培养基(供体7和6)应答者。表格显示了基于A68/NP排列的克隆类型145-四聚体亲和力(右)。表中最后一列显示单个阵挛型的MFI,MFI梯度颜色从高MFI(暗红色)到低MFI(白色)。TRBV 20-1(黄色)和TRAV 4(橙色)是供体之间常见的克隆型,而TRBV 6-6(蓝色)和TRBV 30(绿色)是高频率观察到的供体特异性阵挛型。

所有索引排序的捐献者(n=5;1b,2b,3b,6和7),A68/NP145+CD8+供体2b、6和7的T细胞反应(n=3)足以区分高亲和力和低亲和力的种群,因此能够在tcrαβ库与它们各自的mfi之间建立任何直接联系(图1)。7)。当我们集中分析八分之一的捐献者(TRBV 20-1和TRAV 4)中观察到的两个主要基因片段时(表)2,补充表3我们发现TRBV 20-1在低亲和力人群中更为普遍(占TRBV 20-1克隆型的59%),而TRAV 4在高亲和力人群中更为常见(TRAV 4克隆型占所有4种供体的54%)。7,补充图。4)。克隆型TRBV 30仅见于供体6,在高亲和力人群(占TRBV 30克隆型的88%)中更为普遍。7)。有趣的是,在捐献者7中,tcrαβ大部分由一个扩大的tcrαβ克隆型TRBV 6-6-CASSSPVYNEQ和TRAV 4组成。CLVGDLINSGGYNKLIF和一些较小的克隆型(图1)。7)。主要克隆型分布在高、低MFI之间。这表明四聚体结合的MFI可能不仅受TCRαβ链的影响,还可能受TCR水平、TCR动态、TCR空间排列和/或其他内在因素的影响。

随后,我们解剖了A68/np。145+CD8+所有按索引排序的捐赠者的tcrαβ库(n=5;1b,2b,3b,6和7),根据它们匹配的表型(图1)。8)。在此,我们重点研究了常见的阵挛型TRBV 20-1和TRAV 4(供体1b、2b、3b、5、6、7和16)以及供体特异性克隆型TRBV 30(供体6)和TRBV 6-6(供体7),在这些供体中检测到的频率相对较高。我们发现,在普通基因片段(trv 20-1和trv 4)和高频个体阵挛型(trv 30和tbv 6-6)中,扩增的tcrαβs在记忆CD8中非常普遍。+T细胞群(图1.8)。这些结果证实,在中、高HLA-A*68:01-应答供体中观察到的大TCRαβ克隆扩增主要为记忆表型(图一)。68).

图8
figure8

TCRαβ克隆型根据个体表型分布。FACS面板(中心)表示用于定义T的选通策略EFF(CD 27)CD45RA),T埃姆拉(CD 27)CD45RA+),以及T厘米(CD 27)+CD45RA)细胞(顶部FACS图)和T天真-类似(CD 27)+CD45RA+CD 95)和T供应链管理(CD 27)+CD45RA+CD 95+)细胞(底部FACS图)。灰点是总CD8+未富集样品中的T细胞,红点为A68/np。145+CD8+T细胞A68/NP的克隆型145+CD8+T细胞是根据表型(n=5个捐助者)。TRBV 20-1(黄色)和TRAV 4(橙色)是常见于供体之间的克隆型,而TRBV 6-6(蓝色)和TRBV 30(绿色)是高频率观察到的供体特异性阵挛型。

总的来说,我们的结果表明即使A68/NP145+CD8+tcrαβ序列是高度多样的,某些个体(包括trv 20-1、trv 4、trv 30和trv 6-6)的tcrαβ基因使用率较高,表现出更大的a68/np的大量扩展的克隆型构成了较高的记忆表型。145+CD8+T细胞反应在中、高反应区。

讨论

在本研究中,我们解剖了对12 aa np的免疫应答。145由流感危险相关HLA-A*68:01分子合成的肽。我们发现NP145病毒肽在流感病毒株中高度保守,除了第146位(该肽的P2锚定残基位置)外,尽管这不会导致病毒从a68/np逃逸。145-特异性CD8+T细胞反应。HLA-A*68:01-NP145晶体结构145肽在HLA-A*68:01分子中具有高度的流动性.A68/NP的低频率145+CD8+65%HLA-A*68:01供者的T细胞,再加上其庞大的幼稚型和非扩展的tcrαβ克隆型,表明a68/np145+CD8+在流感病毒感染期间,T细胞可能很难被吸收。相反,在记忆CD8中,广泛扩展的tcrαβ克隆型是常见的。+ T厘米中/高应答人群,暗示可能会多次接触流感,从而重复A68/NP145+CD8+T细胞增殖,建立预先存在的免疫显性A68/np145+CD8+T单元内存池。

供体用于研究a68/np的交叉反应性145-特异性CD8+T细胞的反应很可能暴露在表达np的146 a和146 t变异的病毒中。145肽。6名捐赠者于1987年出生,18名捐赠者于1991年出生。虽然15名捐赠者的确切出生日期尚不清楚,但该捐赠者是在2017年征聘的,征聘时年龄在18岁或以上,因此在1999年之前出生。结果显示,到3岁时,80%的儿童至少会感染一次IAV,到7岁时增加到100%。50...因此,所有三个捐献者都会感染一种表达该肽146 t变异体的IAV,这种病毒在2001年以前流通的A/H3N2和A/H1N1株中都有表达。尽管成人感染流感病毒的频率低于儿童,但成年人每十年仍会发生两次流感病毒感染。51...因此,可以合理地假定,在2001年之后,所有三名供者都至少感染了一次甲型H3N2病毒株和/或表达该肽146 a变异株的A/H3N2病毒株和/或A/H1 N1pdm09株流感病毒感染病例。这些捐献者很不可能通过自然感染接触到这种多肽的146 V变异体,因为在1918年至2018年记录的24408株人类IAV分离株中,只有7株发现了这种变异。

即使在CD8内快速固定氨基酸替代物+T细胞表位,尤其是锚定位点或tcrαβ结合残基,常与免疫逃逸有关。15,52人流感病毒NP蛋白中A146T和T146A替换位点的快速固定情况并非如此。丙氨酸和苏氨酸在HLA-A*68:01结合中以类似的方式结合。此外,当我们扩展A68/NP时145+CD8+三个独立供体的T细胞使用NP的146 a或146 t变体145肽,这两种变异体都扩展了A68/NP145+CD8+T细胞群和再刺激对NP的所有三种变体都有反应。145肽(分别为146 a、146 t和146 V),表明NP之间具有较高的交叉反应性。145变体。但是,根据IEDB数据库(www.iedb.org),国家警察145–156肽至少与其他四个肽重叠,即NP。146–154(HLA-A*02:03,68:02,HLA-B*14:02,02:02和HLA-C*06:02)140–148(hla-A*01:26:01,30:02,80:01,HLA-B*15:01,15:17,35:01,57:01,58:01)140–150(Hla-B*15:01)和NP139–156(hla-B*15:01)因此,在np位置观察到的变化是可能的。146是由病毒逃离CD8的能力驱动的+T细胞的反应是针对这些重叠肽中的一个或多个。我们解决了HLA-A*68:01-NP的结构问题。145丙氨酸在146(P2-Ala)位置存在,这一变异体存在于过去十年中流传的A/H3N2和A/H1N1流感病毒中。我们观察到p2-ala在HLA-A*68:01的抗原结合分裂中被很好地容纳,并且长肽像以前观察到的其他HLA-A*68:01限制性肽一样具有高度的移动性。53...这符合先前解决的HLA-A*68:01和一个9 aa NP的二进制结构。91–99肽显示,HLA-A*68:01结合肽具有高度的灵活性,从而使不同长度的重叠肽与位于P2和PΩ的保守残基结合。53...此外,HLA-A*68:01也能呈现标准长度的肽(9-10 mer),例如来自HIV的9 aa RT 313肽。53,或者是一个10 aa的自身肽,它的C端延伸可以从裂缝中凸出。54,在HLA-A*68:01分子裂缝中均采用刚性构象。

约有30种独特的mhcⅠ-长肽(≥11 aa)配合物的结构已被解决,其中2/3具有刚性构象。19...针对mhcⅠ类限制性长肽的tcr序列被观察到具有高度偏倚的tcr基因使用。26,27,28,29,30,31...这些观察结果可能表明,tcrs与这种长肽-HLA-i复合物的结合能力有限,这可能限制了肽特异性CD8的形成。+感染时T细胞。在我们的捐献者身上也观察到了A68/np的低频率。145+CD8+在65%的HLA-A*68:01供者中观察到T细胞。A68/NP的很大一部分145+CD8+在四个低应答供体中,有三个T细胞表现出幼稚的表型和单一的(非扩展的)tcrαβ信号。有趣的是,TCR的αβ曲线图在八份之六的HLA-A*68:01供者中非常多样化,包括所有三个低应答的供者。只有另外两个长肽,即肿瘤抗原HLA-B*07:02/NY-ESO-1(13 Aa)和hiv-p24 HLA-B*57:03/kf 11(11 Aa),显示了更多样的tcrαβ库。20,30,34...与Chan等人的一项研究相一致,我们观察到CDR 3长度的变化没有一致的序列基序。20...一种可能的解释是,灵活的长肽可能会导致多个潜在的次优tcrαβ结合位点,从而导致更多样化的tcrαβ库。20,32,33...然而,A68/NP的低频率145+CD8+T细胞结合多种tcrαβ克隆型和较少表达幼稚表型的tcrαβ基因片段,提示此表位的高度灵活性可能会阻止CD8的有效生成。+因此,在流感病毒感染期间,T细胞可能需要通过合理设计的T细胞疫苗来启动.

A68/NP的无效征聘是不可能的145+CD8+T细胞是HLA-A*68:01分子CD8结合亲和力降低的结果。49...此前的研究表明,即使在极低的结合亲和力下,CD8共受体仍保持着其大部分的生物活性。55...此外,CD8结合亲和力的降低不影响HLA-A*68:01-NP的功能活性。89–101和艾滋病毒塔特-特异性CD8+T细胞48,55...此外,还发现HLA-A*68:01-HIV塔特-特异性TCR结合在正常TCR-Phla结合范围内56,这与我们的四聚体亲和力数据是一致的。

总体,A68/NP145+CD8+T细胞具有免疫显性记忆潜力,在35%的供体中检测到。然而,作为其余65%的HLA-A*68:01-表达的供者有较低的前体频率的A68/NP145+CD8+T细胞,这表明在招募A68/NP方面可能有困难145+CD8+tcrαβ克隆在流感特异性应答过程中的作用,并与tcrαβ克隆对普适性流感CD8的作用进行比较。+T细胞表位在同一供体中。潜在的低CD8+针对这一个NP的T细胞频率145/HLA-A*68:01表位可能不会对有能力呈现通用流感表位的人的病情严重程度产生重大影响+T细胞对这些通用表位的反应。然而,由于HLA-A*68:01的频率在包括南美洲在内的全球土著居民中特别高(http://www.allelefrequencies.net)和澳大利亚57...这些土著居民通常缺乏HLA同型,这些异型存在着通用的流感表位,因此可能缺乏流感病毒特异性的CD8。+T细胞对其他HLAs的反应9...A68/NP145-特异性CD8+T细胞具有免疫优势潜力,使其成为新的CD8刺激的一个有趣的靶点。+T细胞诱导流感疫苗。我们还需要进一步的研究来了解他们的流感病毒特异性CD8。+T细胞的反应将受益于重复增强,例如新的CD8。+T细胞诱导流感疫苗。

方法

人血样

我们的研究评估了流感特异性CD8。+18例HLA-A*68:01供者T细胞反应。这18位捐献者代表了我们招募的所有HLA-A*68:01个人,并在6个不同的HLA类型队列中进行了HLA分型,其中包括500个捐助者。外周血单个核细胞(PBMCs)来自墨尔本大学(UOM)、澳大利亚红十字会(ARCL)(墨尔本)、Deepdene医疗诊所(墨尔本)、孟治斯卫生研究院(Menzies School Of Health Research)、皇家墨尔本医院(RMH)和阿尔弗雷德医院(AH)(表)1)。采用Ficoll-Paque(GE Health-Care,Uppsala,瑞典)梯度离心法分离PBMCs,并将其冷冻保存在液体N中。2直到需要为止。A68/NP145+CD8+2015年和2018年,捐助方1、2和3的T细胞反应分别在两个不同的时间点获得(表)1)。用ARCL法从基因组DNA中进行HLAⅠ类和II类分子基因分型。人类实验工作是根据“赫尔辛基原则宣言”进行的,并经墨尔本大学人类研究伦理委员会(伦理ID#1443389.4)、北部地区卫生部和孟席斯卫生研究学院(ID#HREC-2012-1928)批准,为搭便车捐献者服务。57Monash Health和墨尔本健康HREC(ID#HREC/15/MOH/64)为RMH献血者,阿尔弗雷德医院(ID#280/14)为AH捐献者。所有捐助者都提供了知情的书面同意。

供者的疫苗接种和感染史主要未知。然而,值得注意的是,目前的灭活流感疫苗并没有诱导流感特异性的CD8。+T细胞反应4因此,最近的流感免疫不会影响CD8。+T细胞反应在本研究中被测试。

蛋白质表达、纯化和结晶

含HLA-A*68:01的可溶性Ⅰ类异二聚体145将重链蛋白和β2-微球蛋白蛋白分别作为包涵体在BL 21上表达,制备肽。E.Coli应变。经过几次洗涤后,包体在6M胍中溶解,再进行再填充。复性缓冲液中含有0.1MTris-HCl pH8,2mM EDTA,400 mM L-精氨酸-HCl,0.5和5mm谷胱甘肽氧化还原。在冷冻复性缓冲液中加入90毫克重链包涵体,20毫克β2米包涵体,10毫克np。145肽(从GLBiochem购买)溶解在400μL的DMSO中。3天后,用阴离子交换柱和大小排除柱对蛋白质进行透析和纯化。HLA-A*68:01-NP晶体145在8-14%v/w PEG 3350、0.1M NaCl、0.1M Hepes pH7.4、20 mmMgCl中以2.5mg/ml的浓度生长。2,和5毫米CDCL2...将晶体浸泡在含有25%v/w PEG 3350的母液保护液中,在液氮中冷冻闪蒸。数据是在MX2波束线上收集的。58在澳大利亚同步加速器,克莱顿使用ADSC 315 r CCD探测器(在100 K)。利用xds软件对衍射数据进行处理。59,并使用Scala软件进行缩放。60来自CCP4套房61...HLA-A*68:01-NP的结构145以PHASER(S 0907444901012471)为模型,以HLA-A*68:01为模型(PDB登录号4 HWZ),对配合物进行了分子置换。62)没有结合肽。利用Buster软件对模型进行了改进。63经过多次人工建模运行以适应NP145肽在结构中的应用Coot软件64...最后的模型已在蛋白质数据库验证网站上得到验证,最终的精化统计数据汇总在补充表中。1...所有分子图形表示都是用MacPyMOL v1.7.6.3创建的。65.

病毒序列分析

研究NP中氨基酸变异的频率145人类甲型H1N1流感病毒肽(1918-1957,1977−2009和2009-2018),A/H2N2(1957-1968),A/H3N2(1968-2018),H5N1(1997-2014)和H7N9(2013-2017)病毒,所有全长NP氨基酸序列可从国家生物技术信息中心(NCBI)流感病毒资源数据库中获得;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU),截至2018年7月31日已下载。使用BioEdit排除大缺失序列,在Ugene 1.16.1中分析其余数据集(http://ugene.unipro.ru;Unipro,Novosibirsk,俄罗斯)评估NP不同位置变化的频率145肽。在Excel中对病毒进行分析,以确定观察到的频率是否是簇形成的结果,以及某些突变是否在时间上固定。

肽和四聚体

IAV NP变体145肽(D)ATYQRTRALVR,DTTYQRTRALVR和DVTYQRTRALVR(TYQRTRALVR)是从GenScript(美国新泽西州的Piscataway)购买的。赫拉A*68:01-NP145(DATYQRTRALVR)单体是通过将每个肽与其限制性α重链Bira和β2-微球蛋白折叠而生成的。66前8:1与PE-链霉亲和素或APC-链霉亲和素(BD生物科学,美国圣何塞)结合形成四聚体。

T细胞株的产生

扩增流感病毒特异性CD8+针对HLA-A*68:01-限制性NP的T细胞145表位,自体PBMCs(~3×10)6来源于HLA-A*68:01供体的细胞用10μM NP脉冲处理。145肽(DATYQRTRALVR、DTTYQRTRALVR或DATYQRTRALVR、DTTYQRTRALVR、DVTYQRTRALVR)在1ml无血清RPMI 1640培养基(Invitrogen)中,37°C下冲洗90 min。肽脉冲PBMCs与自体非肽脉冲PBMCs(6×10)共同孵育。6在cRPMI(添加2mM L-谷氨酰胺(吉布CO)、1mm MEM丙酮酸钠(吉布CO)、100 M MEM非必需氨基酸(吉布CO)、5 mM HEPES缓冲液吉布co)、55 mm2巯基乙醇(吉布CO)、100 U/ml青霉素(吉布CO)、100μg/ml链霉素(吉布CO)和10%胎牛血清(吉布CO)中培养10d。培养于第4天添加20 U/ml rIL 2(瑞士巴塞尔罗氏),然后每3-4天添加新鲜培养基。36.

细胞内染色

扩大的A68/NP145+CD8+用1M肽(DATYQRTRALVR、DTTYQRTRALVR、DVTYQRTRALVR或DATYQRTRALVR、DTTYQRTRALVR、DVTYQRTRALVR)刺激T细胞,在10U/ml rIL 2和高尔基停止(BD生物科学)存在下培养5h。活化后,用人抗CD3-bv 510(1:200,biolegend#317332)、抗CD4-bv 650(1:200,bd Horizon#563875)、抗CD 14-apc-h7(1:100,bd mingen#560180)、抗CD 19-apc-h7(1:100,bd phmingen#560177)、抗-CD8-percPCy5.5(1:100,bd制药原#565310)、活/脱近红外染色(1:800,invitrogen)、抗CD 19-apc-h7(1:100,bd制药原#560177)、抗-CD8-percPCy5.5(1:100,bd药源#565310)、活/脱近红外(1:800,invitrogen)145(DATYQRTRALVR)四聚体BD-Fix-Perm缓冲液(BD生物科学)固定20 min,人抗IFN-γ-V 450(1:100,BD视野#560371)细胞内染色30 min。细胞被清洗,采集到BD Fortessa(BD生物科学),并使用Flowjo软件(Treestar,OR,USA)进行分析。

NP的磁富集145 +CD8+T细胞体内外

PBMCs或T细胞株(1-5×10)7)在加50 U/ml苯并酶(Novagen Merck)的cRPMI培养基中解冻。细胞在磁活化细胞分选(MACS)缓冲液(PBS+0.5%牛血清白蛋白(BSA)和2mm EDTA)中洗涤一次,并与抗人FCR块[20μmol/1×10]孵育。7细胞](Milteny Biotec)在冰上作用15 min,然后在室温下用PE-和/或APC-链霉亲和素结合四聚体[MACS缓冲液中1:100]染色1h。一次清洗后,细胞在冰上孵育30 min,分别与100μl抗PE和/或100 l抗APC微球(Milteny Biotec)在400和300 lMacs缓冲液中孵育。细胞在通过LS柱(Milteny Biotec)前洗过两次,以富集四聚体阳性细胞。45,67...然后用人抗CD45RA-fITC(1:200,bd生物科学#555488),抗CD8-PerCP-Cy5.5(1:200,bd生物科学#565310)在macs缓冲液中显示细胞。APC(1:50,BD Biosciences#337169),or anti-CD27-BV711(1:200,BD Horizon#563167),anti-CD3-AF700(1:50,BD Biosciences#557943),anti-CD14-APC-Cy7(1:100,BD Biosciences#560180),anti-CD19(1:100,BD Biosciences#560177),anti-CD62L-V450(1:100,eBioscience#48-0629-42),anti-CD4-BV650(1:100),anti-CD56-BV785(1:100,BD Horizon#564058),抗CD 95-PECF 594(1:100,BD Horizon#562395),抗CCR7-PeCy7(1:50,BD生物科学#557648),活/死水死细胞染色(1:800,Invitrogen)30 min。细胞随后被洗涤一次,用1%多聚甲醛(ProSciTec)固定在LSRFortesa II(BD生物科学)上,或重新悬浮在MACS缓冲液中进行单细胞分类-(指数)--使用BD FACSAria III(BD生物科学)进行分类,然后使用Flowjo软件(BD生物科学)进行分析。

单细胞RT-PCR与TCR序列分析

A68/NP145浓缩细胞分别(指数-)分类为冷冻96井孪生PCR板(Eppendorf,德国汉堡),并立即储存在−80°C,直到需要。采用多重套式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对单细胞配对的cdr 3α和cdr 3β区域进行分析,并对cdrα和cdrβ产物进行测序。43,47,68...在PCR平板上,分别用0.5~15×Vilo反应混合物(Invitrogen)、0.25×SuperScript酶组合(Invitrogen)和0.1%Triton X-100(Sigma)分别在25°C、42°C、120 min和85℃下孵育5 min。用多重套式PCR技术,在含有2.5l cDNA的25份PCR反应混合物中,扩增各细胞的TCR转录本。第一轮PCR用2.5×10×PCR缓冲液(含15 mm MgCl 2)(前根),0.5l 10 mm dNTP(Invitrogen),0.15l塔克DNA聚合酶(5个单位/l)(前根),外感TRAV和TRBV各2.5pmol,外加反义TRAC和TRBC引物(补充表)4)。第一轮聚合酶链反应产品的总二分二分位数为模板,分别加入了一条内部感觉Trav和一条内部意义的TRAC引物(补充表),作为第二轮PCRS的模板。4)或内部正义TRBV和内部反义TRBC引物(补充表)4)。第二轮PCR用CoralLoad PCR缓冲液10×(奇根)代替10×PCR缓冲液。外部和内部PCR循环的PCR条件为:95°C 2 min,95°C 20 s,52°C 20 s,72°C 45 s,72°C一步7 min。用TRAC和TRBC引物对PCR产物进行纯化和测序(补充表)。4)。用FlinchTV进行序列分析。通过IMGT查询(www.imgt.org/imgt_vquest)。利用TCRdist分析管道解析TCR序列69...克隆型被定义为具有相同V、J和CDR 3区域的单细胞TCRαβ对。Circos绘图是使用联机Circos软件包生成的(http://mkweb.bcgsc.ca)70.

统计分析

数据用spss统计分析25使用Mann-Withney检验,差异被认为有显着性。p值<0.05。汇集了中等和高反应小组,以确保有足够的统计分析力量。

报告摘要

有关研究设计的进一步资料,可参阅自然研究报告摘要链接到这篇文章。

数据可用性

HLA−A*68:01-NP的PDB登录号145复合结构为6 PBH。TCR序列数据已存入VDJdb[https://vdjdb.cdr3.net]。图中的源数据。28、补充图。242和补充表3作为源数据文件提供。在提交人提出要求时,所有其他数据都可从提交人处获得。





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