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免疫核糖核酸的制备及检定

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发表时间:2019-12-06 16:15作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

免疫核糖核酸的制备及检定

(一) 原理

免疫核糖核酸(iRNA)是用某种抗原免疫动物后,从免疫动物的免疫活性细胞中提取出来的RN

A。它具有传递相应抗原特异性免疫信息的能力,因而注入体内后,可发挥对该抗原的免疫清除作用。iRNA的免疫学作用机理目前尚无定论,一般认为iRNA具有直接模板作用,即iRNA以mRNA的形式在受体细胞中起模板作用,从而合成与免疫反应有关的蛋白质,使正常非致敏的淋巴细胞转变成致敏淋巴细胞。另外,也有人认为iRNA具有逆转录作用、免疫调控作用及“超抗原”作用等。

(二) 材料与方法

1 动物免疫

(1) 抗原制备:根据欲制备的免疫核糖核酸的目的不同,采用不同的抗原。

如欲制备抗乙肝iRNA,可采用乙肝疫苗,每20μg乙肝疫苗,加1ml弗氏不完全佐剂(液体石蜡8ml加羊毛脂2ml)及卡介苗45mg,充分混匀并乳化合格后备用。

(2) 动物选择及免疫:大量制备时,多选用绵羊或山羊,小量制备时,可选用家兔或豚鼠,

所用动物应健壮无病。免疫方法为背部及两肘窝多点皮下注射上述乳化疫苗,同时腹腔注射

10μg乙肝疫苗,其后每周腹腔注射20μg,共4次。

(3) 效价测定及脏器采取:第4次免疫后1周,静脉采血,分离血清,用ELISA

测效价,如效价在1∶800以上即合格。处死动物,采取脾脏及淋巴结,置-20℃保存备用。2 iRNA的提取(热酚法)

(1) 粗提:将脾脏及淋巴结去掉结缔组织及被膜,用生理盐水洗净,切碎,

洗去血液,挤干。每200g组织加200ml盐水,置高速组织捣碎机中制成匀浆(以8000~10 000r/min匀浆两次,每次1~2min)。

向上述匀浆中加入苯酚溶液(苯酚1800ml加水200ml)200ml及01%SDS1000ml,混匀,置60℃水浴振荡10min,置冰浴冷却10min,以3500r/min离心30min,取上清液置冰浴中。

(2) 精制:在上述上清中加入半量苯酚溶液,室温下剧烈振荡10min,以3500r/min离心20min,取水相。加2~3倍体积95%酒精,置冰箱(普通或低温冰箱均可)过夜。以3500r/min离心30min,弃上清,取沉淀。取少许沉淀,溶于适量水中,测DNA含量及蛋白质,合格后可做下步。

3 除菌、分装及冻干取上述沉淀,加适量三馏水溶解,取少量用紫外分光光度计测RNA含量,按测定结果,将上述溶液用三馏水稀释至约2mg/ml。加倍量6%右旋糖酐,混匀。用微孔滤膜滤过除菌,分装(1mg/支),冻干,封口,待检。

(三) 检定

1pH值取本品2支,溶于10ml馏水中,其pH值应为6880

2 吸收度取本品溶于馏水中,用紫外分光光度计检测,其OD260/OD280应不小于20

3DNA含量测定用标准DNA作对照,以紫外法测定,DNA含量不大于5%

4RNA含量测定取本品3支,分别溶解于50ml馏水中,按《中国药典》二部附录法测定,三支含量均应在95mg以上。

5 异常毒性取本品,以注射用生理盐水制成05mg/ml溶液,家兔可静脉注射,应无异常反应。

6 无菌检查取本品3支,溶于6ml无菌水中,分别接种于普通培养基,厌氧培养基及霉菌培养基,培养1周,应无菌生长。

7 活性测定采用白细胞粘附抑制试验。其原理为正常白细胞在体外培养时,可粘附于玻璃表面,而用iRNA处理过的白细胞,其粘附于玻璃表面的能力则被抑制,测知该粘附抑制率,即知iRNA活性。方法为:取绵羊抗凝血,分离白细胞,将白细胞调 节为在血细胞计数板上每大格内含4080个细胞的浓度。取细胞悬液,加等体积iRNA溶液,37℃水浴后,移入血细胞计数板,置37℃温育后,用盐水冲洗、计数。同时作正常白细胞(不加iRNA)对照。计算白细胞粘附抑制率,如大于20%为合格。

() 注意事项

1 温度对iRNA活性影响较大。提取过程须加热时,应严格控制温度及时间。提取间歇时,应置冰浴中。

2 严格控制RNA酶。RNA酶分布广泛,如污染RNA酶可将iRNA降解而失去活性。因此,各步均应严格控制,如器皿泡洗后,应干热灭菌,操作者应带手套,提取过程中,可加入RNA酶抑制剂等。

3RNA的提取主要有热酚法及冷酚法两种,前者产率高,但易引起RNA的变性和降解;冷酚法(04)不易引起RNA的变性和降解,但产率较低。

4 苯酚为冰状固体,如颜色变红,是为氧化之故,应废弃。苯酚加热融化后,方可配制,配制时,配制者应注意防护。如苯酚配制后须较长时间存放,应加入8羟基喹啉以抗氧化。


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