伤寒肠沙门氏菌伤寒血清S伤寒杆菌)仍然是一个主要问题，特别是在发展中国家。由于多药耐药菌株(MDR)的迅速出现，限制了常规抗生素的疗效，以及与现有疫苗有关的问题，人们正在努力开发有效的预防药物。以伤寒毒素cdtB亚基为研究对象，以伤寒杆菌为研究对象，对其疫苗潜力进行了评价。体外克隆和纯化的CdtB蛋白的DNase活性表明，DNA带强度明显降低。在CdtB蛋白存在的情况下，用不同细胞株检测代谢活性和形态学改变没有明显的毒性迹象。细胞周期分析进一步加强了这些观察，流式细胞术对其进行了评估。考虑到这些观察，cdtB的免疫保护潜力被评估为S伤寒致小鼠腹膜炎模型。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测免疫小鼠抗CdtB蛋白IgG抗体(>128000)滴度，免疫印迹法验证。该蛋白的主动免疫保护了75%的小鼠，使其免受致死剂量的影响。S伤寒杆菌TY2结果表明，与对照组相比，免疫感染小鼠脾脏和肝脏的细菌载量显著降低(达5 log)，可能导致脾肝组织结构和细胞因子(IL-6、TNF-α和IL-10)水平的调节，从而表明该亚单位的有效性。从研究中得出的观察结果证明了蛋白质的免疫原性势的概念。然而，进一步研究CdtB的免疫反应性，以及从人类获得的大量血清样本，将有助于建立CdtB蛋白在人体中的相关性，并制定出作为一种有效的候选疫苗的策略。

伤寒肠沙门氏菌伤寒血清是一种严重的全身性发热疾病，每年在世界各地造成约60万人死亡。1,2. S伤寒杆菌属革兰氏阴性兼性厌氧菌属。肠杆菌科...它通常通过受污染的食物和水源传播，并在发展中国家流行，特别是在公共卫生措施达不到标准的亚洲大陆。3,4,5...阿莫西林、氯霉素和复方三氮唑等抗生素一直是抗炎药物治疗的中流砥柱。S伤寒。然而，由于耐药菌株的出现越来越多，这些常规抗生素正在变得无效。6...最近在2017年，世卫组织宣布了抗生素耐药优先病原体的名单，并提到S...伤寒杆菌是其中之一7...因此，为了避免出现这种有机体的抗药性变异体；从而减少传染病的影响，特别是在流行地区，迫切需要采取新的生物治疗或预防方法。

在预防措施方面，从全细胞疫苗到亚单位疫苗和多价结合疫苗，不同类型的伤寒疫苗进行了试验和测试，以证明其提供保护的有效性。早期灭活(死亡)和活的全细胞疫苗正在使用。8...然而，由于相关的不良反应(系统和局部)发生率高，灭活疫苗提供的短期免疫，以及对多剂量方案的要求，免疫低下者不适合，以及恢复到弱毒全细胞活疫苗的危险，使其不适合使用。9...后来，随着知识的进步，重要的沙门氏菌抗原在其发病机制中的作用已经转移到亚单位疫苗的开发上。Vi-荚膜多糖作为毒力因子之一，在亚基的开发中得到了广泛的应用。10，共轭11,12多价疫苗13...霸王龙®(vi-荚膜多糖疫苗)、peda-typhtm(共轭疫苗)和Ty21a是商业上可用的肠外疫苗，也与局部反应性和多剂量机制等限制有关。13...尽管付出了巨大的努力，我们还是在寻找一种有效的疫苗沙门氏菌由于以上所述的现有疫苗的缺点，正在继续进行。8,13,14.

伤寒毒素，十年前被认为是一种潜在的毒力因子S...伤寒杆菌，据报道在伤寒杆菌的致病性中起作用。S...伤寒15可以证明是一种有效的疫苗候选。在一种持续感染小鼠模型中，人们观察到伤寒毒素参与了建立S...伤寒杆菌的持续感染最有可能是通过改变免疫细胞的功能来实现的，尽管其完整的潜在机制仍未被很好地了解。16,17...据记载，伤寒毒素是在感染的哺乳动物细胞内产生的，然后通过一种独特的运输机制将伤寒毒素输出到细胞外环境。沙门氏菌-含液泡15,18(SCV)。这种机制有助于毒素从被感染的细胞中流出，使其他靶细胞中毒，表达在人体中大量表达的唾液酸的特定类型。伤寒毒素属于AB型毒素家族，有两个亚基组成，而不是A亚基，即CdtB(细胞膨胀毒素B)和PltA(百日咳样毒素A)和PltB(百日咳样毒素B)作为B亚基。CdtB和PltA是毒素的活性催化部分，而PltB则有助于与靶细胞结合。19...cdtB亚基具有脱氧核糖核酸酶样的活性，可引起dna损伤，从而导致细胞周期阻滞(主要在G2期)和细胞膨胀，从而导致受感染细胞的凋亡或衰老。18,20,21,22...伤寒毒素纳米结合形式与伤寒危及生命症状的潜在联系表明，它可以作为制定急需的伤寒预防策略的基础。

据我们所知，这是首次用小鼠腹膜炎模型表明复合伤寒毒素cdtB亚基的免疫保护潜力，以期进行干预。沙门氏菌感染。

细菌菌株

肠沙门氏菌研究中使用了伤寒血清学株TY2(最初从印度Kasauli的CRI获得)和临床分离物(从政府医学院和医院获得，32部门、Chandigarh和整个印度医学科学研究所，新德里)。BL21(DE3)E.coli在研究过程中使用了有能力的宿主细胞。在37°C条件下(150 Rpm)，在37°C条件下，将细胞在37°C下培养一夜，制备了细菌细胞悬浮液。23,24.

代理

本研究采用抗生素卡那霉素原液(50 mg/ml)、利尿肉汤(LB)和来自Himedia的琼脂。Taq聚合酶和限制性内切酶、印地语Ⅲ和NdeI等酶是从热鱼中获得的。从西格玛购买的异丙基β-D-1-硫代乙酰基吡喃糖苷(IPTG)。弗洛因德的佐剂用于西格玛。小鼠细胞因子试剂盒：肿瘤坏死因子-α是从Krishgen生物系统(印度孟买)购买的，IL-6和10从Diaclone，法国贝桑松购买.二次抗人抗体和抗鼠抗体是从印度班加罗尔的Genei购买的.

细胞培养

CaCO-2和原始的264.7细胞株(从印度浦那国家细胞科学中心获得)在37℃下用5%CO加湿培养。2...培养液为Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)，添加5%胎牛血清、50 U/ml链霉素和100 U/ml青霉素，每2天更换一次。

动物与伦理清理

动物研究得到潘贾布大学动物伦理委员会的批准(批准号：)。PU/45/99/CPCSE/IAEC/2018/226)。本研究选用6~8周龄的近交系Balb/c雌性小鼠。所有动物都被安置在干净的聚丙烯笼子里，喂养标准的无抗生素饮食和水。所有实验议定书均经昌迪加尔潘贾布大学机构动物伦理委员会(IAEC)批准，并按照印度政府动物实验控制和监督委员会的指导方针执行。根据印度昌迪加尔潘贾布大学动物机构伦理委员会的指导方针处理和处置动物。

硅中研究和验证CdtB基因存在沙门氏菌临床分离株

的同源性。CdtB不同菌株的基因沙门氏菌对伤寒杆菌基因序列进行BLASTn分析。https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。利用IEBD分析资源，对CdtB蛋白T细胞和B细胞免疫表位及T细胞表位免疫原性进行了预测。http://tools.iedb.org/main/)25...此外，CdtB基因验证S...伤寒杆菌TY2株和15株临床分离株。为了证实该基因的存在，在以下条件下，用5‘TGCATCGGACTGGGTAATG 3’和5‘GTCTGCTGGCTGCGATTA 3’引物进行PCR，变性95°C 30秒，58°C退火45秒，72°C延伸30秒。

质粒构建与转化

PET-28a是一种广泛用于表达重组蛋白的表达载体。简单地说，CdtB用前向5‘TAAGCATATGATGAAAACCTTTTTT 3’和反向引物5‘TCTTAAAGTTTACTCTTACTCTTCGTGCCAAAA 3’分别扩增出具有印地语Ⅲ和NdeI限制性内切酶位点的基因。放大CdtB基因和载体用热消化酶、辛地那Ⅲ酶和NdeI酶消化。经消化后，将载体和基因进行凝胶纯化，在16℃下用Takara T4 DNA连接酶进行连接30 min。重组DNA转化为E.coli利用CaCl的BL 21(DE3)宿主细胞2方法26...用碱性裂解法提取质粒，检测在含卡那霉素琼脂平板上转化的细胞是否存在重组质粒。为了证实插入到pET28a质粒中的DNA的完整性，还进行了核苷酸测序分析。从转化的BL 21(DE3)中提取载体。E.coli用琼脂凝胶纯化试剂盒纯化细胞，用T7启动子和终止子引物进行测序。

蛋白的表达与纯化

为表达CdtB蛋白，将单个转化细胞接种于含LB的新鲜抗生素中，在37°C摇床条件下过夜培养。第二天，将1%的培养接种在含LB的新鲜抗生素中，并允许在标准条件下生长，直到O.D。600达到0.4-0.6。1mm浓度IPTG诱导蛋白表达。

用硝酸镍-三乙酸(NTA)-琼脂糖层析法从包涵体中纯化了His标记的CdtB.细菌经8000 rpm离心10 min后，在结合缓冲液(20 mm Tris-Cl(PH 8)，5 mm咪唑，500 mm NaCl)中进行洗涤和悬浮。悬浮液在冰上超声处理半小时，12000 rpm进一步离心20 min，收集包涵体。包涵体洗涤两次，悬浮于6M尿素中。将蛋白完全溶于尿素中孵育1h后，用12000 g离心20 min。将所得萃取物应用于Ni-NTA柱预平衡，并与含6M尿素的结合缓冲液进行了比较.柱用20 mm Tris-Cl(PH 8)、500 mm NaCl、15 mm咪唑和6M尿素洗涤。结合蛋白用含有300 mM咪唑的缓冲液洗脱，在10 mM Tris-Cl(PH 8)和100 mM NaCl下进一步透析。用10 kDa截留浓缩器浓缩蛋白质.用sds-PAGE法检测纯化蛋白的纯度。27.

体外纯化CdtB蛋白的核酸酶活性

评估体外桥联蛋白CDtB蛋白核酸酶活性的研究等人.28紧随其后的是很少的改动。2 0 0ng纯化的人DNA(用奇根DNA提取试剂盒提取)在37℃、3种不同浓度的CdtB蛋白(10 0ng、2 5 0ng和5 0 ng)中，在50 mm NaCl、2 0 mm Tris-HCl(pH7.5)、5 mm CaCl 2、5 mm MgCl 2、5 0μg/mL BSA的消化缓冲液中孵育40 min。以1%琼脂糖凝胶为原料，加入10 mm EDTA，停止反应，并对酶解产物进行分析。此外，还进行了上述蛋白质浓度的另一组实验，培养时间超过4h，在2%琼脂糖凝胶上对产物进行分析，以观察消化后的DNA片段(如果有的话)。在37℃不加CdtB的条件下培养DNA，以牛DNaseⅠ(2ng，10 min)分别作为阴性对照和阳性对照。用ImageJ软件对DNA带密度进行了测定。

用不同细胞株评价毒素(如果有的话)的不良效应

形态变化

为了研究cdtB蛋白在真核细胞中引起的形态学改变(如果有的话)，采用CaCO-2(人)和RAW 264.7(小鼠)细胞株。简单地说，24小时半合流培养含4×10。4在不同浓度(1、10和100μg/ml)蛋白制剂存在下，培养1d后检测细胞/ml。显微镜下观察不同浓度的cdtB蛋白对细胞形态的影响。29.

MTT法(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴)测定

采用MTT法测定细胞(CaCO-2和Raw 264.7)在蛋白质存在下的代谢活性。细胞经胰蛋白酶消化或刮除后，在1×10的培养基中稀释。4细胞/毫升，一式三份，制成微滴板。然后加入不同浓度的cdtB蛋白(1，10和100μg/ml)，在适当的条件下孵育24h，加入mtd(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑)溶液100μ1，加入2，5-二苯基四氮唑蓝溶液，回流培养4 h，4h后，每孔加入1 0 0μ1，记录吸光度，包括在5 70 nm处的吸光度。30.

细胞周期分析

采用流式细胞仪观察蛋白质对细胞周期的影响。细胞(原料264.7和CaCO-2)接种于24孔板中，密度为4×10。4细胞/ml，不同浓度的蛋白质(1，10，100μg/ml)作用24h，细胞离心，用PBS洗涤两次，悬浮于500μl的冷乙醇(70%)中，在冰上孵育15 min。固定后，将细胞悬于3 0 0mg/ml碘化丙酸丙酯(PI)溶液(0.0 5mg/ml PI；0.0 2 mg/ml RNase；0.3%TritonX；1 mg/ml柠檬酸钠)中，在冰上再孵育1h。细胞用PBS洗涤并分析。29,31.

对.的评价体内CdtB的免疫原性

实验免疫小鼠血清

用佐剂注射纯化蛋白，检测CdtB作为免疫原的潜力。一次剂量(50μg)CdtB蛋白与弗氏完全佐剂的比例为1：1，经腹腔注射给8只小鼠，然后按1：1比例混合蛋白浓度的一半(25g)的3个增强剂量，并在14时给予弗氏不完全佐剂。TH, 21TH和28TH天。对照组4只，注射PBS佐剂。第17天分别从对照组和免疫组采集血清。TH, 23TH, 30TH分别进行定量(间接ELISA)和定性(Westernblotting，仅在第二次增强后)检测和检测抗CdtBIgG抗体。

将10μg/ml的CdtB蛋白(在碳酸盐缓冲液中稀释，pH9.6)涂于4°C的微滴定板井中，每步用PBS pH7.2冲洗三次，隔夜用5%脱脂乳堵塞。第二天，分别加入1：500~1：256000不同稀释度(1：500~1：256000)的10 0份μl血清，37°C孵育1h，然后加入抗人IgG-HRP结合抗体(1：20000)μ1，在相同条件下孵育1h。潜伏期结束后，加入50μ1底物，在黑暗中显色10 min。该反应以50μl/孔(0.1nH)停止。2所以4，用微板阅读器在450 nm处读出。32,33.

WESTERNBLOTTING

为检测免疫小鼠的CdtB特异性抗体，在12%三甘氨酸SDS-PAGE凝胶上检测CdtB蛋白，并将蛋白带转移到PVDF膜上。用PBS-吐温20(0.05%)制成的5%脱脂乳在37℃下封闭2 h，37°C用1：500稀释液(封闭缓冲液)与2份血清样品(1：20000稀释)孵育1h，每次用洗涤液(pBS-T，0.05%)冲洗，37°C与抗人IgG-HRP结合抗体(1：20000稀释)孵育1h，然后用PBS-T(0.05%)冲洗，37°C与抗人IgG-HRP结合抗体(1：20000稀释)孵育1h。用显色剂tmb溶液(在黑暗中)显色10-15 min，用洗涤缓冲液冲洗停止反应。32.

设立S伤寒性腹膜炎小鼠模型

大鼠腹膜炎模型的建立S伤寒杆菌(TY2)，在5%的猪粘液中通过腹腔注射。33,34,35不同剂量(10次)7, 108, 109(3)在小鼠(n=3)中标准化24h内致人死亡的剂量，以了解接种疫苗对动物生存能力的影响。对照组(n=3)给予PBS。

主动免疫

在检测了该蛋白的免疫原性后，对两组小鼠进行了主动免疫，每组8只。小鼠免疫以同样的方式(1：1)进行。圣, 14TH, 21圣和28TH日)如上文所述，后面是致命剂量的挑战(10)9(Cfu)S伤寒经腹膜内途径。其中一组记录动物在攻击后30天的存活情况，另一组用于细菌负荷研究、组织学检查和细胞因子水平评估。对照组，由4只小鼠组成，在上述天数内，仅用PBS混合佐剂，然后进行细菌攻击(作为未免疫感染的对照)。

细菌负荷的测定

对照组(未免疫感染)20 h脾脏和肝脏细菌负荷，20 h和7 h免疫感染组细菌负荷。TH检测感染后第一天。用颈脱位处死小鼠，在无菌条件下解剖取器官。将器官悬浮在无菌PBS(pH7.2)中，均匀化，铺在MacConkey琼脂平板上，37℃保温过夜。菌落形成单位数以对数表示。10CFU。

组织建筑学

未免疫组、未免疫组、未免疫组和免疫感染组的肝和脾标本无菌切除(20小时和7小时)。TH感染后第一天，用10%福尔马林缓冲液固定，用苏木精-伊红染色，显微镜下观察细胞浸润和聚集情况。36.

细胞因子估计

对照组(未免疫感染)和免疫感染组分别于20h和7h测定血清和脏器(肝、脾)中促炎因子(α和IL-6)和抗炎细胞因子(IL-10)。TH按制造商的指示使用试剂盒进行免疫感染日(α，krishgen生物系统，孟买，印度37)，IL-6和10，Diaclone，Besancon，Cedex，法国38,39)。在无菌状态下采集血清和器官，并进一步测定细胞因子水平。33,40.

统计分析

实验至少进行了三次，数据表示为平均±SD。用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析，采用学生t检验和单因素方差分析(ANOVA)评价数据的显着性。数值小于0.05(p < 0.05) were considered statistically significant.

沙门氏菌伤寒杆菌和另一种新出现的人类限制性血清S...甲型副伤寒对发展中国家的健康构成巨大挑战。除此之外，关于MDR菌株的报道S...伤寒增加了无法治愈的伤寒复发的可能性。5,41...目前，Ty21a和Vi-荚膜多糖疫苗(单独和结合；与破伤风类毒素(Tt)和肝细胞病毒(Hepatyrixtm)相结合)可供商业使用。8,13，但是有一些主要的限制，例如不能提供完全的保护S伤寒杆菌感染作为Vi-抗原并不是普遍表达的所有菌株S伤寒42,43无法引起2岁以下儿童的免疫反应和局部反应性13,14...主要来自亚洲国家的临床报告表明，Vi-tt(破伤风类毒素)结合疫苗和Vi(多糖)疫苗的有效率分别约为55%和52%。44,45因此，有必要寻找其他抗伤寒疫苗的候选疫苗。最近的一项研究报告了各种新的S伤寒杆菌特异性抗原46其中一种新发现的抗原是cdtB，它是伤寒毒素的活性基序，可引起急性伤寒症状。47...cdtb之所以被选中，是因为它是独一无二的。S伤寒杆菌特异性及感染后分泌48.

为了向宿主提供广泛的病原体保护，任何候选疫苗的首要要求是它应该在特定物种的所有菌株中普遍存在和保存。BLASTn分析表明CdtB的所有菌株中具有100%和99%同源性的基因S蒂菲和S...甲型副伤寒。此外，CdtB与人和小鼠基因组没有相似之处，这是避免宿主自身免疫的关键。针对不同的人类HLA等位基因，预测了cdtB蛋白的各种B和T细胞(mhc第1和Ⅱ类)结合表位(肽)，以预测蛋白质的免疫原性；此外，这些预测肽还可用于构建基于表位的伤寒疫苗。沙门氏菌(补编)表沙一–S4)。然而，由于每个与MHC结合的表位不一定要被T细胞识别并产生有效的免疫应答，因此也进行了肽-MHC(Ⅰ类MHC)复合物的预测，以获得良好的免疫应答，表明多肽-MHC复合物诱导免疫应答的可能性更大。表沙一)。验证硅中预测.的存在CdtB用15株临床分离株进行的基因分析S(伤寒杆菌)在所有两个分离物中均显示基因流行。S.副伤寒A(图1.1)。然而，它被发现在沙门氏菌[医]香菇(图1.)1)，从而支持“伤寒沙门氏菌”这一人类限制性质的事实，因为伤寒毒素是由两种伤寒血清编码的。S...伤寒和S...副伤寒主要由非伤寒血清缺乏。49,50.

CdtB15株临床分离株TY2的基因存在。S...伤寒人和两人S...副伤寒分离物。1：100 BP梯(100-1000 BP)，2：S伤寒杆菌TY2，3-17：15株临床分离株S...伤寒人，18岁：S...Typhimurium和19-20：S...甲型副伤寒分离物(全长凝胶见附图)。沙一).

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据报道，cdtB蛋白在体内仅限于(感染后细胞内)47因此，将其基因克隆到pET28a载体中，以获得丰富的蛋白质，为进一步的研究奠定了基础。用NdeI和印地语酶对阳性克隆质粒进行限制性酶切图谱，证实了重组质粒的构建，如图所示。2A...此外，阳性克隆的核苷酸分析表明，100%的序列与CdtB.基因S伤寒杆菌(加入号。(NC_003198.1)，它表示成功地插入了CdtB基因转入载体(补编)。无花果。S3)。在不同温度(28°C、37°C和40°C)下，利用1mm IPTG优化蛋白的表达。2B)。由于该蛋白在不溶性组分(作为包涵体)中表达，因此在变性条件下得到纯化。51采用Ni-NTA亲和层析。纯化后对变性蛋白进行可溶性复性，得到的蛋白质最终复性后产率约为10 mg/L。经Coomassie染色的SDS-PAGE凝胶分析，得到的纯化蛋白的纯度约为31 kDa(图1)。2B).

(a)重组质粒的构建。第1条：重组未切质粒，2：重组质粒双酶切产物，3：梯形(全长凝胶见附图)。S2A). (b)在37°C条件下诱导BL 21细胞，纯化蛋白。第1道：纯化蛋白，2：梯状细胞(以kDa计)，3：未诱导细胞，4：诱导细胞。(未裁剪的、全长凝胶见附图.S2B).

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cdtb与dnaseⅠ蛋白家族成员具有位置特异性序列同源性。52，支持它的核酸酶活性。53,54. 体外对CdtB蛋白DNase活性的测定表明，1%琼脂糖凝胶上DNA带强度明显降低。3A(一、二))，但未观察到消化DNA片段。在阳性对照情况下，DNA在10 min内完全降解。为了观察消化DNA片段(如果有的话)，在2%凝胶上分析产物，超过孵育时间4小时后，观察到DNA片段随DNA强度的降低而降低(见图)。3B(一、二))，从而指示蛋白质在-体外核酸酶活性在……下面体内在条件下，CdtB亚基执行其类似DNase的催化活性((在体内)只有与其他亚基PltA和PltB一起，才能使其进入细胞内。29,49,55,56...然而，也有其他的报道描述了其他革兰氏阴性病原体重组产生的cdtB蛋白对细胞的毒害作用。57...因此，在评价其在实验动物中的免疫保护效果之前，仍在对该亚基进行细胞毒性研究，以排除其不理想的作用。在不同蛋白浓度(1、10和100μg/ml)下，对不同培养细胞(小鼠)和CaCO-2细胞(人)对CdtB蛋白的敏感性进行了研究。所有细胞类型的形态无明显变化(补编)。无花果。S5小鼠细胞株与人细胞株相比，未发现代谢活性受到抑制，其代谢活性有轻微的浓度依赖性抑制(图一)。4A)。在这些发现的鼓励下，并考虑到所采用的动物模型的相关性，对原始的264.7个细胞进行了细胞周期分析。结果表明，纯化后的蛋白质在所有使用浓度下均无明显毒性，因为在G区发现了主要的细胞群。o/g1细胞周期的相类似于控制细胞(如图所示)。4B，c)。对CaCO-2细胞株也有类似的观察，其结果在补充资料(补编)中提供.S6)。因此，流式细胞术分析进一步加强了我们以前的观察，并与先前的研究结果相一致，据报道，毒素的所有亚基都是细胞中毒所必需的。29,31,49.

a(1)以不同浓度的CdtB蛋白和牛DNaseⅠ为阳性对照，培养40 min后，DNA在1%琼脂糖凝胶上运行。A(2)DNaseⅠ(阳性对照)在10 min内完全降解DNA。B(I)不同浓度CdtB蛋白孵育4h后，DNA在2%琼脂糖凝胶上运行，DNA片段化。B(2)图谱显示，随着蛋白质浓度的增加，带强度明显降低。数据以平均±SD表示。p值采用单因素方差分析和t检验。*p < 0.05 and ns as non-significant as compared to control (without CdtB). (Full-length gels are presented in Supplementary Fig. S4).

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(a)对RAW 264.7和CaCO-2细胞进行细胞活力测定.两种细胞均未发现明显的代谢抑制。数据以平均±SD表示。p单因素方差分析和t检验，ns值与对照组比较无显着性差异.(b原264.7细胞株的细胞周期分析。不同浓度的纯化蛋白(1，10，100μg/ml)均无明显毒性，细胞周期的Go/G1期细胞主要为Go/G1期，与对照组相似。数据以平均±SD表示。NS与对照组比较无显着性差异。(c)细胞周期分析的代表图，c(I)-对照，(Ii)1μg/ml，(Iii)10μg/ml，(Iv)100μg/ml。

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关于体液反应，已报道了伤寒毒素抗体在恢复期伤寒患者中的显著效价。46,58...为了检测抗体的效价，特别是针对纯化的cdtB蛋白(抗cdtB抗体)，我们用cdtB蛋白和弗氏佐剂同时给小鼠腹腔注射，以实现蛋白质的持续释放，因为它被认为是对多种抗原产生免疫应答的最有效的方法。59...cdtB蛋白的抗体效价在第一次升压后>25000(±7406标准差)，第二次和第三次升压后>100000(±29626标准差)和>225000(±45254标准差)，而对照组(单纯佐剂)则没有明显的效价。cdtB免疫后产生的IgG抗体滴度表明，其在小鼠体内具有较好的免疫原性。5A)。两份血清样品的westernblot分析进一步证实了抗CdtB抗体在血清中的存在(图二)。5B)，从而指示cdtB的血清学活性；从而表明它在一个关注点的开发中的应用。免疫期间和免疫结束后，小鼠保持健康，行为活跃，器官完全无菌，未观察到免疫的不良反应。

(a)每一次助推器17次后测定终点抗体滴度TH, 23TH和30TH日(n=8)。黑点代表每只老鼠，条形代表所有老鼠加SD的平均值。数据以平均±SD表示。p采用单因素方差分析和t检验确定的数值，*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 as compared to adjuvant control. (b两份小鼠血清样品的Westernblot(用1：500稀释)在第二次增强后进行了明显的印迹，表明产生了抗CdtB抗体(完整的图像见附图)。S7).

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在检查完体内对CdtB蛋白的免疫原性进行了免疫研究。为观察CdtB的免疫保护作用，建立了小鼠腹膜炎模型。如S伤寒杆菌在器官内细菌载量低、传播率低的小鼠体内会引起自限感染，因此，正如先前报道的那样，用5%的猪粘蛋白来增加生物体的毒力。33,60,61...在给老鼠的三种不同剂量中，有10种9在感染后24小时内，CFU剂量可使小鼠死亡率达到100%。因此，选择这一剂量，并用于蛋白质的有效性研究，以应对这一挑战剂量。

免疫感染组小鼠存活30天，免疫感染组存活75%，而对照组(未免疫感染组)24小时内全部死亡(如图所示)。6A)。如细菌负荷研究所示，小鼠主动免疫后加上细菌攻击不仅提高了小鼠的存活率，而且导致了细菌负荷的显着降低(如图1所示)。6B)。攻击后20h，检测肝脏和脾脏细菌载量。在肝脏中，对照组(未免疫感染)和免疫感染小鼠分别记录到约9对数和7对数CFU，表明免疫小鼠的对数倍显著减少。同样，细菌计数在7TH受免疫感染的小鼠每天出现近五次对数减少。脾脏也出现了同样的趋势，与对照组相比，免疫感染组的细菌负担明显减少(未免疫感染，如图所示)。6B).

(a免疫感染组小鼠攻击后存活率(n=8)，最长30d。(b)对照组(unimm-inf 20 h)和免疫感染小鼠(Imm Inf 20 H)在攻击后20小时和7小时时的脾脏和肝脏中检测到细菌载量。TH免疫感染日(imm-inf 7)TH显示出明显的日志减少。黑点代表每个鼠标，条形代表平均值加SD。(c)在感染后20小时和7小时测定对照组(未免疫感染)和免疫感染小鼠血清、脾脏和肝脏中的抗炎细胞因子IL-10。TH一天在免疫感染的老鼠身上。(d，e)对照组(未免疫感染)和免疫感染小鼠血清、脾脏和肝脏中TNF-α和IL-6水平在感染后20小时和7小时测定。TH日分别免疫感染小鼠。数据以平均±SD表示。p采用单因素方差分析和t检验确定的数值，*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001 and ns as non-significant as compared to control (unimmunized-infected) mice.

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组织结构研究和细胞因子水平评估(PRO和抗炎)是研究任何治疗或疫苗的感染、炎症和有效性的良好指标。37,62...对照组(未免疫感染组)的脾脏和肝脏组织学表现为攻击后20h出现活动性感染的迹象。在脾脏中，淋巴滤泡增生(数目增加)和体积增大(肥大)随着红髓的减少而减少(4分)，对未被免疫感染的小鼠进行攻击，如图所示。7C与未免疫的未感染小鼠的正常脾脏相比，可以看到明显的滤泡，有清晰的红色和白色的牙髓，0分(图0)。7A)。免疫感染小鼠的脾脏红髓和白髓分别于20h(2分)和7分(7分)。TH感染后的一天(1分)似乎恢复了(如图所示)。7E，g)。在肝脏方面，对照组(未免疫-感染)组与未免疫-未感染小鼠相比，发现门脉三叶炎(0分，图1)。7b)，这意味着炎症，因为两个门脉都有淋巴细胞浸润(图3，图3)。7D)。然而，免疫感染组在感染后20h(评分2分)后，随着门脉的清除，炎症减少(如图所示)。7F)。7岁时被免疫感染的小鼠肝脏TH日显示肝脏结构正常(1分，图1)。7H).

脾脏(40倍)和肝脏(100倍)的组织病理学。(a未免疫-未感染小鼠脾脏结构正常，红髓、白髓和边缘区明显不同，评分为0。(b)未免疫-未感染肝细胞大小正常，门脉正常，呈箭头状，评分为0(Inet400X)。(c)对照组(未免疫感染)小鼠，攻击后20h，淋巴滤泡数增加，红髓消失，大小增大，评分4分。d对照组肝脏(未免疫感染，20h)在门脉附近有淋巴细胞浸润，以箭头表示，评分为3分(Inet400X)。(e免疫感染(攻击后20h)脾脏恢复红白髓，评分2分。f免疫感染的肝脏(20h)在门脉附近的炎症细胞较少(用箭头表示)，组织结构恢复，评分2(INTET 400X)。(g，h免疫感染小鼠脾脏(1分)和肝脏(1分)7分。TH日显示恢复的组织结构。(在补充信息中提供了高质量的图像，如图所示。S8).

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细胞因子在疾病的发展过程中起着重要的作用，在抵抗感染的过程中起着重要的作用。抗炎细胞因子和促炎细胞因子都是决定免疫系统对特定病原生物的保护作用的重要因素。40,63...促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、干扰素-γ等，是免疫细胞分泌的信号分子，促进炎症，在介导天然免疫反应中起重要作用。23,40...肿瘤坏死因子-α作为局部炎症介质，激活B、T细胞产生IL-6.另一方面，抗炎细胞因子(如IL-10)是一系列抑制炎症反应的免疫调节分子。64...免疫感染组血清及组织匀浆(肝、脾)中抗炎细胞因子IL-10水平在感染后20h和7h均有升高。TH挑战后的日子，表示利用免疫细胞对抗病原体。64这与对照组(未免疫感染)组形成对比(图1)。6C)。对照组(未免疫感染组)中促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6水平升高，提示感染的发生可能与肝脏淋巴细胞浸润、脾脏淋巴滤泡数目增加和脏器细菌负荷增加有关；而免疫感染组则显著降低了肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6(20h和7h)的水平。TH表明CdtB作为疫苗的有效性(如图所示)。6d，e)。这些发现与先前的报道是一致的，其中细胞因子产生的Th型细胞反应已经被记录下来，在提供对Th型细胞的抗药性方面起着至关重要的作用。S伤寒杆菌全身性感染41...本研究还表明Th细胞参与刺激B细胞产生抗体，以及影响网状内皮系统中巨噬细胞活化的细胞因子，这些细胞因子有望在清除系统中发挥关键作用。S伤寒杆菌感染。因此，本研究表明，该蛋白能够激发体液免疫反应以及细胞免疫反应。

研究结果表明，成功克隆和纯化的CdtB蛋白具有免疫保护作用，其抗体效价和细胞免疫应答表现出明显的免疫保护作用。蛋白质免疫可使75%的人免受致命剂量的伤害。S伤寒杆菌减少细菌负担，水平的促炎细胞因子和组织结构的恢复。因此，本研究的概念证明可能有助于将其进一步发展为一种预防性选择，而不仅仅是针对S...伤寒人同时也反对S...甲型副伤寒，没有任何商业疫苗可供使用。